Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Författarna erkänner att stöd för arbete i författarens laboratorium tillhandahålls av en HHMI Faculty Scholar Award och startfonder från Children's Research Institute vid UT Southwestern Medical Center.

OBS: Standardlaboratoriumlinjen Oregon R användes som en WT-kontroll. Alla flugor uppfödds på standard majsmjöl-melass medium (innehållande melass, agar, jäst, majsmjöl, tegosept, propionsyra och vatten) vid rumstemperatur med 12/12 h ljus /mörk dygnsrytm.
1. Förberedelser för analysen
<ol><li>Samla kvinnliga flugor (0-2 dagar gamla, icke-jungfruliga) under CO2-anestesi och låt dem återhämta sig på standard majsmjölsmat i minst 3 dagar före experim...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Ett kritiskt steg i detta protokoll är korrekt dissekering av tarmen för att visualisera CCR för försurning fenotyp. Syran som frigörs från kopparcellerna begränsas till CCR när tarmen är intakt. Under dissekering kan läckage som orsakas av bristning i tarmarna leda till diffusion av syra från CCR och resultera i en tarm som felaktigt poängsatts som en negativ försurning. Dessutom bleknar den gula färgen som indikerar försurning inom 5-10 min efter dissekering, vilket understryker vikten av att poängsätt...

I insektsmagen delar kopparceller cellulära och funktionella likheter med de syraproducerande magparietala cellerna (även känd som oxyntic) i däggdjursmagen. Denna grupp av celler släpper ut syra i tarmlumen. Funktionen av syrautsöndring och anatomi bevaras evolutionärt. De viktigaste komponenterna i den urladdade syran är saltsyra och kaliumklorid. Den kemiska mekanismen för syrabildning i cellerna beror på kolsyrahydras. Detta enzym genererar en bikarbonatjon från CO2 och vatten, som frigör en kolxyljon som sedan släpps ut i lumen genom en protonpump i utbyte mot kalium. Klorid och kaliumjoner transporteras in i lumen genom ledningskanaler som resulterar i bildandet av saltsyra och kaliumklorid, huvudkomponenten i magsaft1,2,3,4.
Även om mekanismerna för syrabildning är väl förstådda, är mycket mindre känt om de fysiologiska mekanismerna som reglerar sur utsöndring. Målet med att utveckla denna metod är att hjälpa till att bättre avgränsa de cellulära vägarna som samordnar syrabildning och utsöndring och bestämma syrans roll för att medla tarmfysiologi och homeostas. Grunden bakom utvecklingen och användningen av denna teknik är att tillhandahålla en konsekvent och pålitlig metod för att studera processen för tarmförsurning i Drosophila och icke-modellorganismer. Även om det för närvarande finns ett standardprotokoll för bestämning av Drosophila midgut-försurning2,5,6, observerades signifikant variabilitet i omfattningen av försurning i vilda (WT) flugor när man använde detta protokoll för att studera kopparcellsfunktionen. För att förstå grunden för denna observerade variabilitet och få konsekventa resultat optimerades flera aspekter av standardprotokollet enligt beskrivningen nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

Fruktflugan midgut består av flera regioner, som var och en består av celler som utför unika fysiologiska funktioner som krävs för att tarmen ska fungera korrekt. En sådan region, kopparcellsområdet (CCR), är lokaliserad till mitten av mitten av geväret och består delvis av en grupp celler som kallas kopparceller. Kopparceller är involverade i magsyrautsöndring, en evolutionärt bevarad process vars exakta roll är dåligt förstådd. Detta dokument beskriver förbättringar i det nuvarande protokollet som används för att analysera försurning av den vuxna Drosophila melanogaster gut och visar att det kan användas på andra arter av flugor. I synnerhet visar detta dokument att tarmförsurning är beroende av flugans näringsstatus och presenterar ett protokoll baserat på detta nya fynd. Sammantaget visar detta protokoll den potentiella nyttan av att studera Drosophila kopparceller för att avslöja allmänna principer som ligger till grund för mekanismerna för gut försurning.

Vi svalt Oregon R kvinnliga flugor i mer än 20 h och sedan mata dem med mat kompletterad med BPB (2%) för ~ 12 h, som beskrivits tidigare7,8,9,10,11. Bromofenolblå (BPB) är ett pH-avkännande färgämne. Den ändras från gult vid pH 3,0 till blått vid pH 4,6 och högre. Efter tarmdisekering, som tidigare rapporterats, visade sig vissa flugor producera sy...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för övervakning av gut försurning i Drosophila melanogaster med optimal utgång. Vi använder först detta protokoll för tarmförsurning övervakning i Drosophila melanogaster och sedan visa dess användning i icke-modell Drosophila arter.

Övervakning av tarmförsurning i den vuxna Drosophila Intestine

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Detta är det snabbaste och rätta protokollet för att övervaka Drosophila gut försurning med robusta och autentiska resultat. Denna metod hjälper till att bestämma tarmförsurningens roll i flera organismer. Och detta fenomen är Enkelheten i denna teknik är den största fördelen.Som sådan kan den användas för icke-modellorganismer. Denna metod kan övervaka syrautsläppet för många system, inklusive cellinjerna och 3D på levande kulturer. Denna teknik är enkel med minimal ansträngning.Mat som innehåller Bromofenolblå bör beredas färsk. Dessutom bör dissekeringsmagen inte sträckas. Börja ordna för övervakningsanalysen för tarmförsurning med beredning av flugmat med pH-avkänning Bromofenolblått eller BPB-färgämne.För att göra det, smält flugmaten i en mikrovågsugn och låt den svalna tills den är ljummen. Tillsätt en milliliter på 4% BPB till en milliliter av den ljumma maten med en blandningsbrunn. Tillsätt flugmat som innehåller BPB i en enda prick på cirka 200 mikroliter i mitten av en petriskål.Samla sedan noll till två dagar gamla icke-jungfruliga kvinnliga Drosophila melanogasterflugor och låt flugorna återhämta sig på vanlig majsmjölmat. Före experimentet svälter flugorna i 24 timmar vid rumstemperatur i en flaska som innehåller en laboratorietorka vävnad som blötläggs med cirka två milliliter av avjoniserat vatten. Överför svältande flugor till en petriskål som innehåller enstaka prickar av den nyberedda flugmaten, kompletterad med 2% BPB, så att flugorna kan foder i fyra timmar vid rumstemperatur medan de utsätts för ljus.Efter fyra timmar samla flugorna, fortsätt sedan att kirurgiskt isolera tarmarna hos de sövda flugorna i 1X PBS med tång under ett stereomikroskop. Räkna antalet flugor som visar robust BPB stående i tarmarna och beräkna procentandelen med hjälp av ekvationen. Efter dissekering monterar du proverna i PBS på en glasrutschbana och placerar den förberedda bilden under mikroskopet.Justera sedan fokus med IPS. När du är klar stänger du av IPS för att öppna slutaren för kameran. Efter gut dissekering, vissa Drosophila melanogaster kvinnliga flugor befanns producera syra som anges av den gula färgen i CCR i tarmen.Medan tarmarna hos vissa flugor var blå vilket tyder på ett misslyckande av flugorna att försura sina tarmar. Inom 30 minuter hade cirka 20% av flugorna surnat tarmen. Efter en timme visade 40% av tarminälvorna försurning, medan efter två till tre timmars utfodring ökade andelen försurade tarmar till 60 till 70%Nästan 90 till 95% av tarmarna surnade när flugor matades i fyra timmar.Ingen skillnad i gut försurning observerades för två olika temperaturförhållanden. Effektiviteten i gut försurningsprotokollet bedömdes i olika Drosophila arter. Alla testade arter visade robust tarmförsurning, vilket tyder på att protokollet kan tillämpas på andra organismer.Det viktigaste att komma ihåg är att placera stjärnan flyger in i petriskplattan med jäst och Bromophenol blå i fyra timmar. Denna teknik kommer att hjälpa till att förstå den grundläggande biologi och cellulära vägen som är involverad i tarmförsurningen. Det bör också bidra till att identifiera narkotikamålet för att skapa de sjukdomar som är relaterade till tarmförsurningen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extrahera DNA från tarmen Mikroberna i Termite (Zootermopsis Angusticollis) och visualisering Gut Mikroberna

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Helcells Inspelningar från hjärnan hos vuxna Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Övervakning av hjärtfunktion i Larvernas Drosophila melanogaster För fysiologiska studier

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissekering av Oenocytes från Vuxen Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Injektionsstället och Hemolymph Extraction till Mät insulinkänsligheten hos vuxna Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...