Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 og National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (til ERR).

Alle procedurerne var baseret på retningslinjerne og godkendelsen fra Institutional Animal Care and Use Committee på Vanderbilt University Medical Center.
1. Fremstilling af reagenser og assayopsætning
<ol><li>Isolering og dyrkning af knoglemarvsstromale celler (se også den foregående artikel30).<ol>
<li>Forbered komplette alfa-minimum essentielle medier (αMEM) cellekulturmedier ved at supplere minimum essentielle medier med alfa-modifikation me...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

Den realtidscelle metaboliske fluxanalysator kan bruges til at udforske cellulære energier under forskellige forhold. Protokollen illustrerer den effektive isolering af BMSC'er, dyrkning af celler i passende cellekulturplader og deres differentiering til modne osteoblaster, som kan bruges til forskellige assays ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Desuden forklares de kritiske trin i realtids cellemetabolisk fluxassay, herunder hydrering af sensorpatroner, indlæsning af injektionsportene, udførelse af as...

Dannelsen af knogle ved osteoblast ledsages af koordineret ødelæggelse eller resorption af knogler af osteoklaster. Balancen mellem osteoblastisk knogledannelse og osteoklastresorption er en koblet proces, der beskriver knogleomsætning eller ombygning, hvilket er afgørende for skelethomeostase. Osteoblastdysfunktion fører til nedsat knogledannelse og resulterer i forskellige sygdomme, herunder osteoporose 1,2,3. Ex vivo/in vitro-differentiering af knoglemarvsstromale stamceller (BMSC'er) til osteoblastprækursorer og modne osteoblaster resulterer i dannelse og aflejring af den mineraliserede knoglematrix i dyrkningsbeholderen over tid 4,5,6. Denne knogledannelse ved osteoblast kræver en betydelig mængde cellulær energi. Specifikt har kollagensyntese og sekretion vist sig at være stærkt afhængig af cellulær ATP: ADP-forhold, og formodentlig kræver mineraliseret vesikelhandel og sekretion yderligere ATP 7,8,9,10,11. Mange forskere har vist, at processen med osteoblastogenese og osteoblastfunktion kræver en tilstrækkelig tilførsel af energi til at imødekomme det metaboliske behov for knogledannelse 12,13,14,15,16. Derfor er målet med denne metode at karakterisere den bioenergetiske status for primære, murine stromale celler gennem osteoblastdifferentiering ved hjælp af realtidscellemetabolisk fluxanalysator. Disse teknikker hjælper med at udvikle en bedre forståelse af skelethomeostase, hvilket i sidste ende kan føre til udvikling af nye terapeutiske muligheder, der er i stand til at forbedre skeletforstyrrelser.
Realtidscellemetabolisk fluxanalysator kan bruges til at måle iltforbrugshastigheden (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) af levende osteoblaster, hvilket svarer til henholdsvis mitokondriel og glykolytisk ATP-produktion. Grundlæggende for denne metode er det faktum, at en H + ion pr. Lactat frigives under glykolyse i omdannelsen af glucose til lactat, hvilket ændrer mediets pH afspejlet i ECAR-værdierne. Omvendt producerer oxidativ fosforylering via mitokondrierne under TCA-cyklussen (tricarboxylsyre) CO2 ved at udnytte eller forbruge ilt, og derfor afspejler overvågning af OCR denne metaboliske proces. Analysatoren måler både OCR og ECAR i det ekstracellulære mikromiljø samtidigt og i realtid, hvilket giver mulighed for et enormt potentiale, når man studerer cellulær bioenergetik 6,17. Derudover er udførelsen af disse assays relativt ligetil og let tilpasselig afhængigt af det eksperimentelle mål. Lignende teknikker er blevet anvendt til yderligere at forstå T-celle metabolisk regulering af immunsystemet18,19, kræftinitiering og progression20 sammen med flere andre celletyper, der bidrager til metaboliske syndromer21,22.
Fordelene ved metabolisk fluxanalysator i realtid i forhold til alternative teknikker omfatter (1) evnen til at måle cellulær bioenergetik af levende celler i realtid, (2) evne til at udføre assay med et relativt lille antal celler (kræver så lavt som 5.000 celler), (3) injektionsporte til parallelt at manipulere flere behandlinger i et system med høj gennemstrømning af 96 brønde, (4) brug af radioaktivt etiketfrit automatiseret cellebillede til normalisering18, 23,24. Følgende metoder sigter mod at give en generaliseret, men detaljeret beskrivelse af overvågning af cellulær bioenergetik i murine BMSC'er gennem osteoblastdifferentiering ved hjælp af analysatoren. Det vil omfatte rutinemæssigt udførte assays; Men som med mange teknikker og metoder opfordres det stærkt til, at de enkelte laboratorier bestemmer specifikke detaljer for deres eksperimenter.
Udvælgelse af assay og forskellige typer assays til rådighed: En bred vifte af assay kits og reagenser er tilgængelige for at studere bioenergetikken af celler, samtidig med at pålideligheden og konsistensen af de eksperimentelle resultater sikres. Derudover tilbyder desktop-softwaren også analyseskabeloner, der let kan tilpasses. Assayet kan defineres ud fra brugerens behov for at måle forskellige metaboliske parametre. Disse assays kan ændres på forskellige måder baseret på det eksperimentelle mål og / eller videnskabelige spørgsmål. For eksempel kan flere forbindelser med fire injektionsporte injiceres i assaymediet for at analysere det cellulære respons, der er specifikt for hver metabolisk vej.
Celle energi fænotype test: Dette assay måler de levende cellers metaboliske fænotype og metaboliske potentiale. Dette assay anbefales også som det første skridt til at få en generaliseret ide om pathway-specifik metabolisme. En blanding af oligomycin A-en hæmmer af ATP-syntase og carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP)-et mitokondrielt afkoblingsmiddel injiceres for at forstå celleenergipotentialet. Injektionen af oligomycin A hæmmer syntesen af ATP, hvilket resulterer i en stigning i glykolysehastigheden (ECAR) for at gøre det muligt for cellerne at opfylde deres energibehov; på den anden side resulterer injektionen af FCCP i højere OCR på grund af depolarisering af mitokondriemembranen. I det væsentlige skildrer dette assay basal metabolisk åndedræt, og efter de dobbelte injektioner, skubber eller understreger det metaboliske respons. Baseret på disse parametre plotter softwaren derefter OCR og ECAR af cellerne ved at klassificere cellerne som aerob, quiescent, glykolytisk eller energisk tilstand over tid25,26.
ATP produktionshastighedsanalyse i realtid: Dette måler den cellulære ATP-produktion samtidigt fra glykolyse og mitokondriel respiration. Dette assay måler kvantitativt de metaboliske skift fra de to energiveje og giver data om mitokondrie- og glykolytiske ATP-produktionshastigheder over tid. Assayet opnår basale OCR- og ECAR-data efterfulgt af beregning af mitokondriel ATP-produktionshastighed gennem injektion af oligomycin A og glykolytisk ATP-produktionshastighed gennem injektion af rotenon + antimycin A-blanding (total hæmning af mitokondriefunktion), hvilket resulterer i mitokondriel forsuring17,27.
Cellemitokondrier stresstest (eller celle mito stress test): Dette måler mitokondriefunktionen gennem ATP-bundet åndedræt, kvantificerer cellulær bioenergetik, identificerer mitokondriel dysfunktion og måler cellernes reaktion på stress. Forskellige parametre, herunder basal og ekstra åndedrætskapacitet, ATP-bundet åndedræt, maksimal åndedræt og ikke-mitokondrielt iltforbrug, kan opnås i et assay. Dette assay involverer sekventielle injektioner af oligomycin A, FCCP (mitokondrielt afkoblingsmiddel), en blanding af rotenon/antimycin A-hæmmere for effektivt at analysere virkningen af disse på mitokondriefunktionen28.
Fleksibilitet mito fuel flex test: Dette måler mitokondrie-respirationshastigheden ved oxidation af de tre primære mitokondrielle brændstoffer ved tilstedeværelsen og fraværet af deres hæmmere. Den sekventielle hæmning af glucose, glutamin og fedtsyrer hjælper med at måle afhængigheden, kapaciteten og fleksibiliteten af celler og afhængigheden af cellerne i forskellige cellulære veje for at imødekomme energibehovet. Når mitokondrierne ikke kan opfylde kravene fra den blokerede vej af interesse ved at oxidere andre brændstoffer, går cellerne ind i en afhængighedstilstand. Cellernes kapacitet beregnes ved hæmning af de to andre alternative veje efterfulgt af hæmning af interessevejen. Cellernes fleksibilitet hjælper med at forstå mitokondriernes evne til at kompensere og imødekomme brændstofbehovene i den hæmmede vej. Det beregnes ved at trække afhængigheden af celler fra cellernes kapacitet. Tre forskellige hæmmere anvendes uafhængigt eller som en blanding af to til effektivt at beregne assayparametrene. 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensyre (UK5099) hæmmer oxidationen af glucose ved at blokere pyruvatbæreren i glykolyse. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) ethylsulfid hæmmer glutaminoxidationsvejen, og etomoxir hæmmer oxidationen af langkædede fedtsyrer29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk gengivelse af metoden til dyrkning og fremstilling af osteoblaster til analyse. Murine BMSC'er isoleres fra lange knogler, dyrkes og podes i 96-brønds plader ved 25.000 celler / brøndtæthed. Dyrkning af disse celler i osteoblastspecifikke medier startes, når de når 80% -100% sammenflydning for at starte deres differentiering. Assays udføres på forskellige stadier af differentiering. Patronpladerne hydreres en dag før analysen. På analysedagen injiceres forskellige hæmmere i sensorpatronernes porte baseret på assaykravene, og der tilsættes en kalibreringsbuffer til kalibreringspladen med 96 brønde. Efter kalibrering udføres cellemetabolisk fluxassay i realtid efterfulgt af billeddannelse af cellekulturmikropladen ved hjælp af mikropladekameraet til normalisering af cellemetaboliske fluxanalysatordata i realtid med celleantal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

Knogledannelse ved osteoblaster er en væsentlig proces for korrekt knogleopkøb og knogleomsætning for at opretholde skelethomeostase og i sidste ende forhindre brud. For både at optimere den maksimale knoglemasse og bekæmpe forskellige muskuloskeletale sygdomme (dvs. postmenopausal osteoporose, anorexia nervosa, type 1 og 2 diabetes mellitus) er der gjort en utrolig indsats inden for knoglebiologi for fuldt ud at karakterisere osteoblaster gennem hele deres differentieringsproces. I betragtning af den primære rolle, som modne osteoblaster spiller for at udskille matrixproteiner og mineraliseringsvetikler, er det blevet bemærket, at disse processer tager en utrolig mængde cellulær energi eller adenosintrifosfat (ATP). Den overordnede cellulære energistatus kaldes ofte cellulær bioenergetik, og den omfatter en række metaboliske reaktioner, der fornemmer substratets tilgængelighed for at udlede ATP for at imødekomme cellulære behov. Derfor beskriver den nuværende metode processen med at isolere primære, murine knoglemarvstromale celler (BMSC'er) og overvåge deres bioenergetiske status ved hjælp af real-time cell metabolic flux analyzer på forskellige stadier i osteoblastdifferentiering. Det er vigtigt, at disse data har vist, at den metaboliske profil ændres dramatisk gennem osteoblastdifferentiering. Brug af denne fysiologisk relevante celletype er således nødvendig for fuldt ud at forstå, hvordan en celles bioenergetiske status kan regulere den samlede funktion.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentative grafer for rutinemæssigt udførte assays for at forstå den cellulære bioenergetiske profil af kontrol vs. behandlingsgruppe med deres respektive standardfejl. (A) Celleenergifænotypetesten. Plottet repræsenterer glykolysen (ECAR) vs. mitokondriel respiration (OCR) af kontrollen vs. to behandlings...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Real-time cell metabolic flux assay måler iltforbrugshastigheden og ekstracellulær forsuringshastighed, hvilket svarer til mitokondriel og glykolytisk adenosintrifosfatproduktion ved hjælp af pH- og iltsensorer. Manuskriptet forklarer en metode til at forstå osteoblasternes energistatus og karakteriseringen og fortolkningen af den cellulære bioenergetiske status.

Brug af cellemetabolisk fluxanalysator i realtid til at overvåge osteoblastbioenergetika

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Denne metode er nyttig til bestemmelse af cellulære energier, som ATP-produktionshastighed, og også til at bestemme cellulær præference for en bestemt metabolit i realtid. Til at begynde med tilsættes 200 mikroliter XF-kaliber og inkuberes brugspladen i mindst en time før analysen. Forbered 80 ml XF-analysemedier ved hjælp af suppleret XF DMEM.Optø oligomycin A, rotenon og antimycin A på is. Pipette forbindelserne op og ned for at opløse dem før brug. Tilsæt tre milliliter tilberedt analysemedium til hvert rør, mærket A og B.Tilsæt 26,4 mikroliter 2,5 millimolært oligomycin A i rør A og 3,1 mikroliter 12,67 millimolær rotenon, 4,1 mikroliter 9,4 millimolært antimycin A og 30 mikroliter Hooks plet i rør B.Læg en 10x koncentration af disse hæmmere i den tilsvarende injektionsport.Og endelig vil 20 mikroliter af disse forbindelser blive indlæst i cellerne i 200 mikroliter assaymedier. Fjern cellekulturmikropladen fra 37 grader Celsius inkubatoren og observer cellerne under mikroskopet. Fjern analysemediet fra vandbadet.Vask forsigtigt cellerne med 200 mikroliter forvarmet assaymedium to gange, og tilsæt 200 mikroliter assaymedier pr. Brønd. Kontroller cellerne under mikroskopet for at sikre, at cellerne forbliver klæbet til brøndene. Sørg for, at cellerne i D5- og E8-brøndene klæbes med et ensartet monolag og ikke vaskes væk under vasketrinnet.Cellebilleddannelsessoftware bruger disse to brønde til indstilling af autofokus og automatisk eksponering. Åbn desktop-softwaren på computeren ved siden af udstyret. Kontroller forbindelsesstatus i nederste venstre hjørne af controllersoftwaren.Gå til Skabeloner, og vælg XF ATP-satsanalyseskabelonen eller den relevante analyseskabelon. Vælg Gruppedefinitioner øverst på skærmen, og definer grupperne. vælg pladekortlayoutet, og tildel brøndene afhængigt af de definerede grupper.Bekræft instrumentprotokollen. Sørg for, at de tilføjede forbindelser er korrekt angivet og inkluderer projektoplysningerne til fremtidige referencer. Klik på Kør assay.Dette vil bede om valg af resultatfillagringsplaceringen. Vælg den placering, hvor resultatfilen skal gemmes. Gem filen med analysedatoen, og klik på Start kørsel.Placer sensorpatronen og værktøjspladen på bakken, og klik på Jeg er klar til at starte kalibreringen. Åbn cellebilleddannelsessoftwaren på computeren. Sørg for, at mikropladebilledet er tændt, og at portene er sluttet til computeren.Kontroller statuslinjen nederst til venstre på skærmen for at sikre, at temperaturen er indstillet til 37 grader Celsius, og at forbindelsesstatus skal fremhæves med grønt som klar. Scan pladestregkoden for at starte billeddannelsesprocessen. Giv et navn til cellepladen, og tryk på Gem.Brightfield og fluorescerende billeder gemmes her. Klik på Udfør Brightfield Scan, og i det næste skærmbillede viser plade- og scanningsmenuen indstillingerne for billeddannelse. Før analysen skal du vælge Start Brightfield Scan.Anbring cellekulturmikropladen og pladedækslet på bakkeholderen, og juster godt A1 med A1-mærket. Klik på Luk bakke. Brightfield-billedoptagelse vises på det næste skærmbillede med et pladekort.Klik på Scan alle brønde og scan i 30 til 35 minutter. Når kalibreringen er fuldført, viser softwaren dialogboksen Vejecelleplade. Klik derefter på Åbn bakke for at udskifte værktøjsbakken med en cellekulturmikroplade.Bemærk, at cellekulturpladen er i mikropladebilledet. Efter scanningen skal du fjerne cellekulturmikropladen og placere den i analysatoren for at udføre analysen. Klik derefter på Vejecelleplade for at starte analysen.Vent, indtil analysen starter, og vis den estimerede færdiggørelsestid. Når analysen er afsluttet, viser softwaren unload sensorpatron og cellepladedialogboksen. Klik på Skub ud, og fjern cellekulturmikropladen fra analysatoren.Fjern forsigtigt sensorpatronen, og udskift låget til cellepladen. Dialogboksen Analyse fuldført vises. Klik derefter på Vis resultater for at åbne analyseresultatfilen eller for at normalisere dataene.Når analysen er afsluttet, skal du scanne pladestregkoden med den håndholdte stregkodelæser. Hvis pladen allerede er afbildet, kræver den ikke et nyt navn. Vælg Fluorescens og celleantal.Placer cellepladen på bakkeholderen, og klik på Luk bakke. I billedoptagelsesvinduet skal du vælge Scan alle brønde for at starte billeddannelsen. Gennemgå de fluorescerende billeder og celletællinger i billedbehandlings- og cellebilleddannelsesprogrammet ved tilfældigt at klikke på et par af brøndene.Når fluorescensbilleddannelsen er afsluttet, skal du eksportere billederne for yderligere referencer. Når billeddannelsen og celletællingen er afsluttet, skal du åbne resultatfilen og klikke på Normaliser. Klik på Importer, og vælg Anvend på desktop-softwaren for automatisk at normalisere analysen med celletælling.Oligomycin A- og FCCP-stressorblandingsinjektionen øgede kontrolgruppens baseline-aktivitet. Stressorer viste et signifikant højt energiniveau i den kontrol og behandling, man grupperer. På den anden side havde behandling to en forholdsvis lavere baselineaktivitet, og cellerne blev mere aerobe.Figuren angiver, at både kontrol- og eksperimentelle celler bruger glykolyse og mitokondriel oxidativ phosphorylering til ATP-generering. Den eksperimentelle gruppe viser en reduktion i ATP-generering via glykolyse og en stigning i mitokondriel respiration. Den basale respirationshastighed i behandlingsgruppen er forholdsvis mindre end kontrolgruppen.Respirations- og ATP-produktionshastighederne i begge grupper reduceres sammen med protonlækagen efterfulgt af en oligomycin A-injektion. Cellernes respirationshastigheder stiger tilbage igen til deres maksimale åndedræt efter injektionen af FCCP. Den endelige injektion af rotenon og antimycin A reducerer OCR igen.Efter den tredje injektion lukkes mitokondrieåndedræt ved kombinationen af rotenon og antimycin A.Sammenlignet med kontrolgruppen har behandlingsgruppernes basale og maksimale åndedræt relativt ingen ændring. Figuren viser, at kontrolgruppen er stærkt afhængig af glukosevejen, mens glutaminoxidation var effektiv i kontrolgruppen. Fedtsyrevejen viser, at behandlingen har øget cellernes samlede kapacitet.Tilgængeligheden af flere injektionsporte på syrepladen hjælper os med at bestemme virkningen af flere lægemidler på cellulære energier på et enkelt tidspunkt.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sortering af<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell træpiller vha. en Complex Object Parametric Analyzer og sortering

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtidsmålinger membranprotein: Receptor Interactions Brug overfladeplasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse af metaboliske profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Intestinal Crypt organoide Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing af<em&gt; BRCA2</em&gt; At identificere nye BRCA2-regulerede biologiske funktioner i dyrkede humane celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging af Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...