Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 e National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (a ERR).

Tutte le procedure si basavano sulle linee guida e sull'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il centro medico della Vanderbilt University.
1. Preparazione dei reagenti e impostazione del saggio
<ol><li>Isolamento e coltivazione di cellule stromali del midollo osseo (vedi anche il precedente articolo30).<ol>
<li>Preparare terreni di coltura cellulare alfa minimi essenziali (αMEM) completi integrando i mezzi ...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per esplorare l'energetica cellulare in diverse condizioni. Il protocollo illustra l'isolamento efficiente delle BMSC, la coltura delle cellule in piastre di coltura cellulare appropriate e la loro differenziazione in osteoblasti maturi, che possono essere utilizzati per vari saggi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Inoltre, vengono spiegate in dettaglio anche le fasi critiche del test del flusso metabolico cellulare in...

La formazione dell'osso da parte dell'osteoblasto è accompagnata da distruzione coordinata o riassorbimento delle ossa da parte degli osteoclasti. L'equilibrio tra formazione ossea osteoblastica e riassorbimento osteoclasto è un processo accoppiato che descrive il turnover osseo o il rimodellamento, che è essenziale per l'omeostasi scheletrica. La disfunzione degli osteoblasti porta a una compromissione della formazione ossea e provoca varie malattie, tra cui l'osteoporosi 1,2,3. La differenziazione ex vivo/in vitro delle cellule staminali stromali del midollo osseo (BMSC) in precursori di osteoblasti e osteoblasti maturi provoca la formazione e la deposizione della matrice ossea mineralizzata nel vaso di coltura nel tempo 4,5,6. Questa formazione ossea da parte dell'osteoblasto richiede una quantità significativa di energia cellulare. In particolare, la sintesi e la secrezione di collagene hanno dimostrato di fare molto affidamento sull'ATP cellulare: i rapporti ADP e, presumibilmente, il traffico e la secrezione di vescicole mineralizzate richiedono ulteriore ATP 7,8,9,10,11. Molti ricercatori hanno dimostrato che il processo di osteoblastogenesi e la funzione degli osteoblasti richiede un adeguato apporto di energia per soddisfare la domanda metabolica di formazione ossea 12,13,14,15,16. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare lo stato bioenergetico delle cellule stromali murine primarie attraverso la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale. Queste tecniche aiutano a sviluppare una migliore comprensione dell'omeostasi scheletrica, che può alla fine portare allo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche in grado di migliorare i disturbi scheletrici.
L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) degli osteoblasti vivi, che corrisponde rispettivamente alla produzione di ATP mitocondriale e glicolitico. Fondamentale per questa metodologia è il fatto che uno ione H + per lattato viene rilasciato durante la glicolisi nella conversione del glucosio in lattato, che altera il pH del mezzo riflesso nei valori ECAR. Al contrario, durante il ciclo TCA (acido tricarbossilico), la fosforilazione ossidativa attraverso i mitocondri produce CO2 utilizzando o consumando ossigeno, e quindi il monitoraggio dell'OCR riflette questo processo metabolico. L'analizzatore misura sia l'OCR che l'ECAR nel microambiente extracellulare contemporaneamente e in tempo reale, il che consente un enorme potenziale quando si studia la bioenergetica cellulare 6,17. Inoltre, l'esecuzione di questi test è relativamente semplice e facilmente personalizzabile a seconda dell'obiettivo sperimentale. Tecniche simili sono state impiegate per comprendere ulteriormente la regolazione metabolica delle cellule T del sistema immunitario18,19, l'inizio del cancro e la progressione20, insieme a più altri tipi di cellule che contribuiscono alle sindromi metaboliche21,22.
I vantaggi dell'analizzatore di flusso metabolico in tempo reale rispetto alle tecniche alternative includono (1) la capacità di misurare la bioenergetica cellulare delle cellule vive in tempo reale, (2) la capacità di eseguire test con un numero relativamente piccolo di cellule (richiede un minimo di 5.000 cellule), (3) porte di iniezione per manipolare parallelamente più trattamenti in un sistema ad alto rendimento a 96 pozzetti, (4) l'uso di imager di cellule automatizzate prive di etichette radioattive per la normalizzazione18, 23,24. I seguenti metodi mirano a fornire una descrizione generalizzata ma dettagliata del monitoraggio della bioenergetica cellulare nelle BMSC murine durante la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore. Includerà saggi eseguiti di routine; tuttavia, come per molte tecniche e metodi, è altamente incoraggiato che i singoli laboratori determinino dettagli specifici per i loro esperimenti.
Selezione di saggi e diversi tipi di saggi disponibili: È disponibile un'ampia varietà di kit di analisi e reagenti per studiare la bioenergetica delle cellule, garantendo al contempo l'affidabilità e la coerenza dei risultati sperimentali. Inoltre, il software desktop offre anche modelli di analisi che possono essere facilmente personalizzati. Il test può essere definito in base alle esigenze dell'utente di misurare diversi parametri metabolici. Questi saggi possono essere modificati in vari modi in base all'obiettivo sperimentale e/o alla domanda scientifica. Ad esempio, con quattro porte di iniezione, è possibile iniettare più composti nel mezzo di analisi per analizzare la risposta cellulare specifica per ciascuna via metabolica.
Test del fenotipo dell'energia cellulare: Questo test misura il fenotipo metabolico e il potenziale metabolico delle cellule vive. Questo test è anche raccomandato come primo passo per avere un'idea generalizzata del metabolismo specifico del percorso. Una miscela di oligomicina A-an inibitore di ATP sintasi e Carbonil cianuro 4-(trifluorometoossi) fenilidrazone (FCCP) - un agente di disaccoppiamento mitocondriale viene iniettato per comprendere il potenziale energetico cellulare. L'iniezione di oligomicina A inibisce la sintesi di ATP, con conseguente aumento del tasso di glicolisi (ECAR) per consentire alle cellule di soddisfare le loro richieste energetiche; d'altra parte, l'iniezione di FCCP si traduce in un OCR più elevato a causa della depolarizzazione della membrana mitocondriale. Essenzialmente, questo test raffigura la respirazione metabolica basale e, a seguito delle doppie iniezioni, spinte o stress, la risposta metabolica. Sulla base di questi parametri, il software traccia quindi OCR ed ECAR delle cellule classificando le cellule come stato aerobico, quiescente, glicolitico o energetico nel tempo25,26.
Saggio del tasso di produzione in tempo reale ATP: Questo misura la produzione cellulare di ATP contemporaneamente dalla glicolisi e dalla respirazione mitocondriale. Questo test misura quantitativamente i cambiamenti metabolici dalle due vie energetiche e fornisce dati sui tassi di produzione di ATP mitocondriale e glicolitico nel tempo. Il test ottiene dati basali OCR ed ECAR seguiti dal calcolo del tasso di produzione di ATP mitocondriale attraverso l'iniezione di oligomicina A e il tasso di produzione di ATP glicolitico attraverso l'iniezione di rotenone + antimicina A miscela (inibizione totale della funzione mitocondriale), con conseguente acidificazione mitocondriale17,27.
Test da sforzo dei mitocondri cellulari (o test da sforzo mito cellulare): Questo misura la funzione mitocondriale attraverso la respirazione legata all'ATP, quantifica la bioenergetica cellulare, identifica la disfunzione mitocondriale e misura la risposta delle cellule allo stress. Vari parametri, tra cui la capacità respiratoria basale e di riserva, la respirazione legata all'ATP, la respirazione massima e il consumo di ossigeno non mitocondriale, possono essere ottenuti in un unico test. Questo test prevede iniezioni sequenziali di oligomicina A, FCCP (agente di disaccoppiamento mitocondriale), una miscela di inibitori del rotenone/antimicina A per analizzare in modo efficiente l'effetto di questi sulla funzione mitocondriale28.
Flessibilità mito fuel flex test: Questo misura il tasso di respirazione mitocondriale dall'ossidazione dei tre combustibili mitocondriali primari dalla presenza e dall'assenza dei loro inibitori. L'inibizione sequenziale di glucosio, glutammina e acidi grassi aiuta a misurare la dipendenza, la capacità e la flessibilità delle cellule e la dipendenza delle cellule in vari percorsi cellulari per soddisfare la domanda di energia. Quando i mitocondri non possono soddisfare le richieste del percorso bloccato di interesse ossidando altri combustibili, le cellule entrano in uno stato di dipendenza. La capacità delle cellule è calcolata dall'inibizione delle altre due vie alternative seguite dall'inibizione della via di interesse. La flessibilità delle cellule aiuta a comprendere la capacità dei mitocondri di compensare e soddisfare il fabbisogno di carburante della via inibita. Viene calcolato sottraendo la dipendenza delle cellule dalla capacità delle celle. Tre diversi inibitori vengono utilizzati indipendentemente o come miscela di due per calcolare efficacemente i parametri del saggio. L'acido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico (UK5099) inibisce l'ossidazione del glucosio bloccando il vettore piruvato nella glicolisi. Bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) solfuro di etile inibisce la via di ossidazione della glutammina ed etomoxir inibisce l'ossidazione degli acidi grassi a catena lunga29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della metodologia per la coltivazione e la preparazione degli osteoblasti per l'analisi. I BMSC murini sono isolati dalle ossa lunghe, coltivati e seminati in piastre a 96 pozzetti a 25.000 cellule / densità del pozzo. La coltura di queste cellule in mezzi specifici per osteoblasti viene avviata quando raggiungono l'80% -100% di confluenza per iniziare la loro differenziazione. I saggi vengono eseguiti in diverse fasi di differenziazione. Le piastre della cartuccia vengono idratate un giorno prima del test. Il giorno del test, diversi inibitori vengono iniettati nelle porte delle cartucce del sensore in base ai requisiti del test e un buffer di calibrazione viene aggiunto alla piastra di calibrazione a 96 pozzetti. Dopo la calibrazione, viene eseguito il test del flusso metabolico cellulare in tempo reale, seguito dall'imaging della micropiastra di coltura cellulare utilizzando l'imager a micropiastre per normalizzare i dati dell'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale con il conteggio cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

La formazione ossea da parte degli osteoblasti è un processo essenziale per una corretta acquisizione ossea e il turnover osseo per mantenere l'omeostasi scheletrica e, in definitiva, prevenire la frattura. Nell'interesse sia di ottimizzare la massa ossea di picco che di combattere varie malattie muscoloscheletriche (ad esempio, osteoporosi post-menopausale, anoressia nervosa, diabete mellito di tipo 1 e 2), sono stati fatti sforzi incredibili nel campo della biologia ossea per caratterizzare completamente gli osteoblasti durante tutto il loro processo di differenziazione. Dato il ruolo primario degli osteoblasti maturi per secernere proteine della matrice e vescicole di mineralizzazione, è stato notato che questi processi richiedono un'incredibile quantità di energia cellulare, o adenosina trifosfato (ATP). Lo stato energetico cellulare complessivo è spesso indicato come bioenergetica cellulare e include una serie di reazioni metaboliche che rilevano la disponibilità del substrato a derivare ATP per soddisfare le esigenze cellulari. Pertanto, l'attuale metodo descrive in dettaglio il processo di isolamento delle cellule stromali primarie del midollo osseo murino (BMSC) e il monitoraggio del loro stato bioenergetico utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale in varie fasi della differenziazione degli osteoblasti. È importante sottolineare che questi dati hanno dimostrato che il profilo metabolico cambia drasticamente durante la differenziazione degli osteoblasti. Pertanto, è necessario utilizzare questo tipo di cellula fisiologicamente rilevante per apprezzare appieno come lo stato bioenergetico di una cellula possa regolare la funzione complessiva.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figura 6: Grafici rappresentativi per i saggi eseguiti di routine per comprendere il profilo bioenergetico cellulare del gruppo di controllo rispetto al gruppo di trattamento con i rispettivi errori standard. (A) Il test del fenotipo dell'energia cellulare. Il grafico rappresenta la glicolisi (ECAR) vs. respirazione mitocondr...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Questo metodo è utile per determinare l'energetica cellulare, come il tasso di produzione di ATP, e anche per determinare la preferenza cellulare verso un particolare metabolita in tempo reale. Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di calibrante XF e incubare la piastra di utilità per almeno un'ora prima del test. Preparare 80 millilitri di supporti di analisi XF utilizzando XF DMEM integrato.Scongelare oligomicina A, rotenone e antimicina A sul ghiaccio. Pipettare i composti su e giù per solubilizzarli prima dell'uso. Aggiungere tre millilitri di mezzo di saggio preparato a ciascun tubo, etichettati A e B.Aggiungere 26,4 microlitri di oligomicina A da 2,5 millimolari nel tubo A e 3,1 microlitri di 12,67 millimolare rotenone, 4,1 microlitri di antimicina A millimolare e 30 microlitri la colorazione di Hook nel tubo B.Caricare una concentrazione 10x di questi inibitori nella porta di iniezione corrispondente.E infine, 20 microlitri di questi composti saranno caricati nelle cellule in 200 microlitri di mezzi di analisi. Rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'incubatore a 37 gradi Celsius e osservare le cellule al microscopio. Rimuovere il mezzo di analisi dal bagno d'acqua.Lavare delicatamente le cellule con 200 microlitri di mezzo di saggio preriscaldato due volte e aggiungere 200 microlitri di mezzi di saggio per pozzetto. Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule rimangano aderenti ai pozzetti. Assicurarsi che le celle nei pozzetti D5 ed E8 siano rispettate con un monostrato coerente e non siano state lavate via durante la fase di lavaggio.Il software di imaging cellulare utilizza questi due pozzetti per impostare la messa a fuoco automatica e l'esposizione automatica. Aprire il software desktop nel computer accanto all'apparecchiatura. Controllare lo stato della connessione nell'angolo in basso a sinistra del software del controller.Vai a Modelli e seleziona il modello di analisi della velocità ATP XF o il modello di test appropriato. Selezionare Definizioni di gruppo nella parte superiore dello schermo e definire i gruppi. selezionare il layout della mappa delle piastre e assegnare i pozzetti in base ai gruppi definiti.Verificare il protocollo dello strumento. Assicurarsi che i composti aggiunti siano elencati correttamente e includere le informazioni sul progetto per i riferimenti futuri. Fare clic su Esegui test.Ciò richiederà la selezione del percorso di archiviazione del file dei risultati. Selezionare il percorso in cui salvare il file dei risultati. Salvare il file con la data del test e fare clic su Avvia esecuzione.Posizionare la cartuccia del sensore e la piastra di utilità sul vassoio e fare clic su Sono pronto per avviare la calibrazione. Aprire il software di imaging cellulare sul computer. Assicurarsi che l'imager micropiastra sia acceso e che le porte siano collegate al computer.Controllare la barra di stato in basso a sinistra dello schermo per assicurarsi che la temperatura sia impostata su 37 gradi Celsius e che lo stato della connessione sia evidenziato in verde come pronto. Eseguire la scansione del codice a barre della piastra per avviare il processo di imaging. Fornisci un nome alla piastra cellulare e premi Salva.Le immagini Brightfield e fluorescenti verranno salvate qui. Fare clic su Esegui scansione Brightfield e, nella schermata successiva, Plate e Scan Menu mostrano le opzioni per l'imaging. Prima del test, selezionare Avvia scansione Brightfield.Posizionare la micropiastra di coltura cellulare e il coperchio della piastra sul supporto del vassoio e allineare bene A1 con il marchio A1. Fare clic su Chiudi vassoio. L'acquisizione di immagini Brightfield viene visualizzata nella schermata successiva con una mappa delle lastre.Fare clic su Scan All Wells e scansionare per 30-35 minuti. Al termine della calibrazione, il software visualizza la finestra di dialogo Load Cell Plate. Quindi, fare clic su Apri vassoio per sostituire il vassoio di utilità con una micropiastra di coltura cellulare.Si noti che la piastra di coltura cellulare si trova nell'imager micropiastra. Dopo la scansione, rimuovere la micropiastra di coltura cellulare e posizionarla nell'analizzatore per eseguire il test. Quindi, fare clic su Load Cell Plate per avviare il test.Attendere l'avvio del test e visualizzare il tempo di completamento stimato. Al termine del test, il software visualizza la finestra di dialogo Scarica cartuccia sensore e piastra cellulare. Fare clic su Espellere e rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'analizzatore.Rimuovere con attenzione la cartuccia del sensore e sostituire il coperchio della piastra cellulare. Viene visualizzata la finestra di dialogo Analisi completa. Quindi, fare clic su Visualizza risultati per aprire il file dei risultati del test o per normalizzare i dati.Dopo il completamento del test, eseguire la scansione del codice a barre della piastra con il lettore di codici a barre portatile. Se la targa è già stata fotografata, non richiederà un nuovo nome. Selezionare Fluorescenza e Conteggio celle.Posizionare la piastra cellulare sul supporto del vassoio e fare clic su Chiudi vassoio. Nella finestra di acquisizione delle immagini, selezionare Scansiona tutti i pozzetti per iniziare l'imaging. Esamina le immagini fluorescenti e i conteggi cellulari nell'applicazione di imaging e imaging cellulare facendo clic in modo casuale su un paio di pozzetti.Una volta completata l'imaging a fluorescenza, esportare le immagini per ulteriori riferimenti. Una volta completata l'imaging e il conteggio delle cellule, apri il file dei risultati e fai clic su Normalizza. Fare clic su Importa e selezionare Applica per il software desktop per normalizzare automaticamente il test con il conteggio delle celle.L'iniezione di oligomicina A e miscela di fattori di stress FCCP ha aumentato l'attività basale del gruppo di controllo. I fattori di stress hanno mostrato un livello di energia significativamente elevato nel controllo e nel trattamento di un gruppo. D'altra parte, il trattamento due aveva un'attività basale relativamente più bassa e le cellule diventavano più aerobiche.La figura indica che sia le cellule di controllo che quelle sperimentali utilizzano la glicolisi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale per la generazione di ATP. Il gruppo sperimentale mostra una riduzione della generazione di ATP attraverso la glicolisi e un aumento della respirazione mitocondriale. La frequenza respiratoria basale nel gruppo di trattamento è relativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo.I tassi di respirazione e produzione di ATP in entrambi i gruppi sono diminuiti, insieme alla perdita di protoni seguita da un'iniezione di oligomicina A. I tassi di respirazione delle cellule risalgono di nuovo alla loro respirazione massima dopo l'iniezione di FCCP. L'iniezione finale di rotenone e antimicina A diminuisce nuovamente l'OCR.Dopo la terza iniezione, la respirazione mitocondriale viene interrotta dalla combinazione di rotenone e antimicina A.Rispetto al gruppo di controllo, la respirazione basale e massimale dei gruppi di trattamento non ha relativamente alcun cambiamento. La figura mostra che il gruppo di controllo è altamente dipendente dalla via del glucosio, mentre l'ossidazione della glutammina era efficiente nel gruppo di controllo. La via degli acidi grassi mostra che il trattamento ha aumentato la capacità complessiva delle cellule.La disponibilità di più porte di iniezione sulla piastra acida ci aiuta a determinare l'effetto di più farmaci sull'energetica cellulare in un singolo punto temporale.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Ordinamento dei<em&gt; Streptomyces</em&gt; Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analisi di profilo metabolico in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture del mouse intestinale Cripta organoide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing di<em&gt; BRCA2</em&gt; Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...