Name: monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine
Uploaded: 2021-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Yazarlar, yazarın laboratuvarındaki çalışmalara verilen desteğin, UT Southwestern Tıp Merkezi'ndeki Çocuk Araştırma Enstitüsü'nden HHMI Fakülte Akademik Ödülü ve başlangıç fonları tarafından sağlandığını kabul eder.

NOT: Oregon R standart laboratuvar hattı WT kontrolü olarak kullanılmıştır. Tüm sinekler oda sıcaklığında 12/12 saat açık/koyu sirkadiyen ritimle standart mısır unu-pekmez ortamında (pekmez, agar, maya, mısır unu, tegosept, propiyonik asit ve su içeren) yetiştirildi.
1. Teste hazırlık
<ol><li>Kadın sinekleri (0-2 günlük, bakire olmayan) CO2 anestezisi altında toplayın ve deneylerden önce en az 3 gün boyunca standart mısır unu yiyecek...

<ol>
	<li>Hollander, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+mechanism+of+formation+of+gastric+acid+secretion.">The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion.</a> Science. 110 (2846), 57-63 (1949).</li><li>Forte, J. G., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+recycling+of+the+gastric+parietal+cell+H,+K-ATPase.">Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase.</a> Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).</li><li>Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+gastric+acid+secretion+through+analysis+of+genetically+engineered+mice.">Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice.</a> Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).</li><li>Yao, X., Forte, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+acid+secretion+by+the+parietal+cell.">Cell biology of acid secretion by the parietal cell.</a> Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).</li><li>Driver, I., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+regional+intestinal+stem+cell+identity+during+Drosophila+metamorphosis.">Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).</li><li>Overend, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+functional+significance+of+acid+generation+in+the+Drosophila+midgut.">Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut.</a> Scientific Reports. 6, 27242 (2016).</li><li>Shanbhag, S., Tripathi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ultrastructure+and+cellular+mechanisms+of+acid+and+base+transport+in+the+Drosophila+midgut.">Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).</li><li>Dubreuil, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+cells+and+stomach+acid+secretion+in+the+Drosophila+midgut.">Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).</li><li>Martorell, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+tumorigenesis+in+the+Drosophila+adult+midgut.">Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut.</a> PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).</li><li>Strand, M., Micchelli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+control+of+Drosophila+gut+stem+cell+proliferation:+EGF+establishes+GSSC+proliferative+set+point+&amp;+controls+emergence+from+quiescence.">Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point &amp; controls emergence from quiescence.</a> PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+perpetuates+nutritional+mutualism+by+promoting+the+fitness+of+its+intestinal+symbiont+Lactobacillus+plantarum.">Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum.</a> Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).</li><li>Abu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+the+nutritional+value+of+sugar+in+Drosophila.">Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).</li><li>Blecker, U., Gold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastritis+and+ulcer+disease+in+childhood.">Gastritis and ulcer disease in childhood.</a> European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).</li></ol>

Bu protokolde kritik bir adım, asitleşme fenotipi için CCR'yi görselleştirmek için bağırsakların uygun şekilde diseksiyonudur. Bakır hücrelerden salınan asit, bağırsak sağlam olduğunda CCR ile sınırlıdır. Bununla birlikte, diseksiyon sırasında, bağırsağın yırtılmasından kaynaklanan sızıntı, CCR'den asitin yayılmasına neden olabilir ve yanlışlıkla asitleşme için negatif olarak puanlanan bir bağırsakla sonuçlanabilir. Ek olarak, asitleşmenin sarı rengi diseksiyondan sonra 5-10 d...

Böcek bağırsasında, bakır hücreler memeli midesinin asit üreten mide parietal hücreleri (oksintik olarak da bilinir) ile hücresel ve fonksiyonel benzerlikleri paylaşır. Bu hücre grubu bağırsak lümenine asit salgılar. Asit salgısı ve anatomisinin işlevi evrimsel olarak korunur. Boşaltılan asidin ana bileşenleri hidroklorik asit ve potasyum klorürdür. Hücrelerde asit oluşumunun kimyasal mekanizması karbonik anhidre bağlıdır. Bu enzim, CO2 ve sudan bikarbonat iyon üretir, bu da daha sonra potasyum karşılığında bir proton pompası aracılığıyla lümene boşaltılan bir hidroksil iyonunu serbest eder. Klorür ve potasyum iyonları iletkenlik kanalları ile lümene taşınır ve bu da mide suyunun ana bileşeni olan hidroklorik asit ve potasyum klorürün oluşumuna neden olan 1,2,3,4.
Asit oluşum mekanizmaları iyi anlaşılsa da asit salgısını düzenleyen fizyolojik mekanizmalar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Bu yöntemi geliştirmenin amacı, asit oluşumunu ve salgısını koordine eden hücresel yolların daha iyi belirlenmesine yardımcı olmak ve asidin bağırsak fizyolojisi ve homeostazda aracılık etmedeki rolünü belirlemektir. Bu tekniğin geliştirilmesinin ve kullanılmasının arkasındaki mantık, Drosophila ve model olmayan organizmalarda bağırsak asitleşme sürecini incelemek için tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlamaktır. Drosophila midgut asitleşmesini belirlemek için standart bir protokol şu anda 2,5,6 olmasına rağmen, bakır hücre fonksiyonunu incelemek için bu protokolü kullanırken vahşi tip (WT) sineklerde asitleşme boyutunda önemli değişkenlik gözlenmiştir. Gözlemlenen bu değişkenliğin temelini anlamak ve tutarlı sonuçlar elde etmek için, standart protokolün çeşitli yönleri aşağıda açıklandığı gibi optimize edilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>B0126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. simulans</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. erecta</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pseudoobscura</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. mojavensis</td>
			<td>Drosophila Species Stock Center at the University of California</td>
			<td></td>
			<td>Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Inox Biology</td>
			<td></td>
			<td>Catalog# 11252-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuji</td>
			<td>Fuji</td>
			<td></td>
			<td>Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Catalog#16005-108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes Tissue</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and camera</td>
			<td>Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera</td>
			<td></td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon R</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock</td>
			<td></td>
			<td>(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Catalog #FB0875713A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td>Catalog # SH30258.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus SZ51</td>
			<td></td>
			<td>Visual magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gut acidification in the adult drosophila intestine

Meyve sineği midgut, her biri bağırsakların düzgün çalışması için gerekli benzersiz fizyolojik işlevleri yerine getiren hücrelerden oluşan birden fazla bölgeden oluşur. Bu bölgelerden biri olan bakır hücre bölgesi (CCR), orta ortaguta lokalizedir ve kısmen bakır hücre olarak bilinen bir grup hücreden oluşur. Bakır hücreler, kesin rolü yetenemeyen evrimsel olarak korunmuş bir süreç olan mide asidi salgılanmasına dahil olur. Bu makale, yetişkin Drosophila melanogaster bağırsağın asitleştirilmesi için kullanılan mevcut protokoldeki gelişmeleri açıklar ve diğer sinek türlerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Özellikle, bu makale bağırsak asitleşmesinin sineğin beslenme durumuna bağlı olduğunu göstermektedir ve bu yeni bulguya dayanan bir protokol sunun. Genel olarak, bu protokol, bağırsak asitleştirme mekanizmalarının altında yer alan genel ilkeleri ortaya çıkarmak için Drosophila bakır hücrelerini incelemenin potansiyel yararlılığını göstermektedir.

Oregon R dişi sineklerini 20 saatten fazla aç bıraktık ve daha önce açıklandığı gibi ~ 12 saat boyunca BPB (% 2) ile desteklenmiş yiyecekleri besledik. Bromofenol mavisi (BPB) pH algılayan bir boyadır. pH 3.0'da sarıdan pH 4.6 ve üzeri maviye dönüşür. Bağırsak diseksiyonunun ardından, daha önce bildirildiği gibi, bazı sineklerin bağı...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine at JoVE.com

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Burada, Drosophila melanogaster'daki bağırsak asitleşmesini optimal çıkışla izlemek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü ilk olarak Drosophila melanogaster'da bağırsak asitleştirme izleme için kullanıyoruz ve daha sonra model olmayan Drosophila türlerinde kullanımını gösteriyoruz.

Yetişkin Drosophila Bağırsasında Bağırsak Asitleşmesini İzleme

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...

Bu, Drosophila bağırsak asitleşmesini sağlam ve otantik sonuçlarla izlemek için en hızlı ve doğru protokoldür. Bu yöntem, bağırsak asitleşmesinin birden fazla organizmadaki rolünü belirlemeye yardımcı olacaktır. Ve bu fenomen bu tekniğin basitliği ana avantajdır.Bu nedenle, model olmayan organizmalar için kullanılabilir. Bu yöntem, hücre hatları ve canlı kültürler üzerinde 3D dahil olmak üzere birçok sistem için asit salınımını izleyebilir. Bu teknik minimum çaba ile basittir.Bromophenol mavisi içeren yiyecekler taze hazırlanmalıdır. Ek olarak, diseksiyon bağırsağı gerilmemelidir. pH algılama Bromophenol mavisi veya BPB boyası ile sinek gıdasının hazırlanması ile bağırsak asitleştirme izleme tahlilini düzenlemeye başlayın.Bunu yapmak için, sinek yiyeceklerini bir mikrodalga fırında eritin ve ılık olana kadar soğumaya bırakın. Bir mililitre 4% BPB ılık yiyeceğe bir mililitreyi bir karıştırma kuyusu ile ekleyin. Bir pipet kullanarak, BPB içeren sinek yiyeceğini bir petri kabının ortasında yaklaşık 200 mikrolitrelik tek bir noktaya ekleyin.Daha sonra, sıfır ila iki günlük bakire olmayan dişi Drosophila melanogaster sineklerini toplayın ve sineklerin standart mısır unu yiyeceklerinde iyileşmesine izin verin. Deneyden önce, sinekleri oda sıcaklığında yaklaşık iki mililitre deiyonize su ile ıslatılmış bir laboratuvar mendil dokusu içeren bir şişede 24 saat aç bırakın. Aç sinekleri, ışığa maruz kalırken oda sıcaklığında dört saat boyunca yemlemelerine izin vermek için% 2 BPB ile desteklenmiş taze hazırlanmış sinek yiyeceklerinin tek noktalarını içeren bir petri kabına aktarın.Dört saat sonra sinekleri toplayın, ardından anestezi edilmiş sineklerin bağırsaklarını stereo mikroskop altında toparlama ile 1X PBS'de cerrahi olarak izole etmeye devam edin. Bağırsakta duran sağlam BPB'yi gösteren sineklerin sayısını sayın ve denklemi kullanarak yüzdeyi hesaplayın. Diseksiyondan sonra, PBS'deki örnekleri cam bir kaydırağa monte edin ve hazırlanan slaydı mikroskop altına yerleştirin.Ardından IPS'yi kullanarak odağı ayarlayın. Tamamlandığında, kameranın deklanşörini açmak için IPS'yi kapatın. Bağırsak diseksiyonunun ardından, bazı Drosophila melanogaster dişi sineklerinin bağırsak CCR'sunda sarı renkte belirtildiği gibi asit ürettiği bulunmuştur.Oysa bazı sineklerin bağırsakları maviydi, bu da sineklerin bağırsaklarını asitleştirmede başarısız olduğunu gösteriyordu. 30 dakika içinde sineklerin yaklaşık %20'si bağırsağı asitleştirmişti. Bir saat sonra, bağırsakların% 40'ı asitlenme gösterirken, iki ila üç saatlik beslenmeden sonra, asitlenmiş bağırsakların yüzdesi% 60 ila% 70'e yükseldi Sinekler dört saat boyunca beslendiğinde bağırsakların neredeyse% 90 ila% 95'i asitlendi.İki farklı sıcaklık koşulunda bağırsak asitlenmesinde bir fark gözlenmedi. Bağırsak asitleştirme protokolünün etkinliği çeşitli Drosophila türlerinde değerlendirildi. Test edilen tüm türler sağlam bağırsak asitlenmesi gösterdi ve protokolün diğer organizmalara da uygulanabileceğini düşündürdü.Hatırlanması gereken en önemli şey, yıldız sineklerini dört saat boyunca maya ve Bromophenol mavisi ile petri tabağına yerleştirmektir. Bu teknik, bağırsak asitlenmesinde yer alan temel biyolojiyi ve hücresel yolu anlamaya yardımcı olacaktır. Ayrıca bağırsak asitleşmesi ile ilgili hastalıkları oluşturmak için ilaç hedefini belirlemeye yardımcı olmalıdır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Gavaging Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...