Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til HSZ. Vi takker også Dr. Yuan Kang for opdræt og vedligeholdelse af musekolonien.

Alle udførte dyreforsøg fulgte protokollerne godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Auburn University.
BEMÆRK: Følgende protokol bruger en testikel (ca. 100 mg) ved P28 fra Gli1-CreERT2; NuTRAP mus (Mus musculus). Det kan være nødvendigt at justere mængderne af reagenser på grundlag af typerne af prøver og antallet af væv.
1. Indsamling af væv
<ol><li>Afliv musene ved hjælp af ...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Nytten af helvævstranskriptomanalysen kan dæmpes, især når man studerer komplekse heterogene væv. Hvordan man får celletypespecifikke RNA'er bliver et presserende behov for at frigøre den kraftfulde RNA-seq-teknik. Isoleringen af celletypespecifikke RNA'er er normalt afhængig af indsamling af en bestemt type celler ved hjælp af mikromanipulation, fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodissektion (LCM)18. Andre moderne enkeltcelleopsamlingsmetoder og instrumen...

High-throughput tilgange, herunder RNA-sekventering (RNA-seq) og microarray, har gjort det muligt at forhøre genekspressionsprofiler på genom-dækkende niveau. For komplekse væv som hjerte, hjerne og testikelser vil de celletypespecifikke data give flere detaljer, der sammenligner brugen af RNA'er fra hele vævet 1,2,3. For at overvinde virkningen af cellulær heterogenitet er metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) blevet udviklet siden begyndelsen af 2010'erne4. TRAP er i stand til at isolere ribosombundne RNA'er fra specifikke celletyper uden vævsdissociation. Denne metode er blevet brugt til translatom (mRNA'er, der rekrutteres til ribosomet til translation) analyse i forskellige organismer, herunder målretning mod en ekstremt sjælden population af muskelceller i Drosophila embryoner5, undersøgelse af forskellige rodceller i modelplanten Arabidopsis thaliana6 og udførelse af transkriptomanalyse af endotelceller hos pattedyr7.
TRAP kræver en genetisk modifikation for at mærke ribosomet af en modelorganisme. Evan Rosen og kolleger udviklede for nylig en musemodel kaldet Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har været tilgængelig via Jackson Laboratory siden 2017. Ved at krydse med en Cre-muselinje kan forskere bruge denne NuTRAP-musemodel til at isolere ribosombundne RNA'er og cellekerner fra Cre-ekspressive celler uden cellesortering. I Cre-ekspressive celler, der også bærer NuTRAP-allelen , tillader EGFP / L10a-mærket ribosomet isolering af oversættelse af mRNA'er ved hjælp af affinitetspulldown-assays. Ved samme celle tillader biotin ligasegenkendelsespeptid (BLRP) -mærket nuklear membran, som også er mCherry-positiv, den nukleare isolering ved hjælp af affinitets- eller fluorescensbaseret oprensning. Det samme forskerhold genererede også en lignende muselinje, hvor kernemembranen kun er mærket med mCherry uden biotin8. Disse to genetisk modificerede muselinjer giver adgang til at karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler af specifikke typer celler i interesse.
Pindsvinets (Hh) signalvej spiller en afgørende rolle i vævsudvikling9. GLI1, et medlem af GLI-familien, fungerer som en transkriptionel aktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+ celler findes i mange hormonudskillende organer, herunder binyrerne og testiklerne. For at isolere celletypespecifikke DNA'er og RNA'er fra Gli1+ celler ved hjælp af NuTRAP-musemodellen blev Gli1-CreERT2-mus krydset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus blev også krydset med NuTRAP-musenes mål om at isolere sonisk pindsvin (Shh) ekspressive celler. Følgende protokol viser, hvordan du bruger Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus til at isolere ribosombundne RNA'er fra Gli1+ celler i voksne musetestikler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Cellulær heterogenitet udgør udfordringer for at forstå funktionen af komplekse væv på et transkriptomniveau. Brug af celletypespecifikke RNA'er undgår potentielle faldgruber forårsaget af vævets heterogenitet og frigør den kraftfulde transkriptomanalyse. Protokollen, der er beskrevet her, viser, hvordan man bruger TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) til at isolere ribosombundne RNA'er fra en lille mængde EGFP-ekspressive celler i et komplekst væv uden cellesortering. Denne protokol er velegnet til isolering af celletypespecifikke RNA'er ved hjælp af den nyligt tilgængelige NuTRAP-musemodel og kan også bruges til at isolere RNA'er fra alle EGFP-ekspressive celler.

Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) blev først krydset med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) for at generere dobbeltmutante mus. Mus, der bærer begge gensplejsede genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 og NuTRAP), blev injiceret med tamoxifen en gang dagligt, hver anden dag, til tre injektioner. Vævsprøver blev indsamlet den 7. dag efter injektionens 1. dag. Immunofluorescensanalyse viste, at EGFP blev udtrykt i inters...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Denne protokol sigter mod at isolere celletypespecifik oversættelse af ribosomale mRNA'er ved hjælp af NuTRAP-musemodellen.

Isoler celletypespecifikke RNA'er fra snapfrosne heterogene vævsprøver uden cellesortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Denne protokol sigter mod at opnå celletyper af høj kvalitet specifikke RNA'er fra et lille antal celler i et komplekst væv uden cellesortering. Det anvender en nyligt tilgængelig musemodel, der gør det muligt for forskere at isolere et ribosombundet RNA ved hjælp af GLP-pull down. Metoden er også velegnet til isolering af ribosombundne RNA'er fra enhver EGFP-ekspressionsceller.Til at begynde med tilsættes to milliliter iskold homogeniseringsarbejdsbuffer til et glasvævsslibersæt. Placer hurtigt den frosne prøve i kværnen og homogeniser vævet med 30 slag på is ved hjælp af en løs pistil. overfør homogenatet til et to milliliter rundt bundrør og centrifuge ved 12.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Overfør derefter supernatanten til et nyt to milliliter rør uden at forstyrre pelleten og reservere 100 mikroliter som input. Inkuber supernatanten med anti-GFP-antistoffet ved fire grader Celsius på en ende over ende rotator natten over. Homogenat- og antistofblandingen overføres til et nyt to milliliter rundt bundrør indeholdende vaskede proteinperler g og inkuberes fire grader Celsius på rotator ved 24 o / min i to timer.Adskil magnetperlerne fra supernatanten ved hjælp af et magnetisk stativ. Gem supernatanten som den negative fraktion, der indeholder RNA'erne i EGFP-negative celler og RNA'erne i EGFP-positive celler, der ikke er bundet til ribosomer. Tilsæt en milliliter høj saltvaskebuffer til perlerne og vælg kortvarigt røret for at vaske perlerne.Placer derefter røret i et magnetisk stativ. Fjern vaskebufferen, og gentag vasketrinnene to gange mere for at opnå perlernes ribosom-RNA-kompleks fra EGFP-positive celler. Inkuber perlerne med 50 mikroliter ekstraktionsbuffer fra RNA-isolationssættet i en ThermoMixer i 30 minutter for at frigive RNA'er fra perlerne.Adskil perlerne med et magnetisk stativ og overfør supernatanten til et 1,5 ml rør. Centrifuger røret ved 3000 g i to minutter. Pift derefter supernatanten til et nyt 1,5 milliliter rør.For at prækonditionere RNA-oprensningskolonnen pipetteres 250 mikroliter konditioneringsbuffer på oprensningskolonnen og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Centrifuger derefter søjlen ved 16.000 g i et minut. Pipetter et tilsvarende volumen på 70% ethanol ind i celleekstraktet og bland godt ved pipettering.Pipetter op til 200 mikroliter af blandingen i den forkonditionerede RNA-oprensningskolonne. For at reducere tabet af prøver må du ikke fylde kolonnen mere end 80% af dens kapacitet. Gentag dette trin flere gange, indtil alle RNA'er er samlet i samme kolonne for hver fraktion.Centrifuger søjlen i to minutter for at binde RNA til membranen i søjlen. Fortsæt derefter centrifugering i 30 sekunder. Kassér strømmen igennem og pipetter 100 mikroliter vaskebuffer en ind i søjlen.Centrifuge i et minut, og kassér derefter strømmen igennem. Pipette 75 mikroliter DNA-opløsning blandes direkte i oprensningssøjlemembranen. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.Derefter pipetteres 40 mikroliter vaskebuffer en ind i søjlen og centrifugeres i yderligere 30 sekunder. Kassér strømmen igennem. Pipette 100 mikroliter vaskebuffer to ind i søjlen og centrifuge ved 8.000 g i et minut.Kassér strømmen igennem. Køb PET 100 mikroliter vaskebuffer to i søjlen og centrifuge ved 16.000 g i to minutter. Kassér strømmen igennem, og centrifugerer den samme kolonne igen ved 16.000 g i et minut for at fjerne alle spor af vaskebuffer.Overfør søjlen til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. pipetter 12 mikroliter RNasefrit vand direkte på membranen i rensesøjlen, hvilket sikrer, at pipettespidsen ikke rører membranen. Inkuberes ved stuetemperatur i et minut og centrifuge ved 1000 g i et minut.Derefter ved 16.000 G i et minut for at elutere RNA'et. Brug en bioanalysator til at vurdere kvaliteten og mængden af det ekstraherede RNA. Opbevar RNA'erne i en 80 graders fryser eller send dem til yderligere analyse.Mus, der bærer både gensplejsede genalleler, Gli1-CreERT2 og NuTRAP, injiceres vi med tamoxifen en gang dagligt, hver anden dag til tre injektioner. Immunofluorescensanalyse af indsamlede væv viser, at EGFP blev udtrykt i interstitielle celler i testiklerne. EGFP blev også fundet i binyrebarkceller i Gli1-CreERT2, NuTRAP mus.I Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-mus EGFP-positiv cellepopulation befinder sig i den ydre cortex i binyrerne under kapslen, hvilket bekræfter ekspressionen af EGFP-præekspressive celler. Efter ekstraktionen af celletypespecifikke RNA'er blev det ekstraherede RNA sendt til mikroarrayanalyse. Resultaterne viste, at omkring 3000 gener blev beriget i den positive fraktion sammenlignet med gener i den negative fraktion, mens omkring 4.000 gener blev beriget i den negative fraktion.Blandt de differentielle udtrykte gener blev Leydig-celleassocierede gener Hsd11b1 og Hsd3b6 beriget i den positive fraktion. I den negative fraktion blev Sertoli-celleassocierede gener Desert Hedgehog og Gstm6 beriget. Kun få differentielt udtrykte gener blev identificeret ved sammenligning af den negative fraktion med input.Realtime kvantitativ RT-PCR blev brugt til at bekræfte ekspressionen af nøglegener i de positive og negative fraktioner. I lighed med hvad der blev fundet i microarray-analysen, blev steroidogene enzymer 3-beta hydroxy steroid dehydrogenase og kolesterol sidekæde spaltningsenzym beriget i den positive fraktion. I mellemtiden blev Sertoli-cellemarkøren SRY-bokstranskriptionsfaktor ni og kimcellemarkøren synaptonemalt kompleksprotein tre beriget i den negative fraktion.Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at forberede frisk homogenisering arbejdsbuffer Tilsæt DTT, cycloheximidrekombinant ribonuklease og proteinasehæmmercocktail til homogeniseringsstamopløsningen kun før brug. Det er også vigtigt at forberede frisk lavt salt og vaskebuffere med højt saltindhold inden brug.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotypebestemmelse af plante-og dyrearter Prøver uden forudgående DNA-oprensning

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering af Small noncoding RNA&#39;er fra human serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Metode til måling af aktiviteten af ​​afubiquitinerende Enzymer i cellelinier og vævsprøver

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk aktiveret celle sortering strategier for at isolere og rense Synovial væske-afledte mesenkymale stamceller fra en kanin Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Celle-Type-specifikke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...