Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所(NIH)国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)グラントAR072123および国立加齢研究所(NIA)グラントAG069795(ERRへ)の支援を受けた。

すべての手順は、ヴァンダービルト大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に基づいていました。
1. 試薬の調製とアッセイのセットアップ
<ol><li>骨髄間質細胞の単離および培養(前項30も参照)。<ol>
<li>10%FBS(ウシ胎児血清)、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンでアルファ修飾で最小必?...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

リアルタイムの細胞代謝フラックス分析装置は、さまざまな条件下で細胞エネルギーを探索するために使用できます。このプロトコルは、BMSCの効率的な単離、適切な細胞培養プレートでの細胞の培養、および成熟骨芽細胞への分化を示しており、細胞外フラックス分析装置を使用したさまざまなアッセイに使用できます。さらに、センサーカートリッジの水和、注入ポートの装填、アッセイ...

骨芽細胞による骨の形成は、破骨細胞による骨の協調的な破壊または再吸収を伴う。骨芽球性骨形成と破骨細胞再吸収との間のバランスは、骨格恒常性維持に不可欠な骨代謝回転またはリモデリングを記述する結合プロセスである。骨芽細胞機能障害は、骨形成の障害をもたらし、骨粗鬆症を含む様々な疾患をもたらす1,2,3。骨髄間質幹細胞(BMSC)から骨芽細胞前駆体および成熟骨芽細胞へのエクスビボ/インビトロ分化は、経時的に培養容器内の石灰化骨マトリックスの形成および沈着をもたらす4,5,6。骨芽細胞によるこの骨形成は、かなりの量の細胞エネルギーを必要とする。具体的には、コラーゲン合成および分泌は、細胞ATP:ADP比に大きく依存することが示されており、おそらく、石灰化小胞の輸送および分泌は、追加のATP7、8、9、10、11を必要とする。多くの研究者は、骨芽細胞形成および骨芽細胞機能のプロセスが、骨形成の代謝需要を満たすために十分なエネルギー供給を必要とすることを実証している12,13,14,15,16。したがって、この方法の目標は、リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を用いて骨芽細胞分化全体を通して初代マウス間質細胞の生体エネルギー状態を特徴付けることである。これらの技術は、骨格恒常性の理解を深めるのに役立ち、最終的には骨格障害を改善することができる新規な治療選択肢の開発につながる可能性がある。
リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置は、それぞれミトコンドリアおよび解糖系ATP産生に対応する生骨芽細胞の酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)を測定するために使用することができる。この方法論の基本的なことは、グルコースから乳酸への変換において解糖系中に乳酸塩あたり1つのH+イオンが放出され、ECAR値に反映された媒体pHを変化させるという事実である。逆に、TCA(トリカルボン酸)サイクルの間、ミトコンドリアを介した酸化的リン酸化は、酸素を利用または消費することによってCO2を生成するため、OCRのモニタリングはこの代謝プロセスを反映している。このアナライザは、細胞外微小環境におけるOCRとECARの両方を同時にリアルタイムで測定するため、細胞の生体エネルギーを研究する際に大きな可能性を秘めています6,17。さらに、これらのアッセイの実行は比較的簡単で、実験目標に応じて簡単にカスタマイズできます。同様の技術が、免疫系18、19、癌開始、および進行20のT細胞代謝調節を、メタボリックシンドローム21、22に寄与する複数の他の細胞型とともにさらに理解するために採用されている。
代替技術に対するリアルタイム代謝フラックス分析装置の利点には、(1)生細胞の細胞生体エネルギーをリアルタイムで測定する能力、(2)比較的少数の細胞でアッセイを行う能力(5,000細胞という低い細胞が必要)、(3)ハイスループット96ウェルシステムで複数の治療を並行して操作する注入ポート、(4)正規化のための放射性ラベルフリー自動細胞イメージャの使用18、23,24。以下の方法は、分析装置を用いた骨芽細胞分化全体を通してマウスBMSCにおける細胞生体エネルギー学のモニタリングに関する一般化されたが詳細な説明を提供することを目的としている。これには、日常的に行われるアッセイが含まれます。ただし、多くの手法や方法と同様に、個々のラボが実験の具体的な詳細を決定することを強くお勧めします。
アッセイの選択と利用可能なさまざまな種類のアッセイ:実験結果の信頼性と一貫性を確保しながら、細胞の生体エネルギー学を研究するために、多種多様なアッセイキットと試薬が利用可能です。さらに、デスクトップソフトウェアは、簡単にカスタマイズできるアッセイテンプレートも提供します。アッセイは、異なる代謝パラメータを測定するユーザのニーズに基づいて定義することができる。これらのアッセイは、実験目標および/または科学的質問に基づいて様々な方法で修正することができる。例えば、4つの注入ポートを用いて、複数の化合物をアッセイ培地に注入して、各代謝経路に特異的な細胞応答を分析することができる。
細胞エネルギー表現型試験:このアッセイは、生細胞の代謝表現型および代謝能を測定する。このアッセイは、経路特異的代謝の一般化されたアイデアを得るための第一歩としても推奨されます。ATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンA-と、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)-の混合物を注入し、細胞エネルギーポテンシャルを理解する。オリゴマイシンAの注射は、ATPの合成を阻害し、細胞がエネルギー需要を満たすことを可能にする解糖系(ECAR)の割合を増加させる。一方、FCCPの注射は、ミトコンドリア膜の脱分極のためにより高いOCRをもたらす。本質的に、このアッセイは、基礎代謝呼吸、および二重注射、プッシュ、またはストレスに続く代謝応答を描写する。これらのパラメータに基づいて、ソフトウェアは、細胞を経時的に好気的、静止状態、解糖系、またはエネルギー状態として分類することによって、細胞のOCRおよびECARをプロットする25,26。
ATPリアルタイム生産速度アッセイ: これは、解糖系およびミトコンドリア呼吸からの細胞ATP産生を同時に測定する。このアッセイは、2つのエネルギー経路からの代謝シフトを定量的に測定し、経時的なミトコンドリアおよび解糖系ATP産生速度に関するデータを提供する。アッセイは、基礎OCRおよびECARデータを取得し、続いて、オリゴマイシンAの注射によるミトコンドリアATP産生速度およびロテノン+アンチマイシンA混合物の注射による解糖系ATP産生速度(ミトコンドリア機能の総阻害)を計算し、ミトコンドリア酸性化をもたらす17、27。
細胞ミトコンドリアストレス試験(または細胞ミトストレス試験):これは、ATP結合呼吸を介してミトコンドリア機能を測定し、細胞の生体エネルギー学を定量化し、ミトコンドリア機能不全を同定し、ストレスに対する細胞の応答を測定する。基礎呼吸能力および予備呼吸能力、ATP結合呼吸、最大呼吸、および非ミトコンドリア酸素消費を含む様々なパラメータを、1つのアッセイで得ることができる。このアッセイは、オリゴマイシンA、FCCP(ミトコンドリア脱共役剤)、ロテノン/アンチマイシンA阻害剤の混合物の逐次注射を含み、ミトコンドリア機能に対するこれらの影響を効率的に分析する28。
柔軟性水戸燃料フレックステスト: これは、それらの阻害剤の有無による3つの主要なミトコンドリア燃料の酸化によるミトコンドリア呼吸数を測定する。グルコース、グルタミン、および脂肪酸の逐次阻害は、エネルギー需要を満たすために、細胞の依存性、容量、および柔軟性、ならびに様々な細胞経路における細胞の依存性を測定するのに役立つ。ミトコンドリアが他の燃料を酸化することによって目的の経路の遮断された要求を満たすことができないとき、細胞は依存状態に入る。細胞の容量は、他の2つの代替経路の阻害とそれに続く目的の経路の阻害によって計算される。細胞の柔軟性は、ミトコンドリアが阻害された経路の燃料ニーズを補償し、満たす能力を理解するのに役立ちます。これは、細胞の容量から細胞の依存性を差し引くことによって計算されます。3つの異なる阻害剤を独立して、または2つの混合物として使用して、アッセイパラメータを効果的に計算する。2-シアノ-3-(1-フェニル-1H-インドール-3-イル)-2-プロペン酸(UK5099)は、解糖系中のピルビン酸担体を遮断することによってグルコースの酸化を阻害する。ビス−2−(5−フェニルアセトアミド−1,3,4−チアジアゾール−2−イル)(BPTES)エチルスルフィドはグルタミン酸化経路を阻害し、エトモキシルは長鎖脂肪酸の酸化を阻害する29。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> 図1:分析のために骨芽細胞を培養および調製するための方法論の概略図。 マウスBMSCは長骨から単離され、培養され、25,000細胞/ウェル密度で96ウェルプレートに播種される。これらの細胞を骨芽細胞特異的培地中で培養することは、それらが80%〜100%コンフルエントに達したときに開始され、それらの分化を開始する。アッセイは、分化の異なる段階で行われる。カートリッジプレートをアッセイの1日前に水和させる。アッセイ当日、アッセイ要件に基づいて異なる阻害剤をセンサーカートリッジのポートに注入し、校正バッファーを96ウェル校正プレートに添加します。較正後、リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイが行われ、続いてマイクロプレートイメージャを用いて細胞培養マイクロプレートを画像化することにより、リアルタイム細胞代謝フラックス分析計データを細胞数で正規化する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

骨芽細胞による骨形成は、骨格の恒常性を維持し、最終的には骨折を防ぐために、適切な骨獲得と骨代謝回転に不可欠なプロセスです。ピーク骨量を最適化し、様々な筋骨格疾患(すなわち、閉経後骨粗鬆症、神経性食欲不振、1型および2型真性糖尿病)と戦うために、骨生物学の分野では、骨芽細胞の分化プロセス全体にわたって完全に特徴付けるための信じられないほどの努力がなされてきた。マトリックスタンパク質および石灰化小胞を分泌する成熟骨芽細胞の主な役割を考えると、これらのプロセスは信じられないほどの量の細胞エネルギー、またはアデノシン三リン酸(ATP)を必要とすることが注目されている。全体的な細胞エネルギー状態は、しばしば細胞生体エネルギー学と呼ばれ、細胞のニーズを満たすためにATPを導出するための基質の利用可能性を感知する一連の代謝反応を含む。したがって、現在の方法は、初代マウス骨髄間質細胞(BMSC)を単離し、骨芽細胞分化の様々な段階でリアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用してそれらの生体エネルギー状態を監視するプロセスを詳述する。重要なことに、これらのデータは、代謝プロファイルが骨芽細胞分化を通して劇的に変化することを実証した。したがって、この生理学的に関連する細胞型を使用することは、細胞の生体エネルギー状態が全体的な機能を調節する方法を十分に理解するために必要である。

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> 図6:対照対処置群の細胞生体エネルギープロファイルをそれらのそれぞれの標準誤差とともに理解するために日常的に実施されるアッセイのための代表的なグラフ。プロットは、対照対2つの治療群(n = 3)の解糖系(ECAR)対ミトコンドリア呼吸(OCR)を...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

この方法は、ATP産生速度のような細胞エネルギーを決定するのに役立ち、また、特定の代謝産物に対する細胞の嗜好をリアルタイムで決定するのに有用である。まず、200マイクロリットルのXFキャリブラントを添加し、アッセイの前にユーティリティプレートを少なくとも1時間インキュベートします。補充されたXF DMEMを用いて80ミリリットルのXFアッセイ培地を調製する。氷上でオリゴマイシンA、ロテノン、およびアンチマイシンAを解凍する。使用前に化合物を上下にピペットで溶かします。26.4マイクロリットルの2.5ミリモルオリゴマイシンAをチューブAに、3.1マイクロリットルの12.67ミリモルロテノンに、4.1マイクロリットルの9.4ミリモルアンチマイシンAに、30マイクロリットルのフックの染色をチューブBに3ミリリットル加え、チューブBに30マイクロリットルのフック染色剤を充填する。そして最後に、20マイクロリットルのこれらの化合物を、200マイクロリットルのアッセイ培地中の細胞に装填する。細胞培養用マイクロプレートを摂氏37度の培養器から取り出し、顕微鏡下で細胞を観察した。アッセイ培地を水浴から除去する。予め加温したアッセイ培地200マイクロリットルで細胞を2回穏やかに洗浄し、ウェル当たり200マイクロリットルのアッセイ培地を加える。顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞がウェルに接着したままであることを確認します。D5およびE8ウェル内の細胞が一貫した単分子膜で接着され、洗浄ステップ中に洗い流されなかったことを確認する。細胞イメージングソフトウェアは、オートフォーカスと自動露出を設定するためにこれら2つのウェルを使用します。機器の横にあるコンピューターでデスクトップソフトウェアを開きます。コントローラソフトウェアの左下隅にある接続ステータスを確認します。テンプレートに移動し、XF ATP 率アッセイテンプレートまたは適切なアッセイテンプレートを選択します。画面上部の [グループ定義] を選択し、グループを定義します。プレートマップレイアウトを選択し、定義されたグループに応じてウェルを割り当てます。計測器プロトコルを確認します。追加したコンパウンドが正しくリストされていることを確認し、今後の参照用にプロジェクト情報を含めます。「アッセイの実行」をクリックします。これにより、結果ファイルの保存場所の選択が促されます。結果ファイルを保存する場所を選択します。アッセイ日を含むファイルを保存し、[実行の開始]をクリックします。センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置き、[準備完了]をクリックしてキャリブレーションを開始します。コンピュータ上の細胞イメージングソフトウェアを開きます。マイクロプレートイメージャの電源が入っていて、ポートがコンピュータに接続されていることを確認します。画面の左下にあるステータスバーをチェックして、温度が摂氏37度に設定されていること、および接続ステータスが準備完了として緑色で強調表示されていることを確認します。プレートのバーコードをスキャンして、イメージングプロセスを開始します。セルプレートに名前を入力し、[保存]をクリックします。明視野と蛍光画像がここに保存されます。[明視野スキャンの実行]をクリックすると、次の画面の[プレートとスキャン]メニューにイメージングのオプションが表示されます。アッセイの前に、[明視野スキャンの開始] を選択します。細胞培養マイクロプレートとプレートカバーをトレイホルダーの上に置き、A1ウェルをA1マークに合わせます。[トレイを閉じる]をクリックします。明視野画像取得は、プレートマップとともに次の画面に表示されます。[すべての井戸をスキャン]をクリックし、30〜35分間スキャンします。キャリブレーションが完了すると、ソフトウェアはロードセルプレートダイアログボックスを表示します。次に、[トレイを開く]をクリックして、ユーティリティトレイを細胞培養マイクロプレートに置き換えます。なお、細胞培養プレートはマイクロプレートイメージャにある。スキャン後、細胞培養マイクロプレートを取り出し、分析装置に入れてアッセイを行う。次に、ロードセルプレートをクリックしてアッセイを開始します。アッセイが開始されるまで待ち、推定完了時間を表示します。アッセイが完了すると、ソフトウェアは「センサーカートリッジのアンロード」ダイアログボックスと「セルプレート」を表示します。「取り出し」をクリックし、細胞培養マイクロプレートを分析装置から取り外します。センサーカートリッジを慎重に取り外し、セルプレートの蓋を取り付けます。アッセイ完了ダイアログボックスが表示されます。次に、[結果の表示]をクリックしてアッセイ結果ファイルを開くか、データを正規化します。アッセイ終了後、ハンドヘルドバーコードリーダーでプレートバーコードをスキャンします。プレートが既にイメージ化されている場合は、新しい名前は必要ありません。蛍光と細胞数を選択します。セルプレートをトレイホルダーに置き、「トレイを閉じる」をクリックします。画像取得ウィンドウで、[すべてのウェルをスキャン]を選択してイメージングを開始します。イメージングおよび細胞イメージングアプリケーションで蛍光画像と細胞数を確認するには、いくつかのウェルをランダムにクリックします。蛍光イメージングが完了したら、追加の参照用に画像をエクスポートします。イメージングと細胞数が完了したら、結果ファイルを開き、[正規化]をクリックします。インポートをクリックし、デスクトップソフトウェアの適用を選択して、アッセイを細胞数で自動的に正規化します。オリゴマイシンAおよびFCCPストレッサー混合注射は、対照群のベースライン活性を増加させた。ストレッサーは、対照および処置1群において有意に高いエネルギーレベルを示した。一方、治療2はベースライン活性が比較的低く、細胞はより好気的になった。この図は、対照細胞および実験細胞の両方が、ATP生成のために解糖系およびミトコンドリア酸化的リン酸化を使用することを示している。実験グループは、解糖系を介したATP生成の減少とミトコンドリア呼吸の増加を示した。治療群の基礎呼吸数は対照群よりも比較的少ない。両群の呼吸およびATP産生速度は、プロトンリークに続いてオリゴマイシンA注射とともに減少する。細胞の呼吸数は、FCCPの注射後に再び最大呼吸に戻る。ロテノンおよびアンチマイシンAの最終注射は、OCRを再び減少させる。3回目の注射後、ミトコンドリア呼吸はロテノンとアンチマイシンAの組み合わせによってシャットダウンされます.対照群と比較して、治療群の基礎呼吸および最大呼吸は比較的変化がありません。図は、対照群がグルコース経路に大きく依存しているのに対し、対照群ではグルタミン酸化が効率的であったことを示している。脂肪酸経路は、治療が細胞の全体的な容量を増加させたことを示す。酸性プレート上の複数の注入口の利用可能性は、単一の時点で細胞エネルギーに対する複数の薬物の効果を決定するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

の仕分け<em&gt;ストレプトミセス</em複合オブジェクトパラメトリック·アナライザおよびソーターの使用&gt;細胞ペレット

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

のサイレンシング<em&gt; BRCA2</em&gt;ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...