Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (NIH), Национальным институтом артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний (NIAMS) AR072123 и грантом Национального института по проблемам старения (NIA) AG069795 (для ERR).

Все процедуры были основаны на руководящих принципах и одобрении Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Университета Вандербильта.
1. Подготовка реагентов и пробирная установка
<ol><li>Выделение и культивирова?...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

Анализатор метаболического потока клеток в реальном времени может быть использован для изучения клеточной энергетики в различных условиях. Протокол иллюстрирует эффективную изоляцию BMSC, культивирование клеток в соответствующих пластинах клеточной культуры и их дифференцировку в з?...

Образование кости остеобластом сопровождается скоординированным разрушением или рассасыванием костей остеокластами. Баланс между остеобластным формированием кости и резорбцией остеокластов представляет собой связанный процесс, описывающий оборот или ремоделирование кости, который необходим для скелетного гомеостаза. Дисфункция остеобластов приводит к нарушению костеобразования и приводит к различным заболеваниям, в том числеостеопорозу 1,2,3. Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга (BMSCs) ex vivo/in vitro к предшественникам остеобластов и зрелым остеобластам приводит к образованию и отложению минерализованного костного матрикса в культуральном сосуде с течением времени 4,5,6. Это костное образование остеобластом требует значительного количества клеточной энергии. В частности, было показано, что синтез и секреция коллагена в значительной степени зависят от клеточных соотношений АТФ: АДФ, и, по-видимому, минерализованный пузырчатый трафик и секреция требуют дополнительного АТФ 7,8,9,10,11. Многие исследователи продемонстрировали, что процесс остеобластогенеза и функции остеобластов требует адекватного запаса энергии для удовлетворения метаболической потребности в формировании костей 12,13,14,15,16. Поэтому целью данного метода является характеристика биоэнергетического статуса первичных, мышиных стромальных клеток на протяжении дифференцировки остеобластов с помощью анализатора метаболического потока клеток реального времени. Эти методы помогают в развитии лучшего понимания скелетного гомеостаза, что в конечном итоге может привести к разработке новых терапевтических вариантов, способных улучшить скелетные расстройства.
Анализатор метаболического потока клеток в реальном времени может быть использован для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления (ECAR) живых остеобластов, что соответствует митохондриальной и гликолитической продукции АТФ соответственно. Основополагающим для этой методологии является тот факт, что один ион H+ на лактат высвобождается во время гликолиза при превращении глюкозы в лактат, что изменяет рН среды, отраженный в значениях ECAR. И наоборот, во время цикла TCA (трикарбоновой кислоты) окислительное фосфорилирование через митохондрии производит CO2 путем использования или потребления кислорода, и поэтому мониторинг OCR отражает этот метаболический процесс. Анализатор измеряет как OCR, так и ECAR во внеклеточной микросреде одновременно и в режиме реального времени, что позволяет использовать огромный потенциал при изучении клеточной биоэнергетики 6,17. Кроме того, выполнение этих анализов относительно просто и легко настраивается в зависимости от экспериментальной цели. Аналогичные методы были использованы для дальнейшего понимания метаболической регуляции Т-клеток иммунной системы18,19, инициации рака и прогрессирования20, наряду с несколькими другими типами клеток, способствующими метаболическим синдромам21,22.
Преимущества анализатора метаболических потоков в реальном времени перед альтернативными методами включают (1) возможность измерения клеточной биоэнергетики живых клеток в режиме реального времени, (2) способность выполнять анализ с относительно небольшим количеством клеток (требуется всего 5000 клеток), (3) инъекционные порты для параллельного манипулирования несколькими обработками в высокопроизводительной 96-луночной системе, (4) использование автоматического тепловизора без радиоактивных меток для нормализации18, 23,24. Следующие методы направлены на обобщенное, но подробное описание мониторинга клеточной биоэнергетики в мышиных BMSC на протяжении дифференцировки остеобластов с помощью анализатора. Он будет включать в себя регулярно выполняемые анализы; однако, как и во многих техниках и методах, настоятельно рекомендуется, чтобы отдельные лаборатории определяли конкретные детали для своих экспериментов.
Выбор анализов и различные типы анализов доступны: Доступно большое разнообразие наборов для анализа и реагентов для изучения биоэнергетики клеток, обеспечивая при этом надежность и согласованность экспериментальных результатов. Кроме того, настольное программное обеспечение также предлагает шаблоны анализа, которые можно легко настроить. Анализ может быть определен на основе потребностей пользователя в измерении различных метаболических параметров. Эти анализы могут быть модифицированы различными способами на основе экспериментальной цели и/или научного вопроса. Например, с четырьмя инъекционными портами несколько соединений могут быть введены в пробирную среду для анализа клеточного ответа, специфичного для каждого метаболического пути.
Тест фенотипа клеточной энергии: Этот анализ измеряет метаболический фенотип живых клеток и метаболический потенциал. Этот анализ также рекомендуется в качестве первого шага для получения обобщенного представления о метаболизме, специфичном для пути. Смесь олигомицина А-ингибитора АТФ-синтазы и карбонилцианида 4-(трифторметокси)фенилгидразона (FCCP)-митохондриального разъединяющего агента вводят для понимания энергетического потенциала клетки. Инъекция олигомицина А ингибирует синтез АТФ, что приводит к увеличению скорости гликолиза (ЭКАР), чтобы позволить клеткам удовлетворить свои энергетические потребности; с другой стороны, инъекция FCCP приводит к более высокому OCR из-за деполяризации митохондриальной мембраны. По сути, этот анализ изображает базальное метаболическое дыхание и после двойных инъекций, толчков или стрессов метаболическую реакцию. Основываясь на этих параметрах, программное обеспечение затем строит ГРАФИК OCR и ECAR клеток, классифицируя клетки как аэробное, покоящееся, гликолитическое или энергетическое состояние с течением времени25,26.
Анализ скорости производства АТФ в режиме реального времени: Это измеряет выработку клеточной АТФ одновременно от гликолиза и митохондриального дыхания. Этот анализ количественно измеряет метаболические сдвиги от двух энергетических путей и предоставляет данные о скорости производства митохондриальной и гликолитической АТФ с течением времени. Анализ получает базальные данные OCR и ECAR с последующим расчетом скорости производства митохондриальной АТФ путем инъекции олигомицина А и гликолитической скорости производства АТФ путем инъекции смеси ротенона + антимицина А (полное ингибирование митохондриальной функции), что приводит к митохондриальному подкислению17,27.
Клеточный митохондриальный стресс-тест (или клеточный мито-стресс-тест): Он измеряет митохондриальную функцию через АТФ-связанное дыхание, количественно оценивает клеточную биоэнергетику, идентифицирует митохондриальную дисфункцию и измеряет реакцию клеток на стресс. Различные параметры, включая базальную и запасную дыхательную способность, АТФ-связанное дыхание, максимальное дыхание и немитохондриальное потребление кислорода, могут быть получены в одном анализе. Этот анализ включает последовательные инъекции олигомицина А, FCCP (митохондриального разъединяющего агента), смеси ингибиторов ротенона/ антимицина А для эффективного анализа их влияния на митохондриальную функцию28.
Тест на гибкость топлива: Это измеряет скорость митохондриального дыхания путем окисления трех основных митохондриальных топлив присутствием и отсутствием их ингибиторов. Последовательное ингибирование глюкозы, глутамина и жирных кислот помогает измерить зависимость, емкость и гибкость клеток, а также зависимость клеток в различных клеточных путях для удовлетворения потребности в энергии. Когда митохондрии не могут удовлетворить требования заблокированного пути, представляющего интерес, путем окисления других видов топлива, клетки входят в состояние зависимости. Емкость клеток рассчитывается путем ингибирования двух других альтернативных путей с последующим ингибированием интересующего пути. Гибкость клеток помогает понять способность митохондрий компенсировать и удовлетворять потребности в топливе ингибированного пути. Он рассчитывается путем вычитания зависимости ячеек из емкости ячеек. Три различных ингибитора используются независимо или в виде смеси двух для эффективного расчета параметров анализа. 2-циан-3-(1-фенил-1Н-индол-3-ил)-2-пропеновая кислота (UK5099) ингибирует окисление глюкозы, блокируя пируват-носитель в гликолизе. Бис-2-(5-фенилацетамидо-1,3,4-тиадиазол-2-ил) (BPTES) этилсульфид ингибирует путь окисления глутамина, а этомоксир ингибирует окисление длинноцепочечных жирных кислот29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление методологии культивирования и подготовки остеобластов к анализу. Мышиные BMSC выделяют из длинных костей, культивируют и засеивают в 96-луночные пластины с плотностью 25 000 клеток на лунку. Культивирование этих клеток в специфических средах остеобластов начинается, когда они достигают 80%-100% конфлюзии, чтобы начать их дифференцировку. Анализы выполняются на разных этапах дифференцировки. Картриджные пластины гидратируются за один день до анализа. В день анализа различные ингибиторы вводятся в порты картриджей датчиков в зависимости от требований анализа, а к калибровочной пластине на 96 скважин добавляется калибровочный буфер. После калибровки выполняется анализ метаболического потока клеток в реальном времени, после чего выполняется визуализация микропластины клеточной культуры с использованием микропластичного тепловизора для нормализации данных анализатора метаболического потока клеток в реальном времени с количеством клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

Формирование кости остеобластами является важным процессом для правильного приобретения кости и оборота кости для поддержания скелетного гомеостаза и, в конечном счете, предотвращения перелома. В интересах оптимизации пиковой костной массы и борьбы с различными заболеваниями опорно-двигательного аппарата (например, постменопаузальным остеопорозом, нервной анорексией, сахарным диабетом 1 и 2 типа) в области костной биологии были предприняты невероятные усилия для полной характеристики остеобластов на протяжении всего процесса их дифференцировки. Учитывая основную роль зрелых остеобластов в секреции матричных белков и минерализующих везикул, было отмечено, что эти процессы забирают невероятное количество клеточной энергии, или аденозинтрифосфата (АТФ). Общий клеточный энергетический статус часто называют клеточной биоэнергетикой, и он включает в себя ряд метаболических реакций, которые ощущают доступность субстрата для получения АТФ для удовлетворения клеточных потребностей. Таким образом, текущий метод детализирует процесс выделения первичных стромальных клеток мыщеричного мозга (BMSCs) и мониторинга их биоэнергетического статуса с использованием анализатора метаболического потока клеток в реальном времени на различных стадиях дифференцировки остеобластов. Важно отметить, что эти данные продемонстрировали, что метаболический профиль резко меняется на протяжении всей дифференциации остеобластов. Таким образом, использование этого физиологически значимого типа клеток необходимо для полного понимания того, как биоэнергетический статус клетки может регулировать общую функцию.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативные графики для регулярно выполняемых анализов для понимания клеточного биоэнергетического профиля контрольной и лечебной группы с их соответствующими стандартными ошибками....

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Анализ метаболического потока клеток в режиме реального времени измеряет скорость потребления кислорода и скорость внеклеточного подкисления, что соответствует производству митохондриальных и гликолитических аденозинтрифосфатов с использованием датчиков pH и кислорода. Рукопись объясняет метод понимания энергетического статуса остеобластов, а также характеристику и интерпретацию клеточного биоэнергетического статуса.

Использование анализатора метаболического потока клеток в реальном времени для мониторинга биоэнергетики остеобластов

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Этот метод полезен при определении клеточной энергетики, такой как скорость производства АТФ, а также для определения клеточного предпочтения по отношению к конкретному метаболиту в режиме реального времени. Для начала добавьте 200 микролитров калибранта XF и высиживайте полезную пластину в течение не менее одного часа перед анализом. Подготовьте 80 миллилитров среды для анализа XF с использованием дополненного XF DMEM.Разморозьте олигомицин А, ротенон и антимицин А на льду. Пипетка соединений вверх и вниз, чтобы солюбилизировать их перед использованием. Добавьте три миллилитра подготовленной пробирной среды в каждую трубку, меченую буквами А и В.Добавьте 26,4 микролитра 2,5 миллимолярного олигомицина А в трубку А и 3,1 микролитра 12,67 миллимолярного ротенона, 4,1 микролитра 9,4 миллимолярного антимицина А и 30 микролитров пятна Хука в трубку B.Загрузите 10-кратную концентрацию этих ингибиторов в соответствующий инъекционный порт.И, наконец, 20 микролитров этих соединений будут загружены в ячейки в 200 микролитрах пробирной среды. Извлеките микропластинку клеточной культуры из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия и понаблюдайте за клетками под микроскопом. Снимите пробирную среду с водяной бани.Аккуратно промыть клетки 200 микролитрами предварительно подогретой пробирной среды дважды и добавить 200 микролитров пробирной среды на лунку. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки остаются прикрепленными к лункам. Убедитесь, что ячейки в скважинах D5 и E8 прикреплены к последовательному монослою и не были смыты на этапе промывки.Программное обеспечение для визуализации клеток использует эти две скважины для настройки автофокуса и автоматической экспозиции. Откройте настольное программное обеспечение на компьютере рядом с оборудованием. Проверьте состояние подключения в левом нижнем углу программного обеспечения контроллера.Перейдите в раздел Шаблоны и выберите шаблон анализа скорости XF ATP или соответствующий шаблон анализа. Выберите Определения групп в верхней части экрана и определите группы. выбрать макет карты плит и назначить скважины в зависимости от определенных групп.Проверьте протокол прибора. Убедитесь, что добавленные соединения правильно перечислены и включите информацию о проекте для будущих ссылок. Нажмите на Run Assay.Это приведет к выбору места хранения результирующего файла. Выберите расположение для сохранения результирующего файла. Сохраните файл с датой анализа и нажмите «Начать запуск».Поместите картридж датчика и пластину утилиты на лоток и нажмите «Я готов начать калибровку». Откройте программное обеспечение для визуализации клеток на компьютере. Убедитесь, что тепловизор микропластин включен и порты подключены к компьютеру.Проверьте строку состояния в левом нижнем углу экрана, чтобы убедиться, что температура установлена на 37 градусов по Цельсию и что состояние подключения должно быть выделено зеленым цветом как готовое. Отсканируйте штрих-код пластины, чтобы начать процесс визуализации. Укажите имя ячейки и нажмите Кнопку Сохранить.Здесь будут сохранены яркие и флуоресцентные изображения. Нажмите «Выполнить сканирование Brightfield» и на следующем экране «Пластина и меню сканирования» отобразят параметры визуализации. Перед анализом выберите Начать сканирование Brightfield.Поместите микропластинку клеточной культуры и крышку пластины на держатель лотка и выровняйте колодец A1 с маркировкой A1. Нажмите закрыть лоток. Получение изображения Brightfield появляется на следующем экране с картой пластин.Нажмите «Сканировать все скважины» и сканируйте в течение 30-35 минут. По завершении калибровки программное обеспечение отображает диалоговое окно Load Cell Plate. Затем нажмите «Открыть лоток», чтобы заменить лоток утилиты микропластинкой клеточной культуры.Обратите внимание, что пластина для культивирования клеток находится в тепловизоре микропластины. После сканирования извлеките микропластинку клеточной культуры и поместите ее в анализатор для выполнения анализа. Затем нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать анализ.Дождитесь начала анализа и отобразите предполагаемое время завершения. По завершении анализа программное обеспечение отображает диалоговое окно «Выгрузить картридж датчика» и «Ячейка пластины». Нажмите кнопку Извлечь и извлеките микропластинку клеточной культуры из анализатора.Осторожно снимите картридж датчика и замените крышку пластины ячейки. Появится диалоговое окно Проверка завершена. Затем нажмите «Просмотреть результаты», чтобы открыть файл результатов анализа или нормализовать данные.После завершения анализа отсканируйте штрих-код пластины с помощью портативного считывателя штрих-кодов. Если пластина уже была изображена, она не потребует нового имени. Выберите Флуоресценция и количество клеток.Поместите ячейку на держатель лотка и нажмите «Закрыть лоток». В окне получения изображения выберите Сканировать все скважины, чтобы начать визуализацию. Просмотрите флуоресцентные изображения и количество клеток в приложении визуализации и визуализации клеток, случайным образом щелкнув по паре лунок.После завершения флуоресцентной визуализации экспортируйте изображения для получения дополнительных ссылок. После завершения обработки изображений и подсчета ячеек откройте файл результатов и нажмите «Нормализовать». Нажмите «Импорт» и выберите «Применить для настольного программного обеспечения», чтобы автоматически нормализовать анализ с количеством ячеек.Инъекция смеси олигомицина А и FCCP повышала базовую активность контрольной группы. Стрессоры показали значительно высокий уровень энергии в контрольной и лечебной одной группе. С другой стороны, лечение двух имело сравнительно более низкую базовую активность, и клетки стали более аэробными.Рисунок показывает, что как контрольные, так и экспериментальные клетки используют гликолиз и митохондриальное окислительное фосфорилирование для генерации АТФ. Экспериментальная группа демонстрирует снижение генерации АТФ посредством гликолиза и увеличение митохондриального дыхания. Частота базального дыхания в группе лечения сравнительно меньше, чем в контрольной группе.Дыхание и скорость производства АТФ в обеих группах снижаются вместе с утечкой протонов с последующей инъекцией олигомицина А. Частота дыхания клеток снова повышается до максимального дыхания после инъекции FCCP. Заключительная инъекция ротенона и антимицина А снова снижает OCR.После третьей инъекции митохондриальное дыхание отключается комбинацией ротенона и антимицина А. По сравнению с контрольной группой базальное и максимальное дыхание групп лечения относительно не изменяется. Рисунок показывает, что контрольная группа сильно зависит от пути глюкозы, в то время как окисление глютамина было эффективным в контрольной группе. Путь жирных кислот показывает, что лечение увеличило общую емкость клеток.Наличие нескольких инъекционных портов на кислотной пластине помогает нам определить влияние нескольких лекарств на клеточную энергетику в один момент времени.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Объединение QD-FRET и Microfluidics для мониторинга ДНК Nanocomplex самосборки в режиме реального времени

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии Caenorhabditis Элеганс</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Сортировка<em&gt; Streptomyces</em&gt; Сотовые Пеллеты Использование сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Подавление<em&gt; BRCA2</em&gt; Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Смешанные первичные культуры мышиных тонкой кишки, предназначенные для изучения Gut Гормон Секреции и живых изображений клеток из клеток энтероэндокринных