Name: using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Grant AR072123 ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) Grant AG069795 (ERR'ye) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin kılavuzlarına ve onayına dayanıyordu.
1. Reaktiflerin hazırlanması ve tahlil kurulumu
<ol><li>Kemik iliği stromal hücrelerinin izolasyonu ve kültürlenmesi (ayrıca önceki makale30'a bakınız).<ol>
<li>Minimum esansiyel medyayı alfa modifikasyonu ile %10 FBS (fetal sığır serumu), 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomis...

<ol>
	<li>Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+homeostasis.">Bone homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13361-13362 (1998).</li><li>Nakahama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+communications+in+bone+homeostasis+and+repair.">Cellular communications in bone homeostasis and repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).</li><li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis.">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), 2073 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRT3/SOD2+maintains+osteoblast+differentiation+and+bone+formation+by+regulating+mitochondrial+stress.">SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).</li><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+bone+resorption+by+the+osteoclast.">Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast.</a> The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).</li><li>Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Function+and+Metabolism+of+Cultured+Skeletal+Cells.">Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 437-447 (2021).</li><li>Zanotelli, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP+utilization+during+metastatic+cell+migration+by+collagen+architecture.">Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).</li><li>Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+promotes+extracellular+matrix+biosynthesis+of+intervertebral+disc+cells.">ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells.</a> Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).</li><li>Kruse, N. J., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+requirements+for+transcellular+movement+and+secretion+of+collagen.">The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).</li><li>Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+lipid+droplets+support+osteoblast+function.">Intracellular lipid droplets support osteoblast function.</a> Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).</li><li>Sinnott-Armstrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+variant+at+3q21.1+confers+an+increased+pleiotropic+risk+for+hyperglycemia+and+altered+bone+mineral+density.">A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density.</a> Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).</li><li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling.">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+I.+Normal+bone.">Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).</li><li>Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+studies+of+bone+in+vitro:+II.+The+metabolic+patterns+of+accretion+and+resorption.">Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption.</a> Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).</li><li>Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+in+bone+tissue+and+bone+cells+in+culture.+Characterization+and+hormonal+influences.">Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences.</a> The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).</li><li>Frey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-Lrp5+signaling+regulates+fatty+acid+metabolism+in+the+osteoblast.">Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).</li><li>Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).</li><li>vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+Extracellular+Flux+Analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).</li><li>Noel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+metabolic+assay+of+3-dimensional+spheroid+co-cultures+of+pancreatic+cancer+cells+and+fibroblasts.">Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).</li><li>Nicholls, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).</li><li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+Analyzer:+applications+for+aging+research.">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research.</a> GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).</li><li>. What are the advantages of using Seahorse XF technology Available from: <a target="_blank" href="https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech">https://wwwagilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech</a> (2018)</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>. XF cell energy phenotype test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884</a> (2021)</li><li>Leung, D. T. H., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidative+stress:+Mitochondrial+function+using+the+seahorse+system.">Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system.</a> Methods in Molecular Biology. 1710, 285-293 (2018).</li><li>. XF ATP rate assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889</a> (2021)</li><li>. XF cell mito stress test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885</a> (2021)</li><li>. XF cell mito fuel flex test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888">https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888</a> (2021)</li><li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice.">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li><li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone.">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).</li></ol>

Gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü, farklı koşullar altında hücresel enerjileri keşfetmek için kullanılabilir. Protokol, BMSC'lerin verimli izolasyonunu, hücrelerin uygun hücre kültürü plakalarında kültürlenmesini ve hücre dışı akı analizörü kullanılarak çeşitli tahliller için kullanılabilecek olgun osteoblastlara farklılaşmasını göstermektedir. Ayrıca, sensör kartuşlarının hidrasyonu, enjeksiyon portlarının yüklenmesi, tahlilin yapılması, verilerin normalleştiri...

Osteoblast tarafından kemik oluşumuna, kemiklerin osteoklastlar tarafından koordineli yıkımı veya emilimi eşlik eder. Osteoblastik kemik oluşumu ve osteoklast rezorpsiyonu arasındaki denge, iskelet homeostazı için gerekli olan kemik döngüsünü veya yeniden şekillenmesini tanımlayan birleştirilmiş bir süreçtir. Osteoblast disfonksiyonu kemik oluşumunun bozulmasına yol açar ve osteoporoz 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla sonuçlanır. Kemik iliği stromal kök hücrelerinin (BMSC'ler) osteoblast öncüllerine ve olgun osteoblastlara ex vivo/in vitro farklılaşması, zamanla kültür damarında mineralize kemik matriksinin oluşması ve birikmesi ile sonuçlanır 4,5,6. Osteoblast tarafından yapılan bu kemik oluşumu önemli miktarda hücresel enerji gerektirir. Spesifik olarak, kollajen sentezi ve sekresyonunun hücresel ATP'ye büyük ölçüde dayandığı gösterilmiştir: ADP oranları ve muhtemelen mineralize vezikül kaçakçılığı ve sekresyonu ek ATP 7,8,9,10,11 gerektirir. Birçok araştırmacı, osteoblastogenez ve osteoblast fonksiyonu sürecinin, kemik oluşumunun metabolik talebini karşılamak için yeterli bir enerji kaynağı gerektirdiğini göstermiştir 12,13,14,15,16. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörünü kullanarak osteoblast farklılaşması boyunca birincil, murin stromal hücrelerin biyoenerjetik durumunu karakterize etmektir. Bu teknikler, iskelet homeostazının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur ve bu da sonuçta iskelet bozukluklarını iyileştirebilecek yeni terapötik seçeneklerin geliştirilmesine yol açabilir.
Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı analizörü, sırasıyla mitokondriyal ve glikolitik ATP üretimine karşılık gelen canlı osteoblastların oksijen tüketim hızını (OCR) ve hücre dışı asitleşme hızını (ECAR) ölçmek için kullanılabilir. Bu metodolojinin temeli, glikozun laktata dönüştürülmesinde glikoliz sırasında laktat başına bir H + iyonunun salınmasıdır ve bu da ECAR değerlerine yansıyan ortam pH'ını değiştirir. Tersine, TCA (trikarboksilik asit) döngüsü sırasında, mitokondri yoluyla oksidatif fosforilasyon, oksijen kullanarak veya tüketerek CO2 üretir ve bu nedenle OCR'nin izlenmesi bu metabolik süreci yansıtır. Analizör, hücre dışı mikro ortamda hem OCR hem de ECAR'ı aynı anda ve gerçek zamanlı olarak ölçer, bu da hücresel biyoenerjetik 6,17'yi incelerken muazzam bir potansiyele izin verir. Ek olarak, bu tahlillerin yapılması nispeten basittir ve deneysel hedefe bağlı olarak kolayca özelleştirilebilir. Benzer teknikler, bağışıklık sisteminin T hücresi metabolik regülasyonunu18,19, kanser başlangıcını ve progresyonunu 20 ve metabolik sendromlara katkıda bulunan diğer birçok hücre tipi21,22'yi daha iyi anlamak için kullanılmıştır.
Gerçek zamanlı metabolik akı analizörünün alternatif tekniklere göre avantajları arasında (1) canlı hücrelerin hücresel biyoenerjetik değerlerini gerçek zamanlı olarak ölçme yeteneği, (2) nispeten az sayıda hücreyle tahlil yapabilme yeteneği (5.000 hücre kadar düşük hücre gerektirir), (3) yüksek verimli 96 kuyucuklu bir sistemde birden fazla tedaviyi paralel olarak manipüle etmek için enjeksiyon portları, (4) normalizasyon için radyoaktif etiketsiz otomatik hücre görüntüleyicisinin kullanılması18, 23,24. Aşağıdaki yöntemler, analizörü kullanarak osteoblast farklılaşması boyunca murin BMSC'lerde hücresel biyoenerjetik izlemenin genelleştirilmiş ancak ayrıntılı bir tanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Rutin olarak gerçekleştirilen tahlilleri içerecektir; Bununla birlikte, birçok teknik ve yöntemde olduğu gibi, bireysel laboratuvarların deneyleri için belirli ayrıntıları belirlemeleri şiddetle tavsiye edilir.
Tahlil seçimi ve mevcut farklı tahlil türleri: Deneysel sonuçların güvenilirliğini ve tutarlılığını sağlarken, hücrelerin biyoenerjetik özelliklerini incelemek için çok çeşitli tahlil kitleri ve reaktifleri mevcuttur. Ek olarak, masaüstü yazılımı kolayca özelleştirilebilen tahlil şablonları da sunar. Tahlil, kullanıcının farklı metabolik parametreleri ölçme ihtiyaçlarına göre tanımlanabilir. Bu tahliller, deneysel hedefe ve / veya bilimsel soruya dayanarak çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Örneğin, dört enjeksiyon portuyla, her metabolik yola özgü hücresel yanıtı analiz etmek için tahlil ortamına birden fazla bileşik enjekte edilebilir.
Hücre enerjisi fenotip testi: Bu tahlil, canlı hücrelerin metabolik fenotipini ve metabolik potansiyelini ölçer. Bu tahlil, yola özgü metabolizma hakkında genelleştirilmiş bir fikir edinmek için ilk adım olarak da önerilir. Hücre enerji potansiyelini anlamak için oligomisin A-ATP sentaz inhibitörü ve Karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)-bir mitokondriyal ayrışma ajanı karışımı enjekte edilir. Oligomisin A enjeksiyonu, ATP'nin sentezini inhibe eder, bu da hücrelerin enerji taleplerini karşılamalarını sağlamak için glikoliz (ECAR) oranında bir artışa neden olur; Öte yandan, FCCP enjeksiyonu, mitokondriyal membranın depolarizasyonu nedeniyle daha yüksek OCR ile sonuçlanır. Temel olarak, bu tahlil bazal metabolik solunumu ve ikili enjeksiyonları, itmeleri veya stresleri takiben metabolik yanıtı gösterir. Bu parametrelere dayanarak, yazılım daha sonra hücreleri aerobik, sessiz, glikolitik veya zaman içindeenerjik durum 25,26 olarak sınıflandırarak hücrelerin OCR ve ECAR'ını çizer.
ATP gerçek zamanlı üretim hızı testi: Bu, hücresel ATP üretimini aynı anda glikoliz ve mitokondriyal solunumdan ölçer. Bu tahlil, iki enerji yolundan metabolik kaymaları nicel olarak ölçer ve zaman içinde mitokondriyal ve glikolitik ATP üretim oranları hakkında veri sağlar. Tahlil, bazal OCR ve ECAR verilerini elde eder, ardından oligomisin A enjeksiyonu yoluyla mitokondriyal ATP üretim hızını ve rotenon + antimisin A karışımı enjeksiyonu yoluyla glikolitik ATP üretim hızını hesaplar (mitokondriyal fonksiyonun toplam inhibisyonu), mitokondriyal asitleşme ile sonuçlanır17,27.
Hücre mitokondrisi stres testi (veya hücre mito stres testi): Bu, ATP'ye bağlı solunum yoluyla mitokondriyal fonksiyonu ölçer, hücresel biyoenerjetik faktörleri nicelleştirir, mitokondriyal disfonksiyonu tanımlar ve hücrelerin strese tepkisini ölçer. Bir tahlilde bazal ve yedek solunum kapasitesi, ATP'ye bağlı solunum, maksimal solunum ve mitokondriyal olmayan oksijen tüketimi gibi çeşitli parametreler elde edilebilir. Bu tahlil, oligomisin A, FCCP (mitokondriyal ayrışma ajanı), bunların mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisini etkili bir şekilde analiz etmek için rotenon / antimisin A inhibitörlerinin bir karışımı olan sıralı enjeksiyonları içerir28.
Esneklik mito yakıt esnek testi: Bu, mitokondriyal solunum hızını, üç birincil mitokondriyal yakıtın inhibitörlerinin varlığı ve yokluğu ile oksidasyonu ile ölçer. Glikoz, glutamin ve yağ asitlerinin sıralı inhibisyonu, hücrelerin bağımlılığını, kapasitesini ve esnekliğini ve enerji talebini karşılamak için hücrelerin çeşitli hücresel yollara bağımlılığını ölçmeye yardımcı olur. Mitokondri, diğer yakıtları oksitleyerek tıkanmış ilgi yolunun taleplerini karşılayamadığında, hücreler bağımlılık durumuna girer. Hücrelerin kapasitesi, diğer iki alternatif yolun inhibisyonu ve ardından ilgilenilen yolun inhibisyonu ile hesaplanır. Hücrelerin esnekliği, mitokondrinin inhibe edilmiş yolun yakıt ihtiyaçlarını telafi etme ve karşılama yeteneğini anlamada yardımcı olur. Hücrelerin bağımlılığının hücrelerin kapasitesinden çıkarılmasıyla hesaplanır. Tahlil parametrelerini etkili bir şekilde hesaplamak için üç farklı inhibitör bağımsız olarak veya ikisinin karışımı olarak kullanılır. 2-siyano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoik asit (UK5099), glikolizde piruvat taşıyıcısını bloke ederek glikozun oksidasyonunu inhibe eder. Bis-2-(5-fenilasetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) etil sülfür glutamin oksidasyon yolunu inhibe eder ve etomoksir uzun zincirli yağ asitlerinin oksidasyonunu inhibe eder29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Şekil 1: Osteoblastların kültürlenmesi ve analiz için hazırlanması için metodolojinin şematik gösterimi. Murin BMSC'ler uzun kemiklerden izole edilir, kültürlenir ve 25.000 hücre / kuyu yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakalarda tohumlanır. Bu hücrelerin Osteoblast spesifik ortamlarda kültürlenmesi, farklılaşmalarına başlamak için% 80-100 akıcılığa ulaştıklarında başlar. Tahliller farklılaşmanın farklı aşamalarında gerçekleştirilir. Kartuş plakaları tahlilden bir gün önce nemlendirilir. Tahlil gününde, sensör kartuşlarının portlarına tahlil gereksinimlerine göre farklı inhibitörler enjekte edilir ve 96 delikli kalibrasyon plakasına bir kalibrasyon tamponu eklenir. Kalibrasyondan sonra, gerçek zamanlı hücre metabolik akı testi yapılır, ardından gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü verilerini hücre sayısı ile normalleştirmek için mikroplaka görüntüleyiciyi kullanarak hücre kültürü mikroplakası görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>PZ0160</td>
			<td>UK5099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>SML0601</td>
			<td>BPTES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 imaging reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microplate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid-Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>O3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A - 5 mg</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200mM Glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM media</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7800B</td>
			<td>Real- Time Metabolic flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cell imaging 1.1.0.11 software</td>
			<td>Agilent Technologies - BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave software 2.6.1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics

Osteoblastlarla kemik oluşumu, iskelet homeostazını korumak ve nihayetinde kırılmayı önlemek için uygun kemik edinimi ve kemik döngüsü için gerekli bir süreçtir. Hem pik kemik kütlesini optimize etmek hem de çeşitli kas-iskelet sistemi hastalıklarıyla (yani menopoz sonrası osteoporoz, anoreksiya nervoza, tip 1 ve 2 diabetes mellitus) mücadele etmek amacıyla, kemik biyolojisi alanında, osteoblastları farklılaşma süreçleri boyunca tam olarak karakterize etmek için inanılmaz çabalar sarf edilmiştir. Olgun osteoblastların matriks proteinlerini ve mineralizasyon veziküllerini salgılamadaki birincil rolü göz önüne alındığında, bu işlemlerin inanılmaz miktarda hücresel enerji veya adenozin trifosfat (ATP) aldığı belirtilmiştir. Genel hücresel enerji durumu genellikle hücresel biyoenerjetik olarak adlandırılır ve hücresel ihtiyaçları karşılamak için ATP'yi türetmek için substrat kullanılabilirliğini algılayan bir dizi metabolik reaksiyon içerir. Bu nedenle, mevcut yöntem, osteoblast farklılaşmasının çeşitli aşamalarında Gerçek zamanlı hücre metabolik akı analizörü kullanarak birincil, murin kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC'ler) izole edilmesi ve biyoenerjetik durumlarının izlenmesi sürecini detaylandırmaktadır. Önemli olarak, bu veriler metabolik profilin osteoblast farklılaşması boyunca dramatik bir şekilde değiştiğini göstermiştir. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili bu hücre tipinin kullanılması, bir hücrenin biyoenerjetik durumunun genel işlevi nasıl düzenleyebileceğini tam olarak anlamak için gereklidir.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Şekil 6: Kontrol ve tedavi grubunun hücresel biyoenerjetik profilini kendi standart hatalarıyla anlamak için rutin olarak yapılan analizler için temsili grafikler . (A) Hücre enerjisi fenotip testi. Grafik, kontrolün glikolizini (ECAR) ve mitokondriyal solunumu (OCR) ve iki tedavi grubunu (n = 3) temsil eder. Oligomis...

Watch this Scientific Journal Video about Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics at JoVE.com

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Bu yöntem, ATP üretim hızı gibi hücresel enerjileri belirlemede ve ayrıca gerçek zamanlı olarak belirli bir metabolite yönelik hücresel tercihi belirlemede yararlıdır. Başlamak için, 200 mikrolitre XF kalibrant ekleyin ve yardımcı plakayı tahlilden en az bir saat önce inkübe edin. Takviyeli XF DMEM kullanarak 80 mililitre XF tahlil ortamı hazırlayın.Oligomisin A, rotenon ve antimisin A'yı buz üzerinde çözün. Kullanmadan önce bileşikleri çözündürmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. Her tüpe üç mililitre hazırlanmış tahlil ortamı ekleyin, A ve B etiketli 26.4 mikrolitre 2.5 milimolar oligomisin A tüpüne ve 3.1 mikrolitre 12.67 milimolar rotenon, 4.1 mikrolitre 9.4 milimolar antimisin A ve 30 mikrolitre Kanca lekesini B tüpüne ekleyin.Ve son olarak, bu bileşiklerin 20 mikrolitresi, 200 mikrolitre tahlil ortamındaki hücrelere yüklenecektir. Hücre kültürü mikroplakasını 37 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Tahlil ortamını su banyosundan çıkarın.Hücreleri iki kez 200 mikrolitre önceden ısıtılmış tahlil ortamı ile nazikçe yıkayın ve kuyu başına 200 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Hücrelerin kuyucuklara yapışmış kalmasını sağlamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. D5 ve E8 kuyularındaki hücrelerin tutarlı bir tek katmanla yapıştırıldığından ve yıkama adımı sırasında yıkanmadığından emin olun.Hücre görüntüleme yazılımı, otomatik odaklamayı ve otomatik pozlamayı ayarlamak için bu iki kuyuyu kullanır. Bilgisayarda ekipmanın yanındaki masaüstü yazılımını açın. Oyun kumandası yazılımının sol alt köşesindeki bağlantı durumunu kontrol edin.Şablonlar'a gidin ve XF ATP oranı tahlil şablonunu veya uygun tahlil şablonunu seçin. Ekranın üst kısmındaki Grup Tanımları'nı seçin ve grupları tanımlayın. plaka haritası düzenini seçin ve tanımlanan gruplara bağlı olarak kuyuları atayın.Cihaz protokolünü doğrulayın. Eklenen bileşiklerin doğru listelendiğinden emin olun ve gelecekteki referanslar için proje bilgilerini ekleyin. Tahlil Çalıştır'a tıklayın.Bu, sonuç dosyası depolama konumunun seçilmesini ister. Sonuç dosyasının kaydedileceği konumu seçin. Dosyayı tahlil tarihi ile kaydedin ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.Sensör kartuşunu ve yardımcı program plakasını tepsiye yerleştirin ve kalibrasyonu başlatmak için Hazırım'a tıklayın. Bilgisayardaki hücre görüntüleme yazılımını açın. Mikro plakalı görüntüleyicinin açık olduğundan ve bağlantı noktalarının bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.Sıcaklığın 37 santigrat dereceye ayarlandığından ve bağlantı durumunun hazır olarak yeşil renkle vurgulanması gerektiğinden emin olmak için ekranın sol alt köşesindeki durum çubuğunu kontrol edin. Görüntüleme işlemini başlatmak için plaka barkodunu tarayın. Hücre plakasına bir ad verin ve Kaydet'e basın.Parlak alan ve floresan görüntüler buraya kaydedilecektir. Brightfield Taraması Gerçekleştir'e tıklayın ve bir sonraki ekranda, Plaka ve Tarama Menüsü görüntüleme seçeneklerini gösterir. Tahlilden önce Brightfield Taramasını Başlat'ı seçin.Hücre kültürü mikro plakasını ve plaka kapağını tepsi tutucuya yerleştirin ve A1 işaretini A1 ile iyice hizalayın. Tepsiyi Kapat'a tıklayın. Brightfield görüntü alımı, bir sonraki ekranda bir plaka haritasıyla birlikte görünür.Scan All Wells'e tıklayın ve 30 ila 35 dakika boyunca tarayın. Kalibrasyon tamamlandığında, yazılım Yük Hücresi Plakası iletişim kutusunu görüntüler. Ardından, yardımcı program tepsisini bir hücre kültürü mikro plakasıyla değiştirmek için Tepsiyi Aç'a tıklayın.Hücre kültürü plakasının mikro plaka görüntüleyicide olduğunu unutmayın. Taramadan sonra, hücre kültürü mikroplakasını çıkarın ve tahlili gerçekleştirmek için analizöre yerleştirin. Ardından, tahlili başlatmak için Yük Hücre Plakası'na tıklayın.Tahlil başlayana kadar bekleyin ve tahmini tamamlanma süresini görüntüleyin. Tahlil tamamlandıktan sonra, yazılım Boşaltma Sensörü Kartuşu ve Hücre Plakası iletişim kutusunu görüntüler. Çıkar'a tıklayın ve hücre kültürü mikroplakasını analizörden çıkarın.Sensör kartuşunu dikkatlice çıkarın ve hücre plakası kapağını yerine takın. Tahlil Tamamlandı iletişim kutusu görüntülenir. Ardından, tahlil sonucu dosyasını açmak veya verileri normalleştirmek için Sonuçları Görüntüle'ye tıklayın.Tahlil tamamlandıktan sonra, el tipi barkod okuyucu ile plaka barkodunu tarayın. Plaka zaten görüntülenmişse, yeni bir isim gerektirmez. Floresan ve Hücre Sayısı'nı seçin.Hücre plakasını tepsi tutucuya yerleştirin ve Tepsiyi Kapat'a tıklayın. Görüntü alma penceresinde, görüntülemeye başlamak için Tüm Kuyuları Tara'yı seçin. Görüntüleme ve hücre görüntüleme uygulamasındaki floresan görüntüleri ve hücre sayımlarını, birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak gözden geçirin.Floresan görüntüleme tamamlandıktan sonra, ek referanslar için görüntüleri dışa aktarın. Görüntüleme ve hücre sayımı tamamlandıktan sonra, sonuç dosyasını açın ve Normalleştir'e tıklayın. İçe Aktar'a tıklayın ve tahlili hücre sayısıyla otomatik olarak normalleştirmek için masaüstü yazılımı için Uygula'yı seçin.Oligomisin A ve FCCP stresör karışımı enjeksiyonu, kontrol grubunun temel aktivitesini arttırdı. Stresörler, bir grubun kontrolünde ve tedavisinde anlamlı derecede yüksek bir enerji seviyesi gösterdi. Öte yandan, tedavi iki nispeten daha düşük bir temel aktiviteye sahipti ve hücreler daha aerobik hale geldi.Şekil, hem kontrol hem de deneysel hücrelerin ATP üretimi için glikoliz ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon kullandığını göstermektedir. Deney grubu, glikoliz yoluyla ATP üretiminde bir azalma ve mitokondriyal solunumda bir artış göstermektedir. Tedavi grubundaki bazal solunum hızı kontrol grubuna göre nispeten daha azdır.Her iki grupta da solunum ve ATP üretim hızları, proton sızıntısı ve ardından oligomisin A enjeksiyonu ile birlikte azalır. Hücrelerin solunum hızları, FCCP enjeksiyonundan sonra tekrar maksimum solunumlarına geri döner. Son rotenon ve antimisin A enjeksiyonu OCR'yi tekrar azaltır.Üçüncü enjeksiyondan sonra, mitokondriyal solunum rotenon ve antimisin kombinasyonu ile kapatılır A.Kontrol grubuna kıyasla, tedavi gruplarının bazal ve maksimal solunumunda nispeten bir değişiklik yoktur. Şekil, kontrol grubunun glikoz yoluna büyük ölçüde bağımlı olduğunu, glutamin oksidasyonunun ise kontrol grubunda etkili olduğunu göstermektedir. Yağ asidi yolu, tedavinin hücrelerin genel kapasitesini arttırdığını göstermektedir.Asit plakası üzerinde çoklu enjeksiyon portlarının mevcudiyeti, birden fazla ilacın hücresel enerjiler üzerindeki etkisini tek bir zaman noktasında belirlememize yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sıralanması<em&gt; Streptomyces</emKarmaşık bir nesne Parametrik Analiz ve Ayırıcı Kullanma&gt; Hücre Peletleri

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...