Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שריר-שלד ועור (NIAMS) מענק AR072123 והמכון הלאומי להזדקנות (NIA) מענק AG069795 (ל- ERR).

כל הנהלים התבססו על ההנחיות והאישור של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.
1. הכנת ריאגנטים והתקנת בדיקה
<ol><li>בידוד וגידול של תאים סטרומליים של מח עצם (ראו גם את המאמר הקודם30).<ol>
<li>הכינו מדיה מלאה של תרבית תאים ?...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת יכול לשמש כדי לחקור את האנרגטיקה התאית בתנאים שונים. הפרוטוקול ממחיש את הבידוד היעיל של BMSCs, תאי התרבות בלוחות תרבית תאים מתאימים, ואת התמיינותם לאוסטאובלסטים בוגרים, אשר יכולים לשמש לבדיקות שונות באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי. יתר על כן, השלבים הקריטיים של בד...

היווצרות העצם על ידי האוסטאובלסט מלווה בהרס מתואם או ספיגה מחדש של עצמות על ידי אוסטאוקלסטים. האיזון בין היווצרות עצם אוסטאובלסטית לבין ספיגת אוסטאוקלסט הוא תהליך מצומד המתאר תחלופת עצם או שיפוץ, החיוני להומאוסטזיס של השלד. תפקוד לקוי של אוסטאובלסט מוביל לפגיעה ביצירת העצם וגורם למחלות שונות, כולל אוסטאופורוזיס 1,2,3. התמיינות Ex vivo/in vitro של תאי גזע סטרומליים של מח עצם (BMSCs) למבשרי אוסטאובלסטים ואוסטאובלסטים בוגרים גורמת להיווצרות ותצהיר של מטריצת העצם המינרלית בכלי התרבית לאורך זמן 4,5,6. היווצרות עצם זו על ידי האוסטאובלסט דורשת כמות משמעותית של אנרגיה תאית. באופן ספציפי, הוכח כי סינתזה והפרשת קולגן מסתמכות במידה רבה על ATP תאי: יחסי ADP, וככל הנראה, סחר בשלפוחית מינרלית והפרשתם דורשים תוספת ATP 7,8,9,10,11. חוקרים רבים הראו כי התהליך של אוסטאובלסטוגנזה ותפקוד אוסטאובלסט דורש אספקה מספקת של אנרגיה כדי לענות על הדרישה המטבולית של היווצרות עצם 12,13,14,15,16. לכן, המטרה של שיטה זו היא לאפיין את המצב הביו-אנרגטי של תאים סטרומליים ראשוניים, מורין, לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת. טכניקות אלה מסייעות בפיתוח הבנה טובה יותר של הומאוסטזיס שלד, אשר עשוי להוביל בסופו של דבר לפיתוח של אפשרויות טיפוליות חדשניות המסוגלות לשפר את הפרעות השלד.
ניתן להשתמש במנתח השטף המטבולי של התאים בזמן אמת כדי למדוד את קצב צריכת החמצן (OCR) ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) של אוסטאובלסטים חיים, המתאימים לייצור ATP מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, בהתאמה. היסוד למתודולוגיה זו הוא העובדה כי יון H+ אחד לכל לקטט משתחרר במהלך הגליקוליזה בהמרה של גלוקוז לקטט, מה שמשנה את ה- pH המדיה המשתקף בערכי ECAR. לעומת זאת, במהלך מחזור TCA (חומצה טריקרבוקסילית), זרחון חמצוני באמצעות המיטוכונדריה מייצר CO2 על ידי שימוש או צריכת חמצן, ולכן ניטור OCR משקף את התהליך המטבולי הזה. המנתח מודד הן את ה-OCR והן את ה-ECAR במיקרו-סביבה החוץ-תאית בו-זמנית ובזמן אמת, מה שמאפשר פוטנציאל עצום בחקר ביו-אנרגיה תאית 6,17. בנוסף, ביצוע בדיקות אלה הוא פשוט יחסית וניתן להתאמה אישית בקלות בהתאם למטרת הניסוי. טכניקות דומות הופעלו כדי להבין עוד יותר את הוויסות המטבולי של תאי T של מערכת החיסון18,19, התחלת סרטן והתקדמות20, יחד עם סוגי תאים רבים אחרים התורמים לתסמונות מטבוליות21,22.
היתרונות של מנתח שטף מטבולי בזמן אמת על פני טכניקות חלופיות כוללים (1) את היכולת למדוד ביו-אנרגיה תאית של תאים חיים בזמן אמת, (2) יכולת לבצע בדיקה עם מספר קטן יחסית של תאים (דורשת עד 5,000 תאים), (3) יציאות הזרקה כדי לתמרן במקביל טיפולים מרובים במערכת בעלת תפוקה גבוהה של 96 קידוחים, (4) שימוש בדימוי תאים אוטומטיים נטולי תוויות רדיואקטיביות לנורמליזציה18, 23,24. השיטות הבאות נועדו לספק תיאור כללי אך מפורט של ניטור ביו-אנרגיה תאית ב-Murine BMSCs לאורך התמיינות אוסטאובלסט באמצעות המנתח. הוא יכלול בדיקות המבוצעות באופן שגרתי; עם זאת, כמו בטכניקות ושיטות רבות, מומלץ מאוד שמעבדות בודדות יקבעו פרטים ספציפיים לניסויים שלהן.
מבחר של בדיקות וסוגים שונים של בדיקות זמינות: מגוון רחב של ערכות בדיקה וריאגנטים זמינים כדי לחקור את הביו-אנרגיה של התאים תוך הבטחת האמינות והעקביות של תוצאות הניסוי. בנוסף, תוכנת שולחן העבודה מציעה גם תבניות בדיקה שניתן להתאים אישית בקלות. ניתן להגדיר את הבדיקה על סמך צרכי המשתמש למדוד פרמטרים מטבוליים שונים. ניתן לשנות מבחנים אלה בדרכים שונות על סמך המטרה הניסויית ו/או השאלה המדעית. לדוגמה, עם ארבע יציאות הזרקה, ניתן להזריק מספר תרכובות למדיית הבדיקה כדי לנתח את התגובה התאית הספציפית לכל מסלול מטבולי.
בדיקת פנוטיפ של אנרגיית התא: בדיקה זו מודדת את הפנוטיפ המטבולי של התאים החיים ואת הפוטנציאל המטבולי שלהם. בדיקה זו מומלצת גם כצעד ראשון לקבלת מושג כללי על חילוף חומרים ספציפי למסלול. תערובת של אוליגומיצין A-מעכב של ATP סינתאז וקרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פניל-הידרזון (FCCP)-סוכן מיטוכונדריאלי ללא שיתוף פעולה מוזרק כדי להבין את פוטנציאל האנרגיה של התא. הזרקת אוליגומיצין A מעכבת את הסינתזה של ATP, וכתוצאה מכך עלייה בקצב הגליקוליזה (ECAR) כדי לאפשר לתאים לעמוד בדרישות האנרגיה שלהם; מצד שני, הזרקה של FCCP גורמת ל- OCR גבוה יותר עקב דה פולריזציה של הממברנה המיטוכונדרית. בעיקרו של דבר, מבחן זה מתאר נשימה מטבולית בסיסית, ובעקבות הזריקות הכפולות, דוחף או מדגיש, את התגובה המטבולית. בהתבסס על פרמטרים אלה, התוכנה מתווה OCR ו- ECAR של התאים על ידי סיווג התאים כמצב אירובי, שקט, גליקוליטי או אנרגטי לאורך זמן25,26.
בדיקת קצב ייצור בזמן אמת של ATP: זה מודד את ייצור ה-ATP התאי בו-זמנית מגליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית. בדיקה זו מודדת באופן כמותי את השינויים המטבוליים משני מסלולי האנרגיה ומספקת נתונים על קצב הייצור של ATP המיטוכונדריה והגליקוליטי לאורך זמן. הבדיקה מקבלת נתוני OCR ו-ECAR בסיסיים ולאחר מכן חישוב קצב הייצור של ATP מיטוכונדריאלי באמצעות הזרקת אוליגומיצין A וקצב ייצור ATP גליקוליטי באמצעות הזרקת תערובת רוטנון + אנטימיצין A (עיכוב כולל של תפקוד המיטוכונדריה), וכתוצאה מכך החמצה מיטוכונדריאלית17,27.
מבחן מאמץ למיטוכונדריה של תאים (או מבחן מאמץ מיטו תאי): זה מודד את תפקוד המיטוכונדריה באמצעות נשימה הקשורה ל-ATP, מכמת ביו-אנרגיה תאית, מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ומודד את תגובת התאים ללחץ. פרמטרים שונים, כולל יכולת נשימה בסיסית ורזרבית, נשימה הקשורה ל-ATP, נשימה מקסימלית וצריכת חמצן לא מיטוכונדריאלית, ניתן לקבל בבדיקה אחת. בדיקה זו כוללת זריקות עוקבות של אוליגומיצין A, FCCP (חומר מיטוכונדריאלי לא מיתוכונדריה), תערובת של מעכבי רוטנון/אנטימיצין A כדי לנתח ביעילות את ההשפעה של אלה על תפקוד המיטוכונדריה28.
גמישות מיטו דלק flex מבחן: זה מודד את קצב הנשימה המיטוכונדרית על ידי חמצון של שלושת הדלקים המיטוכונדריים העיקריים על ידי נוכחות והיעדר המעכבים שלהם. העיכוב הרציף של גלוקוז, גלוטמין וחומצות שומן מסייע במדידת התלות, הקיבולת והגמישות של התאים והתלות של התאים במסלולים תאיים שונים כדי לענות על הביקוש לאנרגיה. כאשר המיטוכונדריה אינה יכולה לעמוד בדרישות של מסלול העניין החסום על ידי חמצון דלקים אחרים, התאים נכנסים למצב תלות. יכולתם של התאים מחושבת על ידי עיכוב של שני המסלולים החלופיים האחרים ולאחר מכן עיכוב מסלול העניין. הגמישות של התאים מסייעת בהבנת היכולת של המיטוכונדריה לפצות ולענות על צורכי הדלק של המסלול המעוכב. הוא מחושב על ידי הפחתת התלות של תאים מקיבולת התאים. שלושה מעכבים שונים משמשים באופן עצמאי או כתערובת של שניים כדי לחשב ביעילות את הפרמטרים הבדיקה. 2-ציאנו-3-(1-פניל-1H-אינדול-3-yl)-2-חומצה פרופנואית (UK5099) מעכב את חמצון הגלוקוז על ידי חסימת נשא הפירובט בגליקוליזה. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) אתיל סולפיד מעכב את מסלול החמצון של גלוטמין, ואטומוסיר מעכב את החמצון של חומצות שומן ארוכות שרשרת29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של המתודולוגיה לגידול והכנת אוסטאובלסטים לניתוח. ה-BMSCs של מורין מבודדים מעצמות ארוכות, מתרבית ונזרעים בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 25,000 תאים/בארות. התרבות תאים אלה במדיה הספציפית של אוסטאובלסט מתחילה כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-100% כדי להתחיל את התמיינותם. הבדיקות מבוצעות בשלבים שונים של בידול. צלחות המחסניות מיובשות יום אחד לפני הבדיקה. ביום הבדיקה מוזרקים מעכבים שונים ליציאות של מחסניות החיישנים על סמך דרישות הבדיקה, ונוסף מאגר כיול ללוחית הכיול של 96 הבארות. לאחר הכיול, מתבצעת בדיקת השטף המטבולי של התא בזמן אמת, ולאחר מכן הדמיה של המיקרו-פלטה של תרבית התא באמצעות הדמיית המיקרו-פלטה כדי לנרמל את נתוני מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת עם ספירת תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

היווצרות עצם על ידי אוסטאובלסטים היא תהליך חיוני לרכישת עצם נכונה ותחלופת עצם כדי לשמור על הומאוסטזיס שלד, ובסופו של דבר, למנוע שבר. מתוך אינטרס הן לייעל את מסת העצם והן להילחם במחלות שלד-שריר שונות (כלומר, אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר, אנורקסיה נרבוזה, סוכרת מסוג 1 ו-2), נעשו מאמצים מדהימים בתחום הביולוגיה של העצם לאפיין באופן מלא את האוסטאובלסטים לאורך תהליך ההתמיינות שלהם. בהתחשב בתפקידם העיקרי של אוסטאובלסטים בוגרים להפריש חלבוני מטריצה ושלפוחיות מינרליזציה, צוין כי תהליכים אלה לוקחים כמות מדהימה של אנרגיה תאית, או אדנוזין טריפוספט (ATP). מצב האנרגיה התאית הכולל מכונה לעתים קרובות ביו-אנרגיה תאית, והוא כולל סדרה של תגובות מטבוליות שחשות את זמינות המצע כדי להפיק ATP כדי לענות על הצרכים התאיים. לכן, השיטה הנוכחית מפרטת את התהליך של בידוד תאים סטרומליים ראשוניים, מח עצם מורין (BMSCs) וניטור מצבם הביו-אנרגטי באמצעות מנתח השטף המטבולי של התא בזמן אמת בשלבים שונים בהתמיינות אוסטאובלסט. חשוב לציין, נתונים אלה הראו כי הפרופיל המטבולי משתנה באופן דרמטי במהלך התמיינות אוסטאובלסט. לפיכך, שימוש בסוג תא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית זה נדרש כדי להעריך באופן מלא כיצד המצב הביו-אנרגטי של התא יכול לווסת את התפקוד הכולל.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> איור 6: גרפים מייצגים לבדיקות המבוצעות באופן שגרתי כדי להבין את הפרופיל הביו-אנרגטי התאי של קבוצת הביקורת לעומת קבוצת הטיפול עם שגיאות התקן המתאימות שלהם. העלילה מייצגת את הגליקול?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

שיטה זו שימושית בקביעת אנרגיות תאיות, כמו קצב ייצור ATP, וגם כדי לקבוע את ההעדפה התאית כלפי מטבוליט מסוים על בסיס זמן אמת. כדי להתחיל, להוסיף 200 microliters של קליברנט XF ולדגום את צלחת השירות לפחות שעה אחת לפני הבדיקה. הכן 80 מיליליטרים של מדיית בדיקת XF באמצעות תוספת XF DMEM.הפשרת אוליגומיצין A, רוטנון ואנטימיצין A על קרח. פיפט את התרכובות למעלה ולמטה כדי לבודד אותן לפני השימוש. הוסיפו שלושה מיליליטרים של מדיום בדיקה מוכן לכל צינור, המסומנים A ו-B.הוסיפו 26.4 מיקרוליטרים של 2.5 מילימולר אוליגומיצין A לתוך צינור A ו-3.1 מיקרוליטרים של רוטנון 12.67 מילימולאר, 4.1 מיקרוליטרים של 9.4 אנטימיצין מילימולרי A, ו-30 כתם של הוק מיקרוליטר לתוך שפופרת B.טענו ריכוז של פי 10 של מעכבים אלה ביציאת ההזרקה המתאימה.ולבסוף, 20 מיקרוליטרים של תרכובות אלה יועמסו לתוך התאים ב -200 מיקרוליטרים של מדיה בדיקה. הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מחממת 37 מעלות צלזיוס והתבונן בתאים שמתחת למיקרוסקופ. מוציאים את מדיום הבדיקה מאמבט המים.שטפו בעדינות את התאים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה שחומם מראש פעמיים, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיית בדיקה לכל באר. בדקו את התאים שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נשארים דבוקים לבארות. יש לוודא שהתאים בבארות D5 ו-E8 נדבקים לחד-שכבתי עקבי ולא נשטפו במהלך שלב הכביסה.תוכנת הדמיית תאים משתמשת בשתי בארות אלה להגדרת המיקוד האוטומטי והחשיפה האוטומטית. פתח את תוכנת שולחן העבודה במחשב שליד הציוד. בדוק את מצב החיבור בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת הבקר.עבור אל תבניות ובחר את תבנית בדיקת קצב ה- ATP של XF או את תבנית הבדיקה המתאימה. בחר הגדרות קבוצה בחלק העליון של המסך והגדר את הקבוצות. בחר את פריסת מפת הלוח והקצה את הבארות בהתאם לקבוצות שהוגדרו.אמת את פרוטוקול המכשיר. ודא שהתרכובות שנוספו מפורטות כהלכה וכולל את פרטי הפרוייקט עבור הפניות עתידיות. לחץ על הפעל Assay.פעולה זו תבקש את הבחירה של מיקום אחסון הקבצים של התוצאה. בחר את המיקום כדי לשמור את קובץ התוצאה. שמור את הקובץ עם תאריך הבדיקה ולחץ על התחל הפעלה.הנח את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות על המגש ולחץ על אני מוכן להתחיל את הכיול. פתח את תוכנת ההדמיה של התאים במחשב. ודא שהתמונה של המיקרו-פלטה מופעלת והיציאות מחוברות למחשב.בדוק את שורת המצב בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לוודא שהטמפרטורה מוגדרת ל- 37 מעלות צלזיוס ושמצב החיבור צריך להיות מודגש בירוק כמוכן. סרוק את ברקוד הצלחת כדי להתחיל בתהליך ההדמיה. ספק שם ללוחית התא ולחץ על שמור.תמונות ברייטפילד ופלורסנט יישמרו כאן. לחץ על בצע סריקת Brightfield, ובמסך הבא, תפריט צלחת וסריקה הצג את האפשרויות להדמיה. לפני הבדיקה, בחר התחל סריקת ברייטפילד.הניחו את המיקרו-פלטה של תרבית התא ואת כיסוי הצלחת על מחזיק המגש והתיישרו היטב A1 עם הסימן A1. לחץ על סגור מגש. רכישת תמונה של ברייטפילד מופיעה במסך הבא עם מפת לוח.לחץ על סרוק את כל הבארות וסרוק במשך 30 עד 35 דקות. עם השלמת הכיול, התוכנה מציגה את תיבת הדו-שיח Load Cell Plate. לאחר מכן, לחץ על פתח מגש כדי להחליף את מגש השירות במיקרו-פלטה של תרבית תאים.שים לב שצלחת תרבית התאים נמצאת בתמונה של מיקרו-פלטה. לאחר הסריקה, הסר את המיקרו-פלטה של תרבית התא והנח אותה במנתח כדי לבצע את הבדיקה. לאחר מכן, לחץ על טען צלחת תא כדי ליזום את הבדיקה.המתן עד לתחילת הבדיקה והצג את זמן הסיום המשוער. עם השלמת הבדיקה, התוכנה מציגה את מחסנית חיישן הפריקה ואת תיבת הדו-שיח של לוח התא. לחץ על פלטה והסר את המיקרו-פלטה של תרבית התאים מהמנתח.הסר בזהירות את מחסנית החיישן והחלף את מכסה לוחית התא. מופיעה תיבת הדו-שיח 'בדיקה מלאה'. לאחר מכן, לחץ על הצג תוצאות כדי לפתוח את קובץ תוצאת הבדיקה או כדי לנרמל את הנתונים.לאחר השלמת הבדיקה, סרוק את ברקוד הצלחת עם קורא הברקוד הידני. אם הצלחת כבר צולמה, היא לא תדרוש שם חדש. בחר פלואורסצנציה וספירת תאים.הניחו את צלחת התא על מחזיק המגש ולחצו על 'סגור מגש'. בחלון רכישת התמונה, בחר סרוק את כל הבארות כדי להתחיל בהדמיה. סקור את התמונות הפלואורסצנטיות ואת ספירת התאים ביישום ההדמיה וההדמיה של התאים על ידי לחיצה אקראית על כמה מהבארות.לאחר השלמת ההדמיה הפלואורסצנטית, ייצא את התמונות להפניות נוספות. לאחר השלמת ההדמיה וספירת התאים, פתח את קובץ התוצאות ולחץ על Normalize. לחץ על ייבוא ובחר הגש בקשה לתוכנת שולחן העבודה כדי לנרמל את הבדיקה באמצעות ספירת תאים באופן אוטומטי.זריקת תערובת הלחץ של אוליגומיצין A ו-FCCP הגבירה את הפעילות הבסיסית של קבוצת הביקורת. גורמי הלחץ הראו רמת אנרגיה גבוהה משמעותית בקבוצת הבקרה והטיפול בקבוצה אחת. מצד שני, לטיפול השני הייתה פעילות בסיסית נמוכה יחסית, והתאים נעשו אירוביים יותר.האיור מצביע על כך שגם תאי בקרה וגם תאי ניסוי משתמשים בגליקוליזה ובזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי לייצור ATP. קבוצת הניסוי מציגה ירידה בייצור ATP באמצעות גליקוליזה ועלייה בנשימה המיטוכונדרית. שיעור הנשימה הבסיסי בקבוצת הטיפול נמוך יחסית לקבוצת הביקורת.קצבי הנשימה וייצור ה-ATP בשתי הקבוצות יורדים, יחד עם דליפת הפרוטונים ואחריה זריקת אוליגומיצין A. שיעורי הנשימה של התאים עולים שוב לנשימה המקסימלית שלהם לאחר הזרקת FCCP. ההזרקה הסופית של רוטנון ואנטימיצין A מקטינה שוב את ה-OCR.לאחר הזריקה השלישית, הנשימה המיטוכונדרית נסגרת על ידי שילוב של רוטנון ואנטימיצין A.בהשוואה לקבוצת הביקורת, הנשימה הבסיסית והמקסימלית של קבוצות הטיפול כמעט ואינה משתנה. האיור מראה שקבוצת הביקורת תלויה מאוד במסלול הגלוקוז, בעוד שחמצון גלוטמין היה יעיל בקבוצת הביקורת. מסלול חומצות השומן מראה כי הטיפול הגדיל את הקיבולת הכוללת של התאים.הזמינות של יציאות הזרקה מרובות על צלחת החומצה מסייעת לנו לקבוע את ההשפעה של תרופות מרובות על אנרגיות תאיות בנקודת זמן אחת.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

מיון של<em&gt; Streptomyces</em&gt; פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...