Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 en National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (aan ERR).

Alle procedures waren gebaseerd op de richtlijnen en goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee in het Vanderbilt University Medical Center.
1. Bereiding van reagentia en assay-opstelling
<ol><li>Isolatie en kweken van beenmergstromale cellen (zie ook het vorige artikel30).<ol>
<li>Bereid volledige alfa minimum etherische media (αMEM) celkweekmedia door minimale essentiële media aan te vullen met alfamodificatie met 10% FBS (foet...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

De real-time cel metabole flux analyzer kan worden gebruikt om cellulaire energetica onder verschillende omstandigheden te verkennen. Het protocol illustreert de efficiënte isolatie van BMSC's, het kweken van cellen in geschikte celkweekplaten en hun differentiatie tot volwassen osteoblasten, die kunnen worden gebruikt voor verschillende testen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Verder worden de kritieke stappen van real-time celstofwisselingsfluxtest, inclusief hydratatie van sensorpatronen, laden van de...

De vorming van bot door de osteoblast gaat gepaard met gecoördineerde vernietiging of resorptie van botten door osteoclasten. De balans tussen osteoblastische botvorming en osteoclastenresorptie is een gekoppeld proces dat botomzetting of remodellering beschrijft, wat essentieel is voor skelethomeostase. Osteoblastdisfunctie leidt tot verminderde botvorming en resulteert in verschillende ziekten, waaronder osteoporose 1,2,3. Ex vivo/in vitro differentiatie van beenmergstromale stamcellen (BMSCs) naar osteoblastvoorlopers en volwassen osteoblasten resulteert in de vorming en afzetting van de gemineraliseerde botmatrix in het kweekvat in de loop van de tijd 4,5,6. Deze botvorming door de osteoblast vereist een aanzienlijke hoeveelheid cellulaire energie. In het bijzonder is aangetoond dat collageensynthese en secretie sterk afhankelijk zijn van cellulaire ATP: ADP-verhoudingen, en vermoedelijk vereisen gemineraliseerde blaasjeshandel en secretie extra ATP 7,8,9,10,11. Veel onderzoekers hebben aangetoond dat het proces van osteoblastogenese en osteoblastfunctie een voldoende toevoer van energie vereist om te voldoen aan de metabole vraag naar botvorming 12,13,14,15,16. Daarom is het doel van deze methode om de bio-energetische status van primaire, muriene stromale cellen te karakteriseren gedurende osteoblastdifferentiatie met behulp van de real-time cel metabole flux analyzer. Deze technieken helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van skelethomeostase, wat uiteindelijk kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties die skeletaandoeningen kunnen verbeteren.
De real-time cel metabole flux analyzer kan worden gebruikt om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van levende osteoblasten te meten, wat overeenkomt met respectievelijk mitochondriale en glycolytische ATP-productie. Fundamenteel voor deze methodologie is het feit dat één H + -ion per lactaat vrijkomt tijdens glycolyse bij de omzetting van glucose in lactaat, wat de media-pH verandert die wordt weerspiegeld in de ECAR-waarden. Omgekeerd, tijdens de TCA (tricarbonzuur) cyclus, oxidatieve fosforylering via de mitochondriën produceert CO2 door zuurstof te gebruiken of te consumeren, en daarom is het monitoren van OCR een weerspiegeling van dit metabolische proces. De analyzer meet zowel OCR als ECAR in de extracellulaire micro-omgeving tegelijkertijd en in realtime, wat een enorm potentieel mogelijk maakt bij het bestuderen van cellulaire bio-energetica 6,17. Bovendien is het uitvoeren van deze testen relatief eenvoudig en gemakkelijk aan te passen, afhankelijk van het experimentele doel. Vergelijkbare technieken zijn gebruikt om de metabool regulatie van het immuunsysteem18,19, kankerinitiatie en progressie20 verder te begrijpen, samen met meerdere andere celtypen die bijdragen aan metabool syndroom21,22.
De voordelen van real-time metabole flux analyzer ten opzichte van alternatieve technieken omvatten (1) de mogelijkheid om cellulaire bio-energetica van levende cellen in real-time te meten, (2) het vermogen om assay uit te voeren met een relatief klein aantal cellen (vereist slechts 5.000 cellen), (3) injectiepoorten om parallel meerdere behandelingen te manipuleren in een high-throughput 96-well systeem, (4) gebruik van radioactieve labelvrije geautomatiseerde celbeeldcamera voor normalisatie18, 23,24. De volgende methoden zijn bedoeld om een algemene maar gedetailleerde beschrijving te geven van het monitoren van cellulaire bio-energetica in muriene BMSCs gedurende de differentiatie van osteoblasten met behulp van de analyzer. Het omvat routinematig uitgevoerde assays; echter, zoals met veel technieken en methoden, wordt het sterk aangemoedigd dat individuele laboratoria specifieke details voor hun experimenten bepalen.
Selectie van assays en verschillende soorten assays beschikbaar: Een breed scala aan assay kits en reagentia zijn beschikbaar om de bio-energetica van cellen te bestuderen en tegelijkertijd de betrouwbaarheid en consistentie van de experimentele resultaten te waarborgen. Bovendien biedt de desktopsoftware ook testsjablonen die eenvoudig kunnen worden aangepast. De test kan worden gedefinieerd op basis van de behoeften van de gebruiker om verschillende metabole parameters te meten. Deze assays kunnen op verschillende manieren worden aangepast op basis van het experimentele doel en/of de wetenschappelijke vraag. Met vier injectiepoorten kunnen bijvoorbeeld meerdere verbindingen in de testmedia worden geïnjecteerd om de cellulaire respons te analyseren die specifiek is voor elke metabole route.
Celenergie fenotype test: Deze test meet het metabole fenotype en het metabolisch potentieel van de levende cellen. Deze test wordt ook aanbevolen als de eerste stap om een gegeneraliseerd idee te krijgen van pathway-specifiek metabolisme. Een mengsel van oligomycine A-een remmer van ATP-synthase en carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP)-een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel wordt geïnjecteerd om het celenergiepotentieel te begrijpen. De injectie van oligomycine A remt de synthese van ATP, wat resulteert in een toename van de snelheid van glycolyse (ECAR) om de cellen in staat te stellen aan hun energiebehoeften te voldoen; aan de andere kant resulteert de injectie van FCCP in een hogere OCR als gevolg van depolarisatie van het mitochondriale membraan. In wezen toont deze test basale metabole ademhaling en na de dubbele injecties, duwen of spanningen de metabole respons. Op basis van deze parameters plot de software vervolgens OCR en ECAR van de cellen door de cellen te classificeren als aerobe, rustige, glycolytische of energetische toestand in de loop van de tijd25,26.
ATP real-time productiesnelheidstest: Dit meet de cellulaire ATP-productie tegelijkertijd uit glycolyse en mitochondriale ademhaling. Deze test meet kwantitatief de metabole verschuivingen van de twee energieroutes en levert gegevens over de mitochondriale en glycolytische ATP-productiesnelheden in de loop van de tijd. De test verkrijgt basale OCR- en ECAR-gegevens, gevolgd door het berekenen van mitochondriale ATP-productiesnelheid door injectie van oligomycine A en glycolytische ATP-productiesnelheid door injectie van rotenon + antimycine A-mengsel (totale remming van mitochondriale functie), resulterend in mitochondriale verzuring17,27.
Cel mitochondriën stresstest (of cel mito stress test): Dit meet de mitochondriale functie door atp-gebonden ademhaling, kwantificeert cellulaire bio-energetica, identificeert mitochondriale disfunctie en meet de reactie van cellen op stress. Verschillende parameters, waaronder basale en reserve ademhalingscapaciteit, ATP-gebonden ademhaling, maximale ademhaling en niet-mitochondriaal zuurstofverbruik, kunnen in één test worden verkregen. Deze test omvat sequentiële injecties van oligomycine A, FCCP (mitochondriaal ontkoppelingsmiddel), een mengsel van rotenon / antimycine A-remmers om het effect hiervan op de mitochondriale functie efficiënt te analyseren28.
Flexibiliteit mito fuel flex test: Dit meet de mitochondriale ademhalingssnelheid door de oxidatie van de drie primaire mitochondriale brandstoffen door de aan- en afwezigheid van hun remmers. De sequentiële remming van glucose, glutamine en vetzuren helpt bij het meten van de afhankelijkheid, capaciteit en flexibiliteit van cellen en de afhankelijkheid van de cellen in verschillende cellulaire routes om aan de energievraag te voldoen. Wanneer de mitochondriën niet kunnen voldoen aan de eisen van de geblokkeerde route van belang door andere brandstoffen te oxideren, komen de cellen in een afhankelijkheidstoestand. De capaciteit van de cellen wordt berekend door remming van de andere twee alternatieve routes gevolgd door de remming van de route van belang. De flexibiliteit van cellen helpt bij het begrijpen van het vermogen van mitochondriën om te compenseren en te voldoen aan de brandstofbehoeften van de geremde route. Het wordt berekend door de afhankelijkheid van cellen af te trekken van de capaciteit van cellen. Drie verschillende remmers worden onafhankelijk van elkaar of als een mengsel van twee gebruikt om de testparameters effectief te berekenen. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propeenzuur (UK5099) remt de oxidatie van glucose door de pyruvaatdrager in glycolyse te blokkeren. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) ethylsulfide remt de glutamine-oxidatieroute en etomoxir remt de oxidatie van langeketenvetzuren29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de methodologie voor het kweken en voorbereiden van osteoblasten voor analyse. Murine BMSC's worden geïsoleerd uit lange botten, gekweekt en gezaaid in 96-well platen met 25.000 cellen / putdichtheid. Het kweken van deze cellen in osteoblastspecifieke media wordt gestart wanneer ze 80% -100% confluentie bereiken om hun differentiatie te starten. De assays worden uitgevoerd in verschillende stadia van differentiatie. De patroonplaten worden een dag voorafgaand aan de test gehydrateerd. Op de dag van de test worden verschillende remmers geïnjecteerd in de poorten van de sensorcartridges op basis van de testvereisten en wordt een kalibratiebuffer toegevoegd aan de 96-well kalibratieplaat. Na kalibratie wordt de real-time cel metabole flux assay uitgevoerd, gevolgd door het in beeld brengen van de celkweekmicroplaat met behulp van de microplate imager om real-time cel metabole flux analyzer gegevens met celgetal te normaliseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

Botvorming door osteoblasten is een essentieel proces voor een goede botacquisitie en botomzetting om de homeostase van het skelet te behouden en uiteindelijk fracturen te voorkomen. In het belang van zowel het optimaliseren van de piekbotmassa als het bestrijden van verschillende musculoskeletale aandoeningen (d.w.z. postmenopauzale osteoporose, anorexia nervosa, type 1 en 2 diabetes mellitus), zijn ongelooflijke inspanningen geleverd op het gebied van botbiologie om osteoblasten volledig te karakteriseren tijdens hun differentiatieproces. Gezien de primaire rol van volwassen osteoblasten om matrixeiwitten en mineralisatieblaasjes af te scheiden, is opgemerkt dat deze processen een ongelooflijke hoeveelheid cellulaire energie of adenosinetrifosfaat (ATP) vergen. De algehele cellulaire energiestatus wordt vaak cellulaire bio-energetica genoemd en omvat een reeks metabole reacties die de beschikbaarheid van substraat detecteren om ATP af te leiden om aan cellulaire behoeften te voldoen. Daarom beschrijft de huidige methode het proces van het isoleren van primaire, muriene beenmergstromale cellen (BMSCs) en het monitoren van hun bio-energetische status met behulp van de Real-time cel metabole flux analyzer in verschillende stadia van osteoblastdifferentiatie. Belangrijk is dat deze gegevens hebben aangetoond dat het metabole profiel dramatisch verandert tijdens de differentiatie van osteoblasten. Het gebruik van dit fysiologisch relevante celtype is dus vereist om volledig te begrijpen hoe de bio-energetische status van een cel de algehele functie kan reguleren.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve grafieken voor routinematig uitgevoerde assays om het cellulaire bio-energetische profiel van controle versus behandelingsgroep met hun respectieve standaardfouten te begrijpen. (A) De celenergiefenotypetest. De grafiek vertegenwoordigt de glycolyse (ECAR) versus mitochondriale ademhaling (OCR) van d...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Deze methode is nuttig bij het bepalen van cellulaire energetica, zoals ATP-productiesnelheid, en ook om cellulaire voorkeur voor een bepaalde metaboliet op een real-time basis te bepalen. Voeg om te beginnen 200 microliter XF-kalibrant toe en incubeer de gebruiksplaat gedurende ten minste één uur vóór de test. Bereid 80 milliliter XF-testmedia voor met behulp van aangevulde XF DMEM.Ontdooi oligomycine A, rotenon en antimycine A op ijs. Pipetteer de verbindingen op en neer om ze op te lossen voor gebruik. Voeg drie milliliter bereid testmedium toe aan elke buis, gelabeld A en B.Voeg 26,4 microliter 2,5 millimolar oligomycine A toe aan buis A en 3,1 microliter van 12,67 millimolar rotenon, 4,1 microliter van 9,4 millimolair antimycine A en 30 microliter Hook's vlek in buis B.Laad een 10x concentratie van deze remmers in de overeenkomstige injectiepoort.En ten slotte zal 20 microliter van deze verbindingen in de cellen worden geladen in 200 microliter testmedia. Verwijder de celkweekmicroplaat uit de incubator van 37 graden Celsius en observeer de cellen onder de microscoop. Verwijder het testmedium uit het waterbad.Was de cellen voorzichtig tweemaal met 200 microliter voorverwarmd testmedium en voeg 200 microliter testmedia per put toe. Controleer de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen aan de putjes blijven kleven. Zorg ervoor dat de cellen in D5- en E8-putten met een consistente monolaag worden gehecht en niet tijdens de wasstap zijn weggespoeld.Cell imaging software gebruikt deze twee putten voor het instellen van de autofocus en automatische belichting. Open de desktopsoftware op de computer naast de apparatuur. Controleer de verbindingsstatus in de linkerbenedenhoek van de controllersoftware.Ga naar Sjablonen en selecteer de XF ATP-snelheidstestsjabloon of de juiste testsjabloon. Selecteer Groepsdefinities boven aan het scherm en definieer de groepen. selecteer de lay-out van de plaatkaart en wijs de putten toe afhankelijk van de gedefinieerde groepen.Controleer het instrumentprotocol. Zorg ervoor dat de toegevoegde verbindingen correct worden vermeld en neem de projectinformatie op voor toekomstige referenties. Klik op Run Assay.Dit zal de selectie van de opslaglocatie van het resultaatbestand vragen. Selecteer de locatie waar u het resultaatbestand wilt opslaan. Sla het bestand op met de testdatum en klik op Start Run.Plaats de sensorcartridge en de gebruiksplaat op de lade en klik op Ik ben klaar om de kalibratie te starten. Open de cell imaging-software op de computer. Zorg ervoor dat de microplate imager is ingeschakeld en dat de poorten op de computer zijn aangesloten.Controleer de statusbalk linksonder in het scherm om er zeker van te zijn dat de temperatuur is ingesteld op 37 graden Celsius en dat de verbindingsstatus groen moet worden gemarkeerd als gereed. Scan de streepjescode van de plaat om het beeldvormingsproces te starten. Geef een naam op aan de celplaat en druk op Opslaan.Brightfield- en fluorescerende beelden worden hier opgeslagen. Klik op Brightfield Scan uitvoeren en in het volgende scherm tonen Plate and Scan Menu de opties voor beeldvorming. Selecteer vóór de test Brightfield-scan starten.Plaats de celkweekmicroplaat en het plaatdeksel op de ladehouder en lijn goed A1 uit met het A1-merkteken. Klik op Lade sluiten. Brightfield-beeldverwerving verschijnt in het volgende scherm met een plaatkaart.Klik op Scan All Wells en scan gedurende 30 tot 35 minuten. Na voltooiing van de kalibratie geeft de software het dialoogvenster Load Cell Plate weer. Klik vervolgens op Lade openen om de energielade te vervangen door een microplaat voor celkweek.Merk op dat de celkweekplaat zich in de microplaatafbeelding bevindt. Verwijder na de scan de microplaat van de celkweek en plaats deze in de analysator om de test uit te voeren. Klik vervolgens op Load Cell Plate om de test te starten.Wacht tot de test begint en geef de geschatte voltooiingstijd weer. Na voltooiing van de test geeft de software het dialoogvenster Unload Sensor Cartridge en Cell Plate weer. Klik op Uitwerpen en verwijder de celkweekmicroplaat uit de analyzer.Verwijder voorzichtig de sensorcartridge en plaats het deksel van de celplaat terug. Het dialoogvenster Test voltooid wordt weergegeven. Klik vervolgens op Resultaten weergeven om het testresultaatbestand te openen of om de gegevens te normaliseren.Nadat de test is voltooid, scant u de streepjescode van de plaat met de handheld barcodelezer. Als de plaat al is afgebeeld, is er geen nieuwe naam nodig. Selecteer Fluorescentie en celgetal.Plaats de celplaat op de ladehouder en klik op Lade sluiten. Selecteer in het venster voor het verkrijgen van afbeeldingen de optie Alle putten scannen om de beeldvorming te starten. Bekijk de fluorescerende beelden en celtellingen in de imaging- en celbeeldvormingstoepassing door willekeurig op een paar van de putten te klikken.Zodra de fluorescentiebeeldvorming is voltooid, exporteert u de afbeeldingen voor aanvullende verwijzingen. Zodra de beeldvorming en het aantal cellen zijn voltooid, opent u het resultatenbestand en klikt u op Normaliseren. Klik op Importeren en selecteer Toepassen voor de desktopsoftware om de test automatisch te normaliseren met het aantal cellen.De oligomycine A en FCCP stressor mix injectie verhoogde de baseline activiteit van de controlegroep. Stressoren vertoonden een significant hoog energieniveau in de controle- en behandelingsgroep. Aan de andere kant had behandeling twee een relatief lagere basislijnactiviteit en werden de cellen meer aeroob.De figuur geeft aan dat zowel controle- als experimentele cellen glycolyse en mitochondriale oxidatieve fosforylering gebruiken voor ATP-generatie. De experimentele groep toont een vermindering van atp-generatie via glycolyse en een toename van mitochondriale ademhaling. De basale ademhalingssnelheid in de behandelingsgroep is relatief minder dan in de controlegroep.De ademhalings- en ATP-productiesnelheden in beide groepen zijn verlaagd, samen met het protonlek gevolgd door een oligomycine A-injectie. De ademhalingssnelheden van de cellen stijgen weer naar hun maximale ademhaling na de injectie van FCCP. De laatste injectie van rotenon en antimycine A verlaagt de OCR weer.Na de derde injectie wordt de mitochondriale ademhaling uitgeschakeld door de combinatie van rotenon en antimycine A.In vergelijking met de controlegroep heeft de basale en maximale ademhaling van de behandelingsgroepen relatief geen verandering. De figuur laat zien dat de controlegroep sterk afhankelijk is van de glucoseroute, terwijl glutamineoxidatie efficiënt was in de controlegroep. De vetzuurroute laat zien dat de behandeling de totale capaciteit van de cellen heeft verhoogd.De beschikbaarheid van meerdere injectiepoorten op de zuurplaat helpt ons om het effect van meerdere geneesmiddelen op cellulaire energetica op één tijdstip te bepalen.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorteren van<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse van Metabool profiel in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing van<em&gt; BRCA2</em&gt; Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...