Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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Os autores reconhecem que o apoio ao trabalho no laboratório do autor é fornecido por um Prêmio HHMI Faculty Scholar e fundos de startup do Instituto de Pesquisa Infantil do UT Southwestern Medical Center.

NOTA: A linha de laboratório padrão Oregon R foi usada como controle WT. Todas as moscas foram criadas em meio padrão de fubá-melaço (contendo melaço, ágar, levedura, farinha de milho, tegosept, ácido propiônico e água) em temperatura ambiente com 12/12 h de ritmo circadiano claro/escuro.
1. Preparando-se para o ensaio
<ol><li>Coletar moscas fêmeas (0-2 dias de idade, não virgem) sob anestesia de CO2 e permitir que elas se recuperem em alimentos padrã...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Um passo crítico neste protocolo é a dissecação adequada do intestino para visualizar a CCR para o fenótipo de acidificação. O ácido liberado das células de cobre está confinado à CCR quando o intestino está intacto. No entanto, durante a dissecção, o vazamento causado pela ruptura do intestino pode levar à difusão de ácido da CCR e resultar em um intestino erroneamente marcado como negativo para acidificação. Além disso, a cor amarela indicativa de acidificação desaparece dentro de 5-10 minutos ap?...

No intestino do inseto, as células de cobre compartilham semelhanças celulares e funcionais com as células parietal gástricas produtoras de ácido (também conhecidas como oxíntica) do estômago mamífero. Este grupo de células libera ácido no lúmen intestinal. A função da secreção ácida e da anatomia é evolutivamente conservada. Os principais componentes do ácido descarregado são o ácido clorídrico e o cloreto de potássio. O mecanismo químico da formação de ácido nas células depende da anidrádrase carbônica. Esta enzima gera um íon bicarbonato de CO2 e água, que libera um íon hidroxyl que é então descarregado no lúmen através de uma bomba de prótons em troca de potássio. Os íons de cloreto e potássio são transportados para o lúmen por canais de condutância que resultam na formação de ácido clorídrico e cloreto de potássio, principal componente do suco gástrico1,2,3,4.
Embora os mecanismos de formação de ácido sejam bem compreendidos, muito menos se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que regulam a secreção ácida. O objetivo do desenvolvimento deste método é ajudar a delinear melhor as vias celulares que coordenam a formação e secreção de ácidos e determinar o papel do ácido na mediação da fisiologia intestinal e da homeostase. A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é fornecer um método consistente e confiável para estudar o processo de acidificação intestinal em Drosophila e organismos não-modelo. Embora exista atualmente um protocolo padrão para determinar a acidificação de drosophila midgut, atualmente existe 2,5,6, observou-se variabilidade significativa na extensão da acidificação em moscas do tipo selvagem (TG) ao usar este protocolo para estudar a função celular de cobre. Para compreender a base dessa variabilidade observada e obter resultados consistentes, vários aspectos do protocolo padrão foram otimizados conforme descrito abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

O midgut mosca-das-frutas consiste em múltiplas regiões, cada uma das quais é composta de células que realizam funções fisiológicas únicas necessárias para o bom funcionamento do intestino. Uma dessas regiões, a região da célula de cobre (CCR), é localizada até o meio médio e consiste, em parte, de um grupo de células conhecidas como células de cobre. As células de cobre estão envolvidas na secreção do ácido gástrico, um processo evolutivamente conservado cujo papel preciso é mal compreendido. Este artigo descreve melhorias no protocolo atual usado para avaliar a acidificação do intestino melanogaster drosophila adulto e demonstra que pode ser usado em outras espécies de moscas. Em particular, este artigo demonstra que a acidificação intestinal depende do estado nutricional da mosca e apresenta um protocolo baseado neste novo achado. No geral, este protocolo demonstra a utilidade potencial de estudar células de cobre de Drosophila para descobrir princípios gerais subjacentes aos mecanismos de acidificação intestinal.

Passamos fome de moscas do Oregon R por mais de 20 h e depois alimentamos-as com BPB (2%) por ~12 h, como descrito anteriormente7,8,9,10,11. Bromophenol blue (BPB) é um corante de pH. Ele muda de amarelo em pH 3.0 para azul em pH 4.6 ou superior. Após dissecção intestinal, como relatado anteriormente, algumas moscas foram encontradas para produzir ácido c...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster com ótima saída. Primeiro usamos este protocolo para monitoramento da acidificação intestinal em Drosophila melanogaster e, em seguida, demonstramos seu uso em espécies não-modelo de Drosophila .

Monitoramento da acidificação intestinal no intestino de Drosophila adulto

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Este é o protocolo mais rápido e certo para monitorar a acidificação intestinal de Drosophila com resultados robustos e autênticos. Este método ajudará a determinar o papel da acidificação intestinal em múltiplos organismos. E esse fenômeno é a simplicidade dessa técnica é a principal vantagem.Como tal, pode ser utilizado para organismos não-modelo. Este método pode monitorar a liberação de ácido para muitos sistemas, incluindo as linhas celulares e 3D em culturas ao vivo. Esta técnica é simples com o mínimo de esforço.Os alimentos que contenham azul bromofenol devem ser preparados frescos. Além disso, enquanto o intestino de dissecção não deve ser esticado. Comece a organizar o ensaio de monitoramento da acidificação intestinal com a preparação do alimento de mosca com pH sensoriando azul bromofenol ou corante BPB.Para isso, derreta a comida de mosca em um micro-ondas e deixe esfriar até ficar morno. Adicione um mililitro de 4%BPB a um mililitro da comida morna com um poço de mistura. Usando uma pipeta, adicione o alimento de mosca contendo BPB em um único ponto de aproximadamente 200 microliters no centro de uma placa de petri.Em seguida, colete moscas drosophila melanogaster não virgem de zero a dois dias de idade, e permita que as moscas se recuperem em alimentos padrão de farinha de milho. Antes do experimento, passe a fome as moscas por 24 horas à temperatura ambiente em um frasco contendo um tecido limpo de laboratório encharcado com aproximadamente dois mililitros de água deionizada. Transfira moscas famintas em uma placa de petri contendo pontos únicos dos alimentos de mosca recém-preparados, complementados com 2%de BPB, para permitir que as moscas forrageiam por quatro horas à temperatura ambiente enquanto expostas à luz.Depois de quatro horas coletar as moscas, em seguida, proceder a isolar cirurgicamente as entranhas das moscas anestesiadas em 1X PBS com fórceps sob um microscópio estéreo. Conte o número de moscas que mostram BPB robusto em pé nas entranhas, e calcule a porcentagem usando a equação. Após a dissecação, monte as amostras em PBS em um slide de vidro e coloque o slide preparado sob o microscópio.Em seguida, ajuste o foco usando o IPS. Uma vez feito, desligue o IPS para abrir o obturador para a câmera. Após dissecção intestinal, algumas moscas fêmeas de drosophila melanogaster foram encontradas para produzir ácido, como indicado pela cor amarela na CCR do intestino.Enquanto os intestinos de algumas moscas eram azuis sugerindo uma falha das moscas para acidificar suas entranhas. Em 30 minutos, aproximadamente 20% das moscas acidificaram o intestino. Após uma hora, 40% das tripas intestinais apresentaram acidificação, enquanto após duas a três horas de alimentação, a porcentagem de tripas acidificadas aumentou para 60 a 70%Quase 90 a 95% das entranhas foram acidificadas quando moscas foram alimentadas por quatro horas.Não foi observada diferença na acidificação intestinal para duas condições de temperatura diferentes. A eficiência do protocolo de acidificação intestinal foi avaliada em várias espécies de Drosophila. Todas as espécies testadas apresentaram acidificação intestinal robusta, sugerindo que o protocolo pode ser aplicado a outros organismos.A coisa mais importante a se lembrar é colocar a estrela voa na placa de petri com levedura e azul Bromophenol por quatro horas. Essa técnica ajudará a entender a biologia básica e o caminho celular envolvidos na acidificação intestinal. Também deve ajudar a identificar o alvo da droga para criar as doenças relacionadas à acidificação intestinal.

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