Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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저자는 저자의 실험실에서 작업에 대한 지원이 UT 사우스 웨스턴 의료 센터에서 아동 연구소의 HHMI 교수 학자 상과 시작 기금에 의해 제공된다는 것을 인정합니다.

참고: 표준 실험실 라인 오리건 R은 WT 제어로 사용되었습니다. 모든 파리는 12/12h 빛/다크 서카디아 리듬이 있는 실온에서 표준 옥수수밀 당밀 매체(당밀, 한천, 효모, 옥수수밀, 테고프, 프로피오닉산 및 물을 함유)로 사육했습니다.
1. 분석 준비
<ol><li>CO2 마취하에 암컷 파리(0-2일, 비처녀)를 수집하고 실험 전에 최소 3일 동안 표준 옥수수가루 식품에서 회...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

이 프로토콜의 중요한 단계는 산성화 표현형에 대한 CCR을 시각화하는 장의 적절한 해부입니다. 구리 세포에서 방출되는 산은 창자가 손상되지 않은 경우 CCR에 국한됩니다. 그러나, 해부 도중, 장의 파열에 기인한 누설은 CCR에서 산의 확산으로 이끌어 내고 산성화를 위한 부정적으로 실수로 득점된 창자 귀착될 수 있습니다. 또한, 산성화를 나타내는 황색은 절제 후 5-10분 이내에 퇴색하며, 격리 직...

곤충 창자에서 구리 세포는 포유류 위장의 산 생성 위 정수리 세포 (옥시안틱이라고도 함)와 세포 및 기능적 유사성을 공유합니다. 세포의이 그룹은 장 루멘으로 산을 방출한다. 산 분 비 및 해부학의 기능은 진화적으로 보존됩니다. 배출된 산의 주요 성분은 염산염산과 염화칼륨입니다. 세포에서 산 형성의 화학 메커니즘은 탄산 수화물에 따라 달라집니다. 이 효소는 CO2와 물에서 중탄산염 이온을 생성하여 칼륨을 대가로 양성자 펌프를 통해 루멘으로 배출되는 하이드록실 이온을 해방시합니다. 염화물 및 칼륨 이온은 위 주스의 주요 성분인 염산 및 염화칼륨의 형성을 초래하는 전도성 채널에 의해 루멘으로 운반된다1,2,3,4.
산 형성의 메커니즘은 잘 이해되지만, 산 분비를 조절하는 생리적 메커니즘에 대해서는 훨씬 적습니다. 이 방법을 개발하는 목표는 산 형성과 분비를 조정하고 장 생리학 및 항상성을 중재하는 산의 역할을 결정하는 세포 경로를 더 잘 묘사하는 것입니다. 이 기술의 개발 및 사용 의 근거는 Drosophila 및 비 모델 유기체에서 창자 산성화 과정을 연구하는 일관되고 신뢰할 수있는 방법을 제공하는 것입니다. Drosophila midgut 산성화를 결정하기 위한 표준 프로토콜은 현재 존재하지만2,5,6, 구리 세포 기능을 연구하기 위한 이 프로토콜을 사용하는 동안 야생형(WT)에서 산성화의 범위에서 상당한 가변성이 관찰되었다. 이러한 관찰된 가변성에 대한 기초를 이해하고 일관된 결과를 얻기 위해 표준 프로토콜의 여러 측면이 아래에 설명된 대로 최적화되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

과일 플라이 미드구트는 여러 영역으로 구성되어 있으며, 각 영역은 장의 적절한 기능에 필요한 독특한 생리적 기능을 수행하는 세포로 구성됩니다. 이러한 영역 중 하나, 구리 세포 영역(CCR)은 중간 중간구에 국한되고, 부분적으로, 구리 세포로 알려진 세포의 그룹의 구성이다. 구리 세포는 위산 분비, 정확한 역할이 제대로 이해되지 않은 진화적으로 보존된 과정에 관여합니다. 이 논문은 성인 Drosophila 멜라노가스터 장의 산성화를 위해 분석하는 데 사용되는 현재 프로토콜의 개선을 설명하고 파리의 다른 종에 사용할 수 있음을 보여줍니다. 특히, 이 논문은 장내 산성화가 플라이의 영양 상태에 달려 있음을 보여주고 이 새로운 발견에 기초한 프로토콜을 제시한다. 전반적으로, 이 프로토콜은 창자 산성화의 기계장치의 근본적인 일반적인 원리를 밝히기 위하여 Drosophila 구리 세포를 공부의 잠재적인 유용성을 보여줍니다.

우리는 오리건 R 여성 파리를 20 시간 이상 굶주린 다음 이전에 설명 한 대로 ~ 12 h의 BPB (2 %)로 보충 된 음식을 먹였습니다7,8,9,10,11. 브로모페놀 블루(BPB)는 pH 감지 염료입니다. pH 3.0에서 파란색으로 pH 4.6 이상으로 변경됩니다. 이전에 보고된 바와 같이, 일부 파리는 창자의 CCR...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

여기에서, 우리는 최적의 출력 으로 Drosophila 멜라노가스터 에서 창자 산성화를 감시하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 먼저 Drosophila 멜라노가스터 에서 장 산성화 모니터링을 위해이 프로토콜을 사용한 다음 비 모델 드로소필라 종에서 의 사용을 입증합니다.

성인 Drosophila 창자에 있는 창자 산성화를 감시합니다

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

이것은 견고하고 본격적인 결과로 Drosophila 창자 산성화를 모니터링하는 가장 빠르고 올바른 프로토콜입니다. 이 방법은 다중 유기체에서 창 자 산 성화의 역할을 결정 하는 데 도움이 됩니다. 그리고이 현상은이 기술의 단순함이 주요 장점입니다.따라서, 비모델 유기체에 활용될 수 있다. 이 방법은 살아있는 배양에 세포주 및 3D를 포함하는 많은 시스템에 대한 산 방출을 모니터링할 수 있다. 이 기술은 최소한의 노력으로 간단합니다.브로모페놀 블루가 함유된 음식은 신선하게 준비해야 합니다. 또한, 해부 장 스트레칭 해서는 안 됩니다. pH 감지 브로모페놀 블루 또는 BPB 염료와 플라이 푸드의 준비와 함께 창자 산성화 모니터링 분석에 대한 배열을 시작합니다.이렇게하려면 전자 레인지에 플라이 푸드를 녹여 미지근할 때까지 식힙니다. 미지근한 음식의 1 밀리리터에 4%BPB의 1밀리리터를 잘 섞어 넣습니다. 파이펫을 사용하여 BPB가 함유된 플라이 푸드를 페트리 접시 중앙에 약 200 마이크로리터의 단일 점에 추가합니다.다음으로, 0에서 이틀 에 비 처녀 여성 Drosophila 멜라노가스터 파리를 수집하고, 파리가 표준 옥수수 식사 음식에 복구 할 수 있도록. 실험 전에, 실온에서 24 시간 동안 파리를 굶어 바닷가에 실온에서 약 2 밀리리터의 탈온화 된 물로 담근 실험실 닦아 조직을 포함하는 유리병에. 굶주림을 가진 파리를 2%BPB로 보충한 갓 준비된 플라이 푸드의 단일 점이 들어 있는 페트리 접시에 파리를 옮기면 파리가 실온에서 4시간 동안 사료를 먹을 수 있도록 합니다.4 시간 후 파리를 수집 한 다음 스테레오 현미경으로 집게로 1X PBS에서 마취 된 파리의 내장을 외과적으로 분리합니다. 용기에 견고한 BPB가 서 있는 것을 보여주는 플라이 수를 계산하고 방정식을 사용하여 백분율을 계산합니다. 해부 후 PBS의 샘플을 유리 슬라이드에 장착하고 준비된 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다.그런 다음 IPS를 사용하여 포커스를 조정합니다. 완료되면 IPS를 차단하여 카메라의 셔터를 엽니다. 창 자 해 부 다음, 일부 Drosophila 멜 라 노 가 스터 여성 파리 창 자의 CCR에 노란색 색에 의해 표시 된 산을 생산 하는 것으로 나타났습니다.일부 파리의 창자는 파장이 내장을 산성화하지 못했다는 것을 암시하는 파란색이었습니다. 30분 이내에 파리의 약 20%가 용기를 산성화했습니다. 한 시간 후, 장내 40%는 산성화를 보였고, 2~3시간 동안 산성화된 내장의 비율은 60~70%로 증가하여 4시간 동안 파리를 먹일 때 장의 90~95%가 산성화되었다.두 개의 다른 온도 조건에 대 한 창 자 산성화에 차이가 관찰 되었다. 장산성화 프로토콜의 효율은 다양한 드로소필라 종에서 평가되었다. 모든 시험된 종은 강력한 창자 산성화를 보여주었으며, 프로토콜이 다른 유기체에 적용될 수 있음을 시사했습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은, 별이 효모와 브로모페놀 블루를 4시간 동안 페트리 플레이트에 넣는 것입니다. 이 기술은 창 자 산 성화에 관련 된 기본 생물학 및 세포 통로 이해 하는 데 도움이 됩니다. 그것은 또한 창 자 산 성 화와 관련 된 질병을 만들 약물 목표를 식별 하는 데 도움이 해야 합니다.

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