Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R00HD082686 unterstützt. Wir danken dem Sommerforschungsstipendium der Endocrine Society an H.S.Z. Wir danken auch Dr. Yuan Kang für die Zucht und Pflege der Mauskolonie.

Alle durchgeführten Tierversuche folgten den Protokollen, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der Auburn University genehmigt wurden.
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet einen Hoden (ca. 100 mg) bei P28 von Gli1-CreERT2; NuTRAP-Mäuse (Mus musculus). Das Volumen der Reagenzien muss möglicherweise basierend auf der Art der Proben und der Anzahl der Gewebe angepasst werden.
1. Gewebeentnahme</stro...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Die Nützlichkeit der Ganzgewebe-Transkriptom-Analyse könnte gedämpft werden, insbesondere bei der Untersuchung komplexer heterogener Gewebe. Wie man zelltypspezifische RNAs erhält, wird zu einer dringenden Notwendigkeit, die leistungsstarke RNA-seq-Technik zu entfesseln. Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs beruht in der Regel auf der Sammlung eines bestimmten Zelltyps mittels Mikromanipulation, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)18. Andere ...

Hochdurchsatzansätze, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Microarray, haben es ermöglicht, Genexpressionsprofile auf genomweiter Ebene abzufragen. Für komplexe Gewebe wie Herz, Gehirn und Hoden liefern die zelltypspezifischen Daten mehr Details zum Vergleich der Verwendung von RNAs aus dem gesamten Gewebe 1,2,3. Um die Auswirkungen der zellulären Heterogenität zu überwinden, wurde seit Anfang der 2010er Jahre die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) entwickelt4. TRAP ist in der Lage, Ribosom-gebundene RNAs aus bestimmten Zelltypen ohne Gewebedissoziation zu isolieren. Diese Methode wurde für die Translatomanalyse (mRNAs, die zur Translation in das Ribosom rekrutiert werden) in verschiedenen Organismen verwendet, einschließlich der Ausrichtung auf eine extrem seltene Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen5, der Untersuchung verschiedener Wurzelzellen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana6 und der Durchführung einer Transkriptomanalyse von Endothelzellen in Säugetieren7.
TRAP erfordert eine genetische Veränderung, um das Ribosom eines Modellorganismus zu markieren. Evan Rosen und Kollegen entwickelten kürzlich ein Mausmodell namens Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, das seit 2017 über das Jackson Laboratory erhältlich ist. Durch Kreuzung mit einer Cre-Mauslinie können Forscher dieses NuTRAP-Mausmodell verwenden, um Ribosomen-gebundene RNAs und Zellkerne aus Cre-exprimierenden Zellen ohne Zellsortierung zu isolieren. In Cre-exprimierenden Zellen, die auch das NuTRAP-Allel tragen, ermöglicht das EGFP/L10a-markierte Ribosom die Isolierung translatierender mRNAs unter Verwendung von Affinitäts-Pulldown-Assays. An derselben Zelle ermöglicht die Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markierte Kernmembran, die ebenfalls mCherry-positiv ist, die nukleare Isolierung durch affinitäts- oder fluoreszenzbasierte Reinigung. Das gleiche Forscherteam erzeugte auch eine ähnliche Mauslinie, in der die Kernmembran nur mit mCherry ohne Biotin8 markiert ist. Diese beiden genetisch veränderten Mauslinien ermöglichen die Charakterisierung gepaarter epigenomischer und transkriptomischer Profile bestimmter Zelltypen.
Der Hedgehog (Hh)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebeentwicklung9. GLI1, ein Mitglied der GLI-Familie, fungiert als transkriptioneller Aktivator und vermittelt die Hh-Signalisierung. Gli1+ Zellen können in vielen hormonsezernierenden Organen gefunden werden, einschließlich der Nebenniere und des Hodens. Um zelltypspezifische DNAs und RNAs aus Gli1+-Zellen mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren, wurden Gli1-CreERT2-Mäuse mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt. Shh-CreERT2-Mäuse wurden auch mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt, um Schalligel (Shh) exprimierende Zellen zu isolieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie Gli1-CreERT2 verwendet wird. NuTRAP-Mäuse isolieren Ribosomen-gebundene RNAs aus Gli1+-Zellen in erwachsenen Maushoden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Die zelluläre Heterogenität stellt das Verständnis der Funktion komplexer Gewebe auf Transkriptomebene vor Herausforderungen. Die Verwendung zelltypspezifischer RNAs vermeidet potenzielle Fallstricke, die durch die Heterogenität von Geweben verursacht werden, und löst die leistungsstarke Transkriptomanalyse aus. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) verwendet werden kann, um Ribosomen-gebundene RNAs aus einer kleinen Menge EGFP-exprimierender Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung zelltypspezifischer RNAs mit dem kürzlich verfügbaren NuTRAP-Mausmodell und könnte auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.

Die Gli1-CreERT2-Maus (Jackson Lab Stock Number: 007913) wurde zuerst mit der NuTRAP-Reportermaus (Jackson Lab Stock Number: 029899) gekreuzt, um Doppelmutantenmäuse zu erzeugen. Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele (d.h. Gli1-CreERT2 und NuTRAP) trugen, wurde Tamoxifen einmal täglich, jeden zweiten Tag, für drei Injektionen injiziert. Die Gewebeproben wurden am 7. Tag nach dem 1. Tag der Injektion entnommen. Die Immunfluoreszenza...

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Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.

Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, qualitativ hochwertige zelltypspezifische RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu erhalten. Es verwendet ein kürzlich verfügbares Mausmodell, das es Forschern ermöglicht, eine ribosomgebundene RNA mittels GLP-Pulldown zu isolieren. Die Methode eignet sich auch zur Isolierung von Ribosomen-gebundenen RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen.Fügen Sie zunächst zwei Milliliter eiskalter Homogenisierungsarbeitspuffer zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel. Das Homogenat in ein Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr überführen und bei 12.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Dann wird der Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr überführt, ohne das Pellet zu stören, wobei 100 Mikroliter als Input reserviert werden. Inkubieren Sie den Überstand mit dem Anti-GFP-Antikörper bei vier Grad Celsius auf einem End-over-End-Rotator über Nacht. Das Homogenat-Antikörper-Gemisch wird in ein neues Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr mit gewaschenen Protein-G-Perlen überführt und zwei Stunden lang vier Grad Celsius auf Rotator bei 24 U/min inkubiert.Trennen Sie die magnetischen Perlen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als die negative Fraktion, die die RNAs in EGFP-negativen Zellen und die RNAs in EGFP-positiven Zellen enthält, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Fügen Sie einen Milliliter Salzwäschepuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Rohr kurz an, um die Perlen zu waschen.Legen Sie dann die Röhre in ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male, um den Ribosomen-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die Beads mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit in einem ThermoMixer für 30 Minuten, um RNAs aus den Beads freizusetzen.Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell und überführen Sie den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 g für zwei Minuten. Dann pipetten Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr.Um die RNA-Reinigungskolonne vorzukonditionieren, pipetten Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 g für eine Minute. Pipettieren Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in den Zellextrakt und mischen Sie gut durch Pipettieren.Pipettieren Sie bis zu 200 Mikroliter der Mischung in die vorkonditionierte RNA-Reinigungskolonne. Um den Verlust von Proben zu reduzieren, füllen Sie die Säule nicht mehr als 80% ihrer Kapazität. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, bis alle RNAs in derselben Spalte jeder Fraktion gesammelt sind.Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten, um RNA an die Membran in der Säule zu binden. Dann setzen Sie die Zentrifugation für 30 Sekunden fort. Entsorgen Sie den Durchfluss und pipettieren Sie 100 Mikroliter Waschpuffer in die Säule.Eine Minute zentrifugieren und dann den Durchfluss verwerfen. Pipettieren Sie 75 Mikroliter DNA-Lösung direkt in die Membran der Reinigungskolonne. Bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.Dann pipetten Sie 40 Mikroliter Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie weitere 30 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss. 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne pipettieren und bei 8.000 g für eine Minute zentrifugieren.Verwerfen Sie den Durchfluss. Kaufen Sie PET 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne und zentrifugieren Sie bei 16.000 g für zwei Minuten. Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie die gleiche Kolonne bei 16.000 g für eine Minute, um alle Spuren des Waschpuffers zu entfernen.Die Säule wird in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pipettieren Sie 12 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze die Membran nicht berührt. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und eine Minute bei 1000 g zentrifugieren.Dann bei 16, 000 G für eine Minute, um die RNA zu eluieren. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA zu beurteilen. Lagern Sie die RNAs in einem 80-Grad-Gefrierschrank oder senden Sie sie zur weiteren Analyse aus.Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele tragen, Gli1-CreERT2 und NuTRAP, wird uns einmal täglich Tamoxifen injiziert, jeden zweiten Tag für drei Injektionen. Immunfluoreszenzanalysen von gesammelten Geweben zeigen, dass das EGFP in interstitiellen Zellen in den Hoden exprimiert wurde. EGFP wurde auch in Nebennierenkapselzellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-Mäusen gefunden.In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-Mäusen Die EGFP-positive Zellpopulation befindet sich im äußeren Kortex der Nebenniere unter der Kapsel, was die Expression von EGFP-präexprimierenden Zellen bestätigt. Nach der Extraktion der zelltypspezifischen RNAs wurde die extrahierte RNA zur Microarray-Analyse geschickt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 3000 Gene in der positiven Fraktion angereichert waren, verglichen mit Genen in der negativen Fraktion, während etwa 4.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren.Unter den differentiell exprimierten Genen waren die Leydig-Zell-assoziierten Gene Hsd11b1 und Hsd3b6 in der positiven Fraktion angereichert. In der negativen Fraktion wurden die Sertoli-Zell-assoziierten Gene Desert Hedgehog und Gstm6 angereichert. Beim Vergleich der negativen Fraktion mit dem Input wurden nur wenige differentiell exprimierte Gene identifiziert.Die quantitative RT-PCR in Echtzeit wurde verwendet, um die Expression von Schlüsselgenen in den positiven und negativen Fraktionen zu bestätigen. Ähnlich wie im Microarray-Assay wurden steroidogene Enzyme 3-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym in der positiven Fraktion angereichert. In der Zwischenzeit wurden der Sertoli-Zellmarker SRY-Box-Transkriptionsfaktor neun und der Keimzellmarker synaptonemales Komplexprotein drei in der negativen Fraktion angereichert.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, einen frischen Homogenisierungsarbeitspuffer vorzubereiten Fügen Sie DTT, rekombinante Ribonuclease Cycloheximid und Proteinase-Inhibitor-Cocktail nur vor Gebrauch zur Homogenisierungs-Stammlösung hinzu. Es ist auch wichtig, frisches niedriges Salz und die hohen Salzwäschepuffer vor Gebrauch vorzubereiten.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Technik zur Analyse von Zelltyp-spezifischen Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...