Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 och National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (till ERR).

Alla förfaranden baserades på riktlinjerna och godkännandet av Institutional Animal Care and Use Committee vid Vanderbilt University Medical Center.
1. Beredning av reagenser och analysuppställning
<ol><li>Isolering och odling av benmärgsstromaceller (se även föregående artikel30).<ol>
<li>Förbered fullständigt alfa minimum essential media (αMEM) cellodlingsmedier genom att komplettera minsta essentiella medier med alfamodifiering med 10% F...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

Realtidscellens metaboliska flödesanalysator kan användas för att utforska cellulär energi under olika förhållanden. Protokollet illustrerar effektiv isolering av BMSC, odlingsceller i lämpliga cellodlingsplattor och deras differentiering till mogna osteoblaster, som kan användas för olika analyser med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn. Vidare förklaras de kritiska stegen i realtid cellmetabolisk flödesanalys, inklusive hydrering av sensorpatroner, laddning av injektionsportarna, utförande av a...

Benbildningen av osteoblasten åtföljs av samordnad förstörelse eller resorption av ben genom osteoklaster. Balansen mellan osteoblastisk benbildning och osteoklastresorption är en kopplad process som beskriver benomsättning eller ombyggnad, vilket är viktigt för skeletthomeostas. Osteoblastdysfunktion leder till nedsatt benbildning och resulterar i olika sjukdomar, inklusive osteoporos 1,2,3. Ex vivo/in vitro-differentiering av benmärgsstromala stamceller (BMSC) till osteoblastprekursorer och mogna osteoblaster resulterar i bildandet och avsättningen av den mineraliserade benmatrisen i odlingskärlet över tid 4,5,6. Denna benbildning av osteoblasten kräver en betydande mängd cellulär energi. Specifikt har kollagensyntes och utsöndring visat sig vara starkt beroende av cellulär ATP: ADP-förhållanden, och förmodligen kräver mineraliserad vesikolhandel och utsöndring ytterligare ATP 7,8,9,10,11. Många forskare har visat att processen med osteoblastogenes och osteoblastfunktion kräver en tillräcklig energiförsörjning för att möta den metaboliska efterfrågan på benbildning 12,13,14,15,16. Därför är målet med denna metod att karakterisera den bioenergetiska statusen för primära, murina stromala celler under osteoblastdifferentiering med användning av realtidscellmetabolisk flödesanalysator. Dessa tekniker hjälper till att utveckla en bättre förståelse för skeletthomeostas, vilket i slutändan kan leda till utvecklingen av nya terapeutiska alternativ som kan förbättra skelettsjukdomar.
Realtidscellmetabolisk flödesanalysator kan användas för att mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR) för levande osteoblaster, vilket motsvarar mitokondriell respektive glykolytisk ATP-produktion. Grundläggande för denna metod är det faktum att en H + -jon per laktat frigörs under glykolys vid omvandling av glukos till laktat, vilket förändrar medias pH som återspeglas i ECAR-värdena. Omvänt, under TCA-cykeln (trikarboxylsyra), producerar oxidativ fosforylering via mitokondrierna CO2 genom att använda eller konsumera syre, och därför är övervakning av OCR reflekterande av denna metaboliska process. Analysatorn mäter både OCR och ECAR i den extracellulära mikromiljön samtidigt och i realtid, vilket möjliggör enorm potential när man studerar cellulär bioenergetik 6,17. Dessutom är det relativt enkelt att utföra dessa analyser och lätt anpassningsbart beroende på det experimentella målet. Liknande tekniker har använts för att ytterligare förstå T-cellsmetabolisk reglering av immunsystemet18,19, cancerinitiering och progression20, tillsammans med flera andra celltyper som bidrar till metaboliska syndrom21,22.
Fördelarna med metabolisk flödesanalysator i realtid jämfört med alternativa tekniker inkluderar (1) förmågan att mäta cellulär bioenergetik hos levande celler i realtid, (2) förmåga att utföra analys med ett relativt litet antal celler (kräver så lågt som 5 000 celler), (3) injektionsportar för att parallellt manipulera flera behandlingar i ett 96-brunnssystem med hög genomströmning, (4) användning av radioaktiv etikettfri automatiserad cellbildare för normalisering18, 23,24. Följande metoder syftar till att ge en generaliserad men detaljerad beskrivning av övervakning av cellulär bioenergetik i murina BMSC under osteoblastdifferentiering med hjälp av analysatorn. Det kommer att innehålla rutinmässigt utförda analyser; Men som med många tekniker och metoder uppmuntras det starkt att enskilda laboratorier bestämmer specifika detaljer för sina experiment.
Urval av analyser och olika typer av analyser tillgängliga: Ett brett utbud av analyssatser och reagenser finns tillgängliga för att studera cellernas bioenergetik samtidigt som tillförlitligheten och konsistensen av de experimentella resultaten säkerställs. Dessutom erbjuder skrivbordsprogramvaran också analysmallar som enkelt kan anpassas. Analysen kan definieras utifrån användarens behov av att mäta olika metaboliska parametrar. Dessa analyser kan modifieras på olika sätt baserat på det experimentella målet och / eller den vetenskapliga frågan. Till exempel, med fyra injektionsportar, kan flera föreningar injiceras i analysmediet för att analysera det cellulära svaret som är specifikt för varje metabolisk väg.
Cellenergi fenotyp test: Denna analys mäter de levande cellernas metaboliska fenotyp och metaboliska potential. Denna analys rekommenderas också som det första steget för att få en generaliserad uppfattning om vägspecifik metabolism. En blandning av oligomycin A-en-hämmare av ATP-syntas och karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) - ett mitokondriellt frikopplingsmedel injiceras för att förstå cellenergipotentialen. Injektionen av oligomycin A hämmar syntesen av ATP, vilket resulterar i en ökning av glykolyshastigheten (ECAR) för att göra det möjligt för cellerna att uppfylla sina energibehov; å andra sidan resulterar injektionen av FCCP i högre OCR på grund av depolarisering av mitokondriellt membran. I huvudsak visar denna analys basal metabolisk andning, och efter de dubbla injektionerna, tryck eller påfrestningar, det metaboliska svaret. Baserat på dessa parametrar plottar programvaran sedan OCR och ECAR av cellerna genom att klassificera cellerna som aeroba, vilande, glykolytiska eller energiska tillstånd över tiden25,26.
ATP-analys av produktionshastighet i realtid: Detta mäter den cellulära ATP-produktionen samtidigt från glykolys och mitokondriell andning. Denna analys mäter kvantitativt de metaboliska förändringarna från de två energivägarna och ger data om mitokondriella och glykolytiska ATP-produktionshastigheter över tiden. Analysen erhåller basala OCR- och ECAR-data följt av beräkning av mitokondriell ATP-produktionshastighet genom injektion av oligomycin A och glykolytisk ATP-produktionshastighet genom injektion av rotenon + antimycin A-blandning (total hämning av mitokondriell funktion), vilket resulterar i mitokondriell försurning17,27.
Stresstest för cellmitokondrier (eller stresstest för cellmito): Detta mäter mitokondriell funktion genom ATP-kopplad andning, kvantifierar cellulär bioenergetik, identifierar mitokondriell dysfunktion och mäter cellernas svar på stress. Olika parametrar, inklusive basal och reserv andningskapacitet, ATP-kopplad andning, maximal andning och icke-mitokondriell syreförbrukning, kan erhållas i en analys. Denna analys innefattar sekventiella injektioner av oligomycin A, FCCP (mitokondriellt frikopplingsmedel), en blandning av rotenon/antimycin A-hämmare för att effektivt analysera effekten av dessa på mitokondriell funktion28.
Flexibilitet mito bränsle flex test: Detta mäter mitokondriell andningshastighet genom oxidation av de tre primära mitokondriella bränslena genom närvaron och frånvaron av deras hämmare. Den sekventiella hämningen av glukos, glutamin och fettsyror hjälper till att mäta cellernas beroende, kapacitet och flexibilitet och cellernas beroende i olika cellulära vägar för att möta energibehovet. När mitokondrierna inte kan uppfylla kraven från den blockerade vägen av intresse genom att oxidera andra bränslen, går cellerna in i ett beroendetillstånd. Cellernas kapacitet beräknas genom hämning av de andra två alternativa vägarna följt av hämning av den intressanta vägen. Cellernas flexibilitet hjälper till att förstå mitokondriernas förmåga att kompensera och möta bränslebehoven hos den hämmade vägen. Det beräknas genom att subtrahera cellernas beroende från cellernas kapacitet. Tre olika hämmare används oberoende eller som en blandning av två för att effektivt beräkna analysparametrarna. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensyra (UK5099) hämmar oxidationen av glukos genom att blockera pyruvatbäraren vid glykolys. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) etylsulfid hämmar glutaminoxidationsvägen och etomoxir hämmar oxidationen av långkedjiga fettsyror29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av metoden för odling och beredning av osteoblaster för analys. Murina BMSC isoleras från långa ben, odlas och frös i 96-brunnsplattor vid 25 000 celler / brunnsdensitet. Odling av dessa celler i osteoblastspecifika medier startas när de når 80% -100% sammanflöde för att starta sin differentiering. Analyserna utförs i olika stadier av differentiering. Patronplattorna hydreras en dag före analysen. På analysdagen injiceras olika hämmare i portarna på sensorpatronerna baserat på analyskraven, och en kalibreringsbuffert läggs till 96-brunnskalibreringsplattan. Efter kalibrering utförs realtidscellens metaboliska flödesanalys, följt av avbildning av cellodlingsmikroplattan med hjälp av mikroplattbildaren för att normalisera realtidsdata för cellmetaboliska flödesanalysatorer med cellantal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

Benbildning av osteoblaster är en viktig process för korrekt benförvärv och benomsättning för att upprätthålla skeletthomeostas och i slutändan förhindra fraktur. I intresse för att både optimera toppbenmassan och bekämpa olika muskuloskeletala sjukdomar (dvs. postmenopausal osteoporos, anorexia nervosa, typ 1 och 2 diabetes mellitus) har otroliga ansträngningar gjorts inom benbiologi för att fullt ut karakterisera osteoblaster under hela deras differentieringsprocess. Med tanke på den primära rollen hos mogna osteoblaster för att utsöndra matrisproteiner och mineraliseringsblåsor har det noterats att dessa processer tar en otrolig mängd cellulär energi eller adenosintrifosfat (ATP). Den övergripande cellulära energistatusen kallas ofta cellulär bioenergetik, och den innehåller en serie metaboliska reaktioner som känner av substrattillgänglighet för att härleda ATP för att möta cellulära behov. Därför beskriver den nuvarande metoden processen att isolera primära, murina benmärgsstromalceller (BMSC) och övervaka deras bioenergetiska status med hjälp av realtidscellmetabolisk flödesanalysator i olika stadier i osteoblastdifferentiering. Viktigt är att dessa data har visat att den metaboliska profilen förändras dramatiskt under osteoblastdifferentiering. Således krävs användning av denna fysiologiskt relevanta celltyp för att fullt ut uppskatta hur en cells bioenergetiska status kan reglera den övergripande funktionen.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figur 6: Representativa grafer för rutinmässigt utförda analyser för att förstå den cellulära bioenergetiska profilen för kontroll kontra behandlingsgrupp med deras respektive standardfel. (A) Cellenergifenotyptestet. Diagrammet representerar glykolysen (ECAR) kontra mitokondriell andning (OCR) av kontrollen kontra tv...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Realtidscellmetabolisk flödesanalys mäter syreförbrukningshastigheten och extracellulär försurningshastighet, vilket motsvarar mitokondriell och glykolytisk adenosintrifosfatproduktion, med hjälp av pH- och syresensorer. Manuskriptet förklarar en metod för att förstå osteoblasternas energistatus och karakteriseringen och tolkningen av den cellulära bioenergetiska statusen.

Använda realtidscellmetabolisk flödesanalysator för att övervaka osteoblastbioenergetik

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Denna metod är användbar för att bestämma cellulära energier, som ATP-produktionshastighet, och även för att bestämma cellulär preferens mot en viss metabolit i realtid. För att börja, tillsätt 200 mikroliter XF-kaliber och inkubera verktygsplattan i minst en timme före analysen. Förbered 80 ml XF-analysmedia med kompletterad XF DMEM.Tina oligomycin A, rotenon och antimycin A på is. Pipettera föreningarna upp och ner för att solubilisera dem före användning. Tillsätt tre milliliter beredd analysmedium till varje rör, märkt A och B.Tillsätt 26,4 mikroliter 2,5 millimolärt oligomycin A i rör A och 3,1 mikroliter 12,67 millimolär rotenon, 4,1 mikroliter 9,4 millimolärt antimycin A och 30 mikroliter Hooks fläck i rör B.Ladda en 10x koncentration av dessa hämmare i motsvarande injektionsport.Och slutligen kommer 20 mikroliter av dessa föreningar att laddas in i cellerna i 200 mikroliter analysmedier. Ta bort cellodlingsmikroplattan från 37 grader Celsius inkubatorn och observera cellerna under mikroskopet. Ta bort analysmediet från vattenbadet.Tvätta försiktigt cellerna med 200 mikroliter förvärmt analysmedium två gånger och tillsätt 200 mikroliter analysmedia per brunn. Kontrollera cellerna under mikroskopet för att säkerställa att cellerna förblir vidhäftade vid brunnarna. Se till att cellerna i D5- och E8-brunnarna fästs med ett konsekvent monolager och inte tvättas bort under tvättsteget.Cellavbildningsprogramvara använder dessa två brunnar för att ställa in autofokus och automatisk exponering. Öppna skrivbordsprogramvaran i datorn bredvid utrustningen. Kontrollera anslutningsstatusen i det nedre vänstra hörnet av styrenhetens programvara.Gå till Mallar och välj XF ATP-hastighetsanalysmallen eller lämplig analysmall. Välj Gruppdefinitioner överst på skärmen och definiera grupperna. välj plattans kartlayout och tilldela brunnarna beroende på de definierade grupperna.Kontrollera instrumentprotokollet. Se till att de föreningar som läggs till är korrekt listade och inkludera projektinformationen för framtida referenser. Klicka på Kör analys.Detta kommer att uppmana valet av resultatfilens lagringsplats. Välj den plats där resultatfilen ska sparas. Spara filen med analysdatumet och klicka på Starta körning.Placera sensorpatronen och verktygsplattan på facket och klicka på Jag är redo att starta kalibreringen. Öppna cellavbildningsprogramvaran på datorn. Se till att mikroplattavbildningen är påslagen och att portarna är anslutna till datorn.Kontrollera statusfältet längst ned till vänster på skärmen för att säkerställa att temperaturen är inställd på 37 grader Celsius och att anslutningsstatusen ska markeras i grönt som klar. Skanna plattans streckkod för att initiera avbildningsprocessen. Ange ett namn på cellplattan och tryck på Spara.Brightfield och fluorescerande bilder sparas här. Klicka på Perform Brightfield Scan och på nästa skärm visar Plate and Scan Menu alternativen för bildbehandling. Innan analysen väljer du Starta Brightfield Scan.Placera cellodlingsmikroplattan och plattkåpan på brickhållaren och rikta in väl A1 mot A1-märket. Klicka på Stäng facket. Brightfield-bildförvärv visas på nästa skärm med en plattkarta.Klicka på Skanna alla brunnar och skanna i 30 till 35 minuter. När kalibreringen är klar visar programvaran dialogrutan Load Cell Plate. Klicka sedan på Öppna facket för att ersätta verktygsfacket med en cellodlingsmikroplatta.Observera att cellodlingsplattan finns i mikroplattbilden. Efter skanningen, ta bort cellodlingsmikroplattan och placera den i analysatorn för att utföra analysen. Klicka sedan på Ladda cellplatta för att starta analysen.Vänta tills analysen startar och visa den beräknade slutförandetiden. När analysen är klar visar programvaran dialogrutan Unload Sensor Cartridge och Cell Plate. Klicka på Mata ut och ta bort cellodlingsmikroplattan från analysatorn.Ta försiktigt bort sensorpatronen och sätt tillbaka locket på cellplattan. Dialogrutan Analys slutförd visas. Klicka sedan på Visa resultat för att öppna analysresultatfilen eller för att normalisera data.När analysen är klar skannar du plattans streckkod med den handhållna streckkodsläsaren. Om plattan redan har avbildats kräver den inte ett nytt namn. Välj Fluorescens och cellantal.Placera cellplattan på fackhållaren och klicka på Stäng facket. I fönstret för bildförvärv väljer du Skanna alla brunnar för att påbörja avbildningen. Granska de fluorescerande bilderna och cellantalet i bild- och cellavbildningsprogrammet genom att slumpmässigt klicka på ett par av brunnarna.När fluorescensavbildningen är klar exporterar du bilderna för ytterligare referenser. När avbildningen och cellräkningen är klar öppnar du resultatfilen och klickar på Normalisera. Klicka på Importera och välj Ansök om skrivbordsprogramvaran för att normalisera analysen med cellantal automatiskt.Injektionen av oligomycin A och FCCP stressor mix ökade kontrollgruppens baslinjeaktivitet. Stressorer visade en signifikant hög energinivå i den kontroll och behandling man grupperar. Å andra sidan hade behandling två en jämförelsevis lägre baslinjeaktivitet, och cellerna blev mer aeroba.Figuren indikerar att både kontroll- och experimentella celler använder glykolys och mitokondriell oxidativ fosforylering för ATP-generering. Experimentgruppen visar en minskning av ATP-generering via glykolys och en ökning av mitokondriell andning. Den basala andningsfrekvensen i behandlingsgruppen är jämförelsevis lägre än kontrollgruppen.Andnings- och ATP-produktionshastigheterna i båda grupperna minskar, tillsammans med protonläckaget följt av en oligomycin A-injektion. Andningshastigheterna hos cellerna stiger tillbaka igen till sin maximala andning efter injektionen av FCCP. Den slutliga injektionen av rotenon och antimycin A minskar OCR igen.Efter den tredje injektionen stängs mitokondriell andning av genom kombinationen av rotenon och antimycin A.Jämfört med kontrollgruppen har behandlingsgruppernas basala och maximala andning relativt ingen förändring. Figuren visar att kontrollgruppen är starkt beroende av glukosvägen, medan glutaminoxidation var effektiv i kontrollgruppen. Fettsyravägen visar att behandlingen har ökat cellernas totala kapacitet.Tillgängligheten av flera injektionsportar på syraplattan hjälper oss att bestämma effekten av flera läkemedel på cellulär energi vid en enda tidpunkt.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Kombinera QD-bandet och Mikrofluidik till Monitor DNA Nanocomplex självorganisering i realtid

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabil Isotopic Profilering av förmedlande Metabola Flux i utvecklingsländer och vuxna Stage Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sortering av<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell Pellets Använda en komplex Object parametrisk Analyzer och Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Tysta<em&gt; BRCA2</em&gt; För att identifiera nya BRCA2 reglerade biologiska funktioner i odlade humana celler

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Realtid avbildning av växtcellytan Dynamisk med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...