Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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Gli autori riconoscono che il supporto per il lavoro nel laboratorio dell'autore è fornito da un HHMI Faculty Scholar Award e fondi di avvio dal Children's Research Institute presso l'UT Southwestern Medical Center.

NOTA: La linea di laboratorio standard Oregon R è stata utilizzata come controllo WT. Tutte le mosche sono state allevate su un mezzo standard di farina di mais-melassa (contenente melassa, agar, lievito, farina di mais, tegosept, acido propionico e acqua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano chiaro / scuro di 12/12 ore.
1. Preparazione per il test
<ol><li>Raccogli le mosche femmine (0-2 giorni, non vergini) in anestesia CO2 e consenti loro di recuperare s...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Un passo critico in questo protocollo è la corretta dissezione dell'intestino per visualizzare il CCR per il fenotipo di acidificazione. L'acido rilasciato dalle cellule di rame è confinato al CCR quando l'intestino è intatto. Tuttavia, durante la dissezione, la perdita causata dalla rottura dell'intestino può portare alla diffusione di acido dal CCR e provocare un intestino erroneamente valutato come negativo per l'acidificazione. Inoltre, il colore giallo indicativo di acidificazione svanisce entro 5-10 minuti dopo...

Nell'intestino degli insetti, le cellule di rame condividono somiglianze cellulari e funzionali con le cellule parietali gastriche produttrici di acido (note anche come ossintiche) dello stomaco dei mammiferi. Questo gruppo di cellule rilascia acido nel lume intestinale. La funzione della secrezione acida e dell'anatomia è conservata evolutivamente. I componenti principali dell'acido scaricato sono l'acido cloridrico e il cloruro di potassio. Il meccanismo chimico di formazione dell'acido nelle cellule dipende dall'anidrasi carbonica. Questo enzima genera uno ione bicarbonato da CO2 e acqua, che libera uno ione idrossile che viene poi scaricato nel lume attraverso una pompa protonica in cambio di potassio. Gli ioni cloruro e potassio vengono trasportati nel lume da canali di conduttanza con conseguente formazione di acido cloridrico e cloruro di potassio, il componente principale del succo gastrico1,2,3,4.
Sebbene i meccanismi di formazione dell'acido siano ben compresi, molto meno si sa sui meccanismi fisiologici che regolano la secrezione acida. L'obiettivo dello sviluppo di questo metodo è quello di aiutare a delineare meglio le vie cellulari che coordinano la formazione e la secrezione di acido e determinare il ruolo dell'acido nel mediare la fisiologia intestinale e l'omeostasi. Il razionale alla base dello sviluppo e dell'uso di questa tecnica è quello di fornire un metodo coerente e affidabile per studiare il processo di acidificazione intestinale nella Drosophila e negli organismi non modello. Sebbene esista attualmente un protocollo standard per determinare l'acidificazione midgut di Drosophila2,5,6, è stata osservata una significativa variabilità nell'entità dell'acidificazione nelle mosche wild-type (WT) durante l'utilizzo di questo protocollo per studiare la funzione delle cellule di rame. Per comprendere le basi di questa variabilità osservata e ottenere risultati coerenti, diversi aspetti del protocollo standard sono stati ottimizzati come descritto di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

Il moscerino della frutta midgut è costituito da più regioni, ognuna delle quali è composta da cellule che svolgono funzioni fisiologiche uniche necessarie per il corretto funzionamento dell'intestino. Una di queste regioni, la regione delle cellule di rame (CCR), è localizzata nel midgut medio e consiste, in parte, di un gruppo di cellule note come cellule di rame. Le cellule di rame sono coinvolte nella secrezione acida gastrica, un processo evolutivamente conservato il cui ruolo preciso è poco compreso. Questo documento descrive i miglioramenti nell'attuale protocollo utilizzato per il test per l'acidificazione dell'intestino adulto di Drosophila melanogaster e dimostra che può essere utilizzato su altre specie di mosche. In particolare, questo documento dimostra che l'acidificazione intestinale dipende dallo stato nutrizionale della mosca e presenta un protocollo basato su questa nuova scoperta. Nel complesso, questo protocollo dimostra la potenziale utilità di studiare le cellule di rame Drosophila per scoprire i principi generali alla base dei meccanismi di acidificazione intestinale.

Abbiamo affamato le mosche femminili dell'Oregon R per più di 20 ore e poi le abbiamo alimentate con cibo integrato con BPB (2%) per ~ 12 ore, come descritto in precedenza7,8,9,10,11. Il blu di bromofenolo (BPB) è un colorante sensibile al pH. Cambia da giallo a pH 3,0 a blu a pH 4,6 e oltre. Dopo la dissezione intestinale, come riportato in precedenza, alcu...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per il monitoraggio dell'acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster con un output ottimale. Per prima cosa usiamo questo protocollo per il monitoraggio dell'acidificazione intestinale in Drosophila melanogaster e poi dimostriamo il suo uso in specie di Drosophila non modello.

Monitoraggio dell'acidificazione intestinale nell'intestino di Drosophila adulta

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Questo è il protocollo più veloce e giusto per monitorare l'acidificazione intestinale di Drosophila con risultati robusti e autentici. Questo metodo aiuterà a determinare il ruolo dell'acidificazione intestinale in più organismi. E questo fenomeno è La semplicità di questa tecnica è il vantaggio principale.Come tale, può essere utilizzato per gli organismi non modello. Questo metodo può monitorare il rilascio di acido per molti sistemi, comprese le linee cellulari e il 3D su colture vive. Questa tecnica è semplice con il minimo sforzo.Il cibo contenente blu di bromofenolo deve essere preparato fresco. Inoltre, mentre l'intestino di dissezione non deve essere allungato. Inizia a organizzare il test di monitoraggio dell'acidificazione intestinale con la preparazione del cibo per mosche con il sensore di pH Bromophenol blue o BPB dye.Per fare ciò, sciogliere il cibo a mosca in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare fino a quando non è tiepido. Aggiungere un millilitro di 4% BPB a un millilitro di cibo tiepido con un po 'di miscelazione. Usando una pipetta, aggiungi il cibo per mosche contenente BPB in un singolo punto di circa 200 microlitri al centro di una capsula di Petri.Quindi, raccogli da zero a due giorni le mosche femmina non vergine Drosophila melanogaster e consenti alle mosche di recuperare sul cibo standard per la farina di mais. Prima dell'esperimento, affamare le mosche per 24 ore a temperatura ambiente in una fiala contenente un tessuto di salviette da laboratorio imbevuto di circa due millilitri di acqua deionizzata. Trasferisci le mosche affamate in una capsula di Petri contenente singoli punti del cibo per mosche appena preparato, integrato con il 2% di BPB, per consentire alle mosche di foraggiare per quattro ore a temperatura ambiente mentre sono esposte alla luce.Dopo quattro ore raccogliere le mosche, quindi procedere a isolare chirurgicamente le viscere delle mosche anestetizzate in 1X PBS con pinza sotto stereomicroscopio. Conta il numero di mosche che mostrano un robusto BPB in piedi nelle viscere e calcola la percentuale usando l'equazione. Dopo la dissezione, montare i campioni in PBS su un vetrino e posizionare il vetrino preparato sotto il microscopio.Quindi regolare la messa a fuoco utilizzando l'IPS. Una volta fatto, spegnere l'IPS per aprire l'otturatore per la fotocamera. Dopo la dissezione intestinale, alcune mosche femmine di Drosophila melanogaster sono state trovate a produrre acido come indicato dal colore giallo nel CCR dell'intestino.Mentre l'intestino di alcune mosche era blu suggerendo un fallimento delle mosche nell'acidificare le loro viscere. Entro 30 minuti, circa il 20% delle mosche aveva acidificato l'intestino. Dopo un'ora, il 40% delle budella intestinali ha mostrato acidificazione, mentre dopo due o tre ore di alimentazione, la percentuale di budella acidificata è aumentata dal 60 al 70%Quasi il 90-95% delle viscere è stato acidificato quando le mosche sono state alimentate per quattro ore.Non è stata osservata alcuna differenza nell'acidificazione intestinale per due diverse condizioni di temperatura. L'efficacia del protocollo di acidificazione intestinale è stata valutata in varie specie di Drosophila. Tutte le specie testate hanno mostrato una robusta acidificazione intestinale, suggerendo che il protocollo può essere applicato ad altri organismi.La cosa più importante da ricordare è posizionare le mosche della stella nella piastra di Petri con lievito e blu bromofenolo per quattro ore. Questa tecnica aiuterà a comprendere la biologia di base e il percorso cellulare coinvolto nell'acidificazione intestinale. Dovrebbe anche aiutare a identificare il bersaglio del farmaco per creare le malattie legate all'acidificazione intestinale.

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