Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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著者らは、著者の研究室での仕事への支援は、HHMI教員奨学生賞とUTサウスウェスタンメディカルセンターの児童研究所からのスタートアップ資金によって提供されていることを認めている。

注:標準的な実験室ラインオレゴンRは、WTコントロールとして使用されました。すべてのハエは、標準的なコーンミール - 糖蜜培地(糖蜜、寒天、酵母、コーンミール、テゴセプト、プロピオン酸、および水を含む)上で、室温で12/12時間の明暗概日リズムで飼育した。
アッセイの準備
<ol><li>CO2麻酔下で雌のハエ(生後0〜2 日、非処女)を収集し、実験前?...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

このプロトコルの重要なステップは、酸性化表現型のCCRを視覚化するための腸の適切な解剖です。銅細胞から放出された酸は、腸が無傷のときにCCRに閉じ込められる。しかし、解剖中、腸の破裂によって引き起こされる漏出は、CCRからの酸の拡散につながり、酸性化のために誤って負とスコア付けされた腸をもたらす可能性がある。さらに、酸性化を示す黄色は解剖後5〜10分以内に退色し、?...

昆虫の腸では、銅細胞は哺乳類の胃の酸産生胃頭頂細胞(オキシンティックとしても知られる)と細胞的および機能的な類似性を共有する。この細胞群は腸管腔に酸を放出する。酸分泌と解剖学の機能は進化的に保存されている。排出される酸の主な成分は塩酸と塩化カリウムです。細胞内の酸形成の化学的メカニズムは、炭酸脱水酵素に依存する。この酵素は、CO2と水から重炭酸イオンを生成し、それがヒドロキシルイオンを遊離させ、カリウムと引き換えにプロトンポンプを介して内腔に排出される。塩化物およびカリウムイオンは、コンダクタンスチャネルによって内腔に輸送され、胃液の主成分である塩酸および塩化カリウムの形成をもたらす1,2,3,4。
酸形成のメカニズムはよく理解されているが、酸分泌を調節する生理学的メカニズムについては、あまり知られていない。この方法を開発する目的は、酸の形成と分泌を調整する細胞経路をよりよく描写し、腸の生理学と恒常性を媒介する酸の役割を決定するのを助けることです。この技術の開発と使用の背後にある理論的根拠は、ショウジョウバエおよび非モデル生物における腸内酸性化のプロセスを研究するための一貫した信頼できる方法を提供することである。ショウジョウバエの中腸酸性化を決定するための標準的なプロトコルが現在存在するが2,5,6、このプロトコルを銅細胞機能の研究に使用しながら、野生型(WT)ハエにおける酸性化の程度に有意な変動性が観察された。この観察された変動性の基礎を理解し、一貫した結果を得るために、標準プロトコルのいくつかの側面が以下に説明するように最適化されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

ショウジョウバエの中腸は複数の領域からなり、それぞれが腸の適切な機能に必要なユニークな生理学的機能を実行する細胞で構成されています。そのような領域の1つである銅細胞領域(CCR)は、中腸中部に局在し、部分的には銅細胞として知られる細胞群からなる。銅細胞は胃酸分泌に関与しており、進化的に保存されたプロセスであり、その正確な役割はほとんど理解されていない。この論文は、成体の ショウジョウバエのメラノガスター 腸の酸性化をアッセイするために使用される現在のプロトコルの改善を説明し、それが他の種のハエに使用できることを実証する。特に、この論文は、腸内酸性化がハエの栄養状態に依存していることを実証し、この新しい知見に基づくプロトコルを提示する。全体として、このプロトコルは、腸内酸性化のメカニズムの根底にある一般原則を明らかにするために ショウジョウバエ の銅細胞を研究することの潜在的な有用性を示しています。

オレゴンRの雌のハエを20時間以上飢えさせ、BPB(2%)を補給した食物を約12時間食べさせた7,8,9,10,11。ブロモフェノールブルー(BPB)はpH検出色素です。pH 3.0 の黄色から pH 4.6 以上の青色に変わります。腸郭清後、以前に報告したように、いくつかのハエは腸のCCRにおいて黄色?...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

ここでは、ショウ ジョウバエのメラノガスターの 腸内酸性化を最適な出力でモニタリングするための標準化されたプロトコルを提示する。我々はまず、ショウジョウバエ のメラノガスター における腸内酸性化モニタリングにこのプロトコルを使用し、次に非モデル ショウジョウバエ 種におけるその使用を実証する。

成体 ショウジョウバエ 腸における腸酸性化のモニタリング

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

これは、ショウジョウバエの腸内酸性化を堅牢で本物の結果で監視するための最速かつ適切なプロトコルです。この方法は、複数の生物における腸内酸性化の役割を決定するのに役立ちます。そしてこの現象は この技術の単純さが主な利点です。そのようにして、非モデル生物に対して利用することができる。この方法は、生培養上の細胞株および3Dを含む多くの系の酸放出をモニターすることができる。この手法は、最小限の労力でシンプルです。ブロモフェノールブルーを含む食品は新鮮に調製する必要があります。さらに、解剖中は腸を伸ばすべきではありません。pH感知ブロモフェノールブルーまたはBPB色素を用いたハエの食物の調製を伴う腸内酸性化モニタリングアッセイのための配置を開始する。これを行うには、フライフードを電子レンジで溶かし、ぬるま湯になるまで冷まします。1ミリリットルのぬるま湯に4%BPBを1ミリリットル加えます。ピペットを使用して、BPBを含むフライ食品をシャーレの中央にある約200マイクロリットルの単一ドットに加える。次に、生後0〜2日齢の非処女のショウジョウバエメラノガスターハエを収集し、ハエが標準的なコーンミール食品で回復できるようにします。実験の前に、約2ミリリットルの脱イオン水で浸した実験室用ワイプ組織を含むバイアル中で、ハエを室温で24時間飢えさせた。飢えたハエを、2%BPBを補充した作りたてのハエ食品の単一ドットを含むシャーレに移し、ハエが光にさらされながら室温で4時間餌を採餌できるようにする。4時間後、ハエを採取し、その後、実体顕微鏡下で鉗子を用いて麻酔をかけられたハエの腸を1X PBSで外科的に単離する。腸内に立っている堅牢なBPBを示すハエの数を数え、式を使用してパーセンテージを計算します。解剖後、PBS中のサンプルをスライドガラスにマウントし、調製したスライドを顕微鏡下に置きます。次に、IPSを使用してフォーカスを調整します。完了したら、IPSをシャットオフしてカメラのシャッターを開きます。腸郭清に続いて、ショウジョウバエのメラノガスター雌ハエの一部が、腸のCCRにおける黄色によって示されるように酸を生成することが見出された。いくつかのハエの腸は青かったが、ハエが腸を酸性化できないことを示唆している。30分以内に、ハエの約20%が腸を酸性化しました。1時間後、腸内腸の40%が酸性化を示し、2〜3時間の摂食後、酸性化された腸の割合は60〜70%に増加したハエを4時間給餌すると、腸のほぼ90〜95%が酸性化した。腸内酸性化に差は認められず、2つの異なる温度条件について観察されなかった。腸内酸性化プロトコールの効率を、様々なショウジョウバエ種において評価した。試験されたすべての種は、堅牢な腸内酸性化を示し、プロトコルが他の生物にも適用可能であることを示唆している。覚えておくべき最も重要なことは、スターハエを酵母とブロモフェノールブルーでペトリプレートに4時間置くことです。この技術は、腸内酸性化に関与する基本的な生物学および細胞経路を理解するのに役立つであろう。また、腸内酸性化に関連する疾患を引き起こす薬物標的を特定するのにも役立つはずです。

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モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;視細胞

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

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Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

成体 ショウジョウバエ 腸における腸酸性化のモニタリング

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