Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
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Los autores reconocen que el apoyo para el trabajo en el laboratorio del autor es proporcionado por un Premio Académico de la Facultad de HHMI y fondos de inicio del Instituto de Investigación Infantil en UT Southwestern Medical Center.

NOTA: La línea de laboratorio estándar Oregon R se utilizó como control WT. Todas las moscas se criaron en medio estándar de harina de maíz-melaza (que contiene melaza, agar, levadura, harina de maíz, tegosept, ácido propiónico y agua) a temperatura ambiente con ritmo circadiano claro / oscuro de 12/12 h.
1. Preparación para el ensayo
<ol><li>Recolecte moscas hembras (0-2 días de edad, no vírgenes) bajo anestesia de CO2 y permita que se recuperen con al...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Un paso crítico en este protocolo es la disección adecuada del intestino para visualizar el CCR para el fenotipo de acidificación. El ácido liberado de las células de cobre se limita al CCR cuando el intestino está intacto. Sin embargo, durante la disección, la fuga causada por la ruptura del intestino puede conducir a la difusión de ácido del CCR y dar lugar a un intestino erróneamente calificado como negativo para la acidificación. Además, el color amarillo indicativo de acidificación se desvanece dentro d...

En el intestino del insecto, las células de cobre comparten similitudes celulares y funcionales con las células parietales gástricas productoras de ácido (también conocidas como oxínticas) del estómago de los mamíferos. Este grupo de células libera ácido en la luz intestinal. La función de la secreción ácida y la anatomía se conserva evolutivamente. Los componentes principales del ácido descargado son el ácido clorhídrico y el cloruro de potasio. El mecanismo químico de la formación de ácido en las células depende de la anhidrasa carbónica. Esta enzima genera un ion bicarbonato a partir de CO2 y agua, que libera un ion hidroxilo que luego se descarga en la luz a través de una bomba de protones a cambio de potasio. Los iones cloruro y potasio son transportados a la luz por canales de conductancia que resultan en la formación de ácido clorhídrico y cloruro de potasio, el componente principal del jugo gástrico1,2,3,4.
Aunque los mecanismos de formación de ácido son bien conocidos, se sabe mucho menos sobre los mecanismos fisiológicos que regulan la secreción de ácido. El objetivo de desarrollar este método es ayudar a delinear mejor las vías celulares que coordinan la formación y secreción de ácido y determinar el papel del ácido en la mediación de la fisiología intestinal y la homeostasis. La razón detrás del desarrollo y uso de esta técnica es proporcionar un método consistente y confiable para estudiar el proceso de acidificación intestinal en Drosophila y organismos no modelo. Aunque actualmente existe un protocolo estándar para determinar la acidificación del intestino medio de Drosophila2,5,6, se observó una variabilidad significativa en el grado de acidificación en moscas de tipo salvaje (WT) mientras se utilizaba este protocolo para estudiar la función de las células de cobre. Para comprender la base de esta variabilidad observada y obtener resultados consistentes, se optimizaron varios aspectos del protocolo estándar como se describe a continuación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

El intestino medio de la mosca de la fruta consta de múltiples regiones, cada una de las cuales está compuesta por células que llevan a cabo funciones fisiológicas únicas requeridas para el correcto funcionamiento del intestino. Una de estas regiones, la región de células de cobre (CCR), se localiza en el intestino medio y consiste, en parte, en un grupo de células conocidas como células de cobre. Las células de cobre están involucradas en la secreción de ácido gástrico, un proceso evolutivamente conservado cuyo papel preciso es poco conocido. Este artículo describe las mejoras en el protocolo actual utilizado para el ensayo de la acidificación del intestino adulto de Drosophila melanogaster y demuestra que se puede utilizar en otras especies de moscas. En particular, este trabajo demuestra que la acidificación intestinal depende del estado nutricional de la mosca y presenta un protocolo basado en este nuevo hallazgo. En general, este protocolo demuestra la utilidad potencial del estudio de las células de cobre de Drosophila para descubrir los principios generales que subyacen a los mecanismos de acidificación intestinal.

Matamos de hambre a las moscas hembra de Oregon R durante más de 20 h y luego las alimentamos con alimentos suplementados con BPB (2%) durante ~ 12 h, como se describió anteriormente7,8,9,10,11. El azul de bromofenol (BPB) es un colorante sensible al pH. Cambia de amarillo a pH 3.0 a azul a pH 4.6 y superior. Después de la disección intestinal, como se inf...

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Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Aquí, presentamos un protocolo estandarizado para monitorear la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster con un rendimiento óptimo. Primero usamos este protocolo para el monitoreo de la acidificación intestinal en Drosophila melanogaster y luego demostramos su uso en especies de Drosophila no modelo.

Monitoreo de la acidificación intestinal en el intestino adulto de Drosophila

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Este es el protocolo más rápido y correcto para monitorear la acidificación intestinal de Drosophila con resultados robustos y auténticos. Este método ayudará a determinar el papel de la acidificación intestinal en múltiples organismos. Y este fenómeno es La simplicidad de esta técnica es la principal ventaja.Como tal, se puede utilizar para los organismos no modelo. Este método puede monitorear la liberación de ácido para muchos sistemas, incluidas las líneas celulares y 3D en cultivos vivos. Esta técnica es simple con el mínimo esfuerzo.Los alimentos que contienen azul de bromofenol deben prepararse frescos. Además, mientras que la disección intestinal no debe estirarse. Comience a organizar el ensayo de monitoreo de acidificación intestinal con la preparación del alimento para moscas con azul de bromofenol sensible al pH o colorante BPB.Para hacerlo, derrite la comida para moscas en un microondas y deja que se enfríe hasta que esté tibia. Agregue un mililitro de 4% BPB a un mililitro del alimento tibio con un pozo de mezcla. Usando una pipeta, agregue el alimento para moscas que contiene BPB en un solo punto de aproximadamente 200 microlitros en el centro de una placa de Petri.A continuación, recoja moscas hembras no vírgenes de cero a dos días de edad Drosophila melanogaster, y permita que las moscas se recuperen con alimentos estándar de harina de maíz. Antes del experimento, muera de hambre a las moscas durante 24 horas a temperatura ambiente en un vial que contiene un pañuelo de laboratorio empapado con aproximadamente dos mililitros de agua desionizada. Transfiera las moscas hambrientas a una placa de Petri que contenga puntos individuales de la comida para moscas recién preparada, complementada con 2% BPB, para permitir que las moscas se alimenten durante cuatro horas a temperatura ambiente mientras están expuestas a la luz.Después de cuatro horas recolectar las moscas, luego proceder a aislar quirúrgicamente los intestinos de las moscas anestesiadas en 1X PBS con fórceps bajo un microscopio estereoscópico. Cuente el número de moscas que muestran BPB robusto de pie en las tripas y calcule el porcentaje utilizando la ecuación. Después de la disección, monte las muestras en PBS en un portaobjetos de vidrio y coloque la diapositiva preparada bajo el microscopio.Luego ajuste el enfoque usando el IPS. Una vez hecho esto, apague el IPS para abrir el obturador de la cámara. Después de la disección intestinal, se encontró que algunas moscas hembra de Drosophila melanogaster producen ácido como lo indica el color amarillo en el CCR del intestino.Mientras que los intestinos de algunas moscas eran azules, lo que sugiere un fracaso de las moscas para acidificar sus intestinos. En 30 minutos, aproximadamente el 20% de las moscas habían acidificado el intestino. Después de una hora, el 40% de los intestinos intestinales mostraron acidificación, mientras que después de dos o tres horas de alimentación, el porcentaje de intestinos acidificados aumentó a 60 a 70%Casi del 90 al 95% de los intestinos se acidificaron cuando las moscas fueron alimentadas durante cuatro horas.No se observaron diferencias en la acidificación intestinal para dos condiciones de temperatura diferentes. La eficiencia del protocolo de acidificación intestinal se evaluó en varias especies de Drosophila. Todas las especies probadas mostraron una acidificación intestinal robusta, lo que sugiere que el protocolo se puede aplicar a otros organismos.Lo más importante a recordar, es colocar las moscas estrella en la placa de Petri con levadura y azul de bromofenol durante cuatro horas. Esta técnica ayudará a comprender la biología básica y la vía celular involucrada en la acidificación intestinal. También debería ayudar a identificar el objetivo del medicamento para crear las enfermedades relacionadas con la acidificación intestinal.

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