Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH R00HD082686. We bedanken de Endocrine Society Summer Research Fellowship aan H.S.Z. We bedanken ook Dr. Yuan Kang voor het fokken en onderhouden van de muizenkolonie.

Alle uitgevoerde dierproeven volgden de protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) aan de Auburn University.
OPMERKING: Het volgende protocol gebruikt één testis (ongeveer 100 mg) bij P28 van Gli1-CreERT2; NuTRAP muizen (Mus musculus). Volumes reagentia moeten mogelijk worden aangepast op basis van de soorten monsters en het aantal weefsels.
1. Weefselverzameling
<ol...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Het nut van de analyse van het hele weefsel transcriptoom kan worden gedempt, vooral bij het bestuderen van complexe heterogene weefsels. Het verkrijgen van celtype-specifieke RNA's wordt een dringende noodzaak om de krachtige RNA-seq-techniek te ontketenen. De isolatie van celtypespecifieke RNA's is meestal afhankelijk van het verzamelen van een specifiek type cellen met behulp van micromanipulatie, fluorescent-activated cell sorting (FACS) of laser capture microdissection (LCM)18. Andere moderne...

High-throughput benaderingen, waaronder RNA-sequencing (RNA-seq) en microarray, hebben het mogelijk gemaakt om genexpressieprofielen op genoombreed niveau te ondervragen. Voor complexe weefsels zoals het hart, de hersenen en testis zullen de celtypespecifieke gegevens meer details geven waarin het gebruik van RNA's uit het hele weefsel wordt vergeleken 1,2,3. Om de impact van cellulaire heterogeniteit te overwinnen, is de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode ontwikkeld sinds het begin van de jaren 20104. TRAP is in staat om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van specifieke celtypen zonder weefseldissociatie. Deze methode is gebruikt voor translatoom (mRNA's die worden gerekruteerd voor het ribosoom voor vertaling) analyse in verschillende organismen, waaronder het richten op een uiterst zeldzame populatie spiercellen in Drosophila embryo's5, het bestuderen van verschillende wortelcellen in de modelplant Arabidopsis thaliana6, en het uitvoeren van transcriptoomanalyse van endotheelcellen bij zoogdieren7.
TRAP vereist een genetische modificatie om het ribosoom van een modelorganisme te labelen. Evan Rosen en collega's hebben onlangs een muismodel ontwikkeld met de naam Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis8, dat sinds 2017 beschikbaar is via het Jackson Laboratory. Door te kruisen met een Cre-muislijn kunnen onderzoekers dit NuTRAP-muismodel gebruiken om ribosoomgebonden RNA's en celkernen te isoleren van Cre-tot expressie brengende cellen zonder celsortering. In Cre-expresserende cellen die ook het NuTRAP-allel dragen, maakt het EGFP / L10a-gelabelde ribosoom de isolatie mogelijk van het vertalen van mRNA's met behulp van affiniteit pulldown-assays. In dezelfde cel maakt het biotine ligase herkenningspeptide (BLRP)-gelabelde kernmembraan, dat ook mCherry-positief is, de nucleaire isolatie mogelijk door gebruik te maken van affiniteits- of fluorescentiegebaseerde zuivering. Hetzelfde onderzoeksteam genereerde ook een vergelijkbare muislijn waarin het kernmembraan alleen wordt gelabeld met mCherry zonder biotine8. Deze twee genetisch gemodificeerde muislijnen geven toegang tot het karakteriseren van gepaarde epigenomische en transcriptomische profielen van specifieke soorten cellen in belang.
De egel (Hh) signaleringsroute speelt een cruciale rol in de weefselontwikkeling9. GLI1, een lid van de GLI-familie, fungeert als een transcriptionele activator en bemiddelt de Hh-signalering. Gli1+ cellen zijn te vinden in veel hormoonafscheidende organen, waaronder de bijnier en de testis. Om celtypespecifieke DNA's en RNA's uit Gli1+ cellen te isoleren met behulp van het NuTRAP-muismodel , werden Gli1-CreERT2-muizen gekruist met de NuTRAP-muizen . Shh-CreERT2-muizen werden ook gekruist met de NuTRAP-muizen die sonische egel (Shh) tot expressie brengen van cellen te isoleren. Het volgende protocol laat zien hoe u Gli1-CreERT2 gebruikt; NuTRAP-muizen om ribosoomgebonden RNA's te isoleren uit Gli1+ cellen in volwassen muistestes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Cellulaire heterogeniteit vormt een uitdaging voor het begrijpen van de functie van complexe weefsels op transcriptoomniveau. Het gebruik van celtypespecifieke RNA's vermijdt potentiële valkuilen veroorzaakt door de heterogeniteit van weefsels en ontketent de krachtige transcriptoomanalyse. Het hier beschreven protocol demonstreert hoe de Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) methode kan worden gebruikt om ribosoomgebonden RNA's te isoleren van een kleine hoeveelheid EGFP-expresserende cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Dit protocol is geschikt voor het isoleren van celtypespecifieke RNA's met behulp van het onlangs beschikbare NuTRAP-muismodel en kan ook worden gebruikt om RNA's te isoleren van EGFP-expressiecellen.

Gli1-CreERT2-muizen (Jackson Lab Stock Number: 007913) werden voor het eerst gekruist met de NuTRAP-reportermuis (Jackson Lab Stock Number: 029899) om dubbelmutante muizen te genereren. Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen (d.w.z. Gli1-CreERT2 en NuTRAP) werden eenmaal daags, om de andere dag, geïnjecteerd met tamoxifen gedurende drie injecties. Weefselmonsters werden verzameld op de7e dag na de1e dag van de injectie. Immunofluoresce...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Dit protocol is gericht op het verkrijgen van hoogwaardige celtypen specifieke RNA's van een klein aantal cellen in een complex weefsel zonder celsortering. Het maakt gebruik van een recent beschikbaar muismodel waarmee onderzoekers een ribosoomgebonden RNA's kunnen isoleren met behulp van GLP pull down. De methode is ook geschikt voor het isoleren van ribosoomgebonden RNA's van EGFP-expressiecellen.Voeg om te beginnen twee milliliter ijskoude homogenisatiewerkbuffer toe aan een glazen weefselslijpset. Plaats het bevroren monster snel in de molen en homogeniseer het weefsel met 30 slagen op ijs met behulp van een losse stamper. breng het homogenaat over in een ronde bodembuis van twee milliliter en centrifugeer op 12.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter zonder de pellet te verstoren, waarbij 100 microliter als ingang wordt gereserveerd. Incubeer het supernatant met het anti-GFP-antilichaam bij vier graden Celsius op een end over end rotator 's nachts. Breng het homogenaat- en antilichaammengsel over in een nieuwe ronde onderbuis van twee milliliter met gewassen eiwitg-kralen en geïncubeerd vier graden Celsius op rotator bij 24 RPM gedurende twee uur.Scheid de magnetische kralen van het supernatant met behulp van een magnetisch rek. Sla het supernatant op als de negatieve fractie die de RNA's bevat in EGFP-negatieve cellen en de RNA's in EGFP-positieve cellen die niet gebonden zijn aan ribosomen. Voeg een milliliter zoutrijke wasbuffer toe aan de kralen en vortex kort de buis om de kralen te wassen.Plaats de buis vervolgens in een magnetisch rek. Verwijder de wasbuffer en herhaal de wasstappen nog twee keer om het ribosoom-RNA-complex van de kralen uit EGFP-positieve cellen te verkrijgen. Incubeer de kralen met 50 microliter extractiebuffer uit de RNA-isolatiekit in een ThermoMixer gedurende 30 minuten om RNA's uit de kralen vrij te maken.Scheid de kralen met een magnetisch rek en breng het supernatant over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende twee minuten op 3000 g. Pipetteer vervolgens het supernatant naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter.Om de RNA-zuiveringskolom vooraf te conditioneren, pipetteer 250 microliter conditioneringsbuffer op de zuiveringskolom en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de kolom op 16.000 g gedurende één minuut. Pipetteer een gelijk volume van 70% ethanol in het celextract en meng goed door pipetteer.Pipetteer tot 200 microliter van het mengsel in de geconditioneerde RNA-zuiveringskolom. Om het verlies van monsters te verminderen, vult u de kolom niet meer dan 80% van zijn capaciteit. Herhaal deze stap meerdere keren totdat alle RNA's in dezelfde kolom van elke fractie zijn verzameld.Centrifugeer de kolom gedurende twee minuten om RNA aan het membraan in de kolom te binden. Ga vervolgens door met centrifugatie gedurende 30 seconden. Gooi de doorstroom weg en pipetteer 100 microliter wasbuffer één in de kolom.Centrifugeer gedurende één minuut en gooi de stroom vervolgens weg. Pipet 75 microliter DNA-oplossing mengt zich rechtstreeks in het zuiveringskolommembraan. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Pipet vervolgens 40 microliter wasbuffer één in de kolom en centrifugeer nog eens 30 seconden. Gooi de stroom weg. Pipetteer 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende één minuut bij 8.000 g.Gooi de stroom weg. Koop PET 100 microliter wasbuffer twee in de kolom en centrifugeer gedurende twee minuten op 16.000 g. Gooi de stroom weg en centrifugeer dezelfde kolom opnieuw op 16.000 g gedurende één minuut om alle sporen van wasbuffer te verwijderen.Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. pipet 12 microliter RNase-vrij water rechtstreeks op het membraan van de zuiveringskolom, zodat de pipetpunt het membraan niet raakt. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 g.Dan op 16.000 G gedurende één minuut om het RNA te elueren. Gebruik een bioanalyzer om de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA te beoordelen. Bewaar de RNA's in een vriezer van 80 graden of verzend ze voor verdere analyse.Muizen met beide genetisch gemanipuleerde gen-allelen, Gli1-CreERT2 en NuTRAP, we worden eenmaal per dag geïnjecteerd met tamoxifen, om de andere dag gedurende drie injecties. Immunofluorescentieanalyse van verzamelde weefsels toont aan dat het EGFP tot expressie kwam in interstitiële cellen in de teelballen. EGFP werd ook gevonden in bijniercapsulaire cellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-muizen.In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-muizen De EGFP-positieve celpopulatie bevindt zich in de buitenste cortex van de bijnier onder de capsule, wat de expressie van EGFP-pre-expresserende cellen bevestigt. Na de extractie van de celtypespecifieke RNA's werd het geëxtraheerde RNA verzonden voor microarray-analyse. De resultaten toonden aan dat ongeveer 3000 genen verrijkt waren in de positieve fractie, vergeleken met genen in de negatieve fractie, terwijl ongeveer 4.000 genen verrijkt waren in de negatieve fractie.Onder de differentieel tot expressie gebrachte genen werden Leydig-celgeassocieerde genen Hsd11b1 en Hsd3b6 verrijkt in de positieve fractie. In de negatieve fractie werden de Sertoli-celgeassocieerde genen Desert Hedgehog en Gstm6 verrijkt. Slechts enkele differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd bij het vergelijken van de negatieve fractie met de input.Realtime kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt om de expressie van sleutelgenen in de positieve en negatieve fracties te bevestigen. Vergelijkbaar met wat werd gevonden in de microarray-assay, werden steroidogene enzymen 3-beta hydroxy steroïde dehydrogenase en cholesterol side chain cleavage enzyme verrijkt in de positieve fractie. Ondertussen werden de Sertoli-celmarker SRY-boxtranscriptiefactor negen en de kiemcelmarker synaptonemaal complexeiwit drie verrijkt in de negatieve fractie.Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om verse homogenisatie werkbuffer te bereiden Voeg DTT, cycloheximide recombinant ribonuclease en proteïnaseremmercocktail toe aan de homogenisatie stockoplossing alleen voor gebruik. Het is ook belangrijk om voor gebruik vers zoutarm en de hoge zoutwasbuffers te bereiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...