Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til H.S.Z. Vi takker også Dr. Yuan Kang for avl og vedlikehold av musekolonien.

Alle utførte dyreforsøk fulgte protokollene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved Auburn University.
MERK: Følgende protokoll bruker en testis (ca. 100 mg) ved P28 fra Gli1-CreERT2; NuTRAP mus (Mus musculus). Volumer av reagenser må kanskje justeres basert på typer prøver og antall vev.
1. Vevssamling
<ol><li>Avliv musene ved hjelp av et CO2-kammer , desinfiser mageoverfl...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Nytten av helvevstranskriptomanalysen kan dempes, spesielt når man studerer komplekse heterogene vev. Hvordan skaffe celletypespesifikke RNA blir et presserende behov for å frigjøre den kraftige RNA-seq-teknikken. Isoleringen av celletypespesifikke RNA er vanligvis avhengig av innsamling av en bestemt type celler ved hjelp av mikromanipulering, fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodisseksjon (LCM)18. Andre moderne single-cell innsamlingsmetoder og instrumenter med...

High-throughput-tilnærminger, inkludert RNA-sekvensering (RNA-seq) og mikroarray, har gjort det mulig å forhøre genuttrykksprofiler på genomnivå. For komplekse vev som hjerte, hjerne og testis, vil de celletypespesifikke dataene gi flere detaljer som sammenligner bruken av RNA fra hele vevet 1,2,3. For å overvinne virkningen av cellulær heterogenitet, har TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) blitt utviklet siden tidlig på 2010-tallet4. TRAP er i stand til å isolere ribosombundne RNA fra spesifikke celletyper uten vevsdissosiasjon. Denne metoden har blitt brukt til translatomanalyse (mRNA som rekrutteres til ribosomet for oversettelse) i forskjellige organismer, inkludert målretting mot en ekstremt sjelden populasjon av muskelceller i Drosophila-embryoer5, studere forskjellige rotceller i modellplanten Arabidopsis thaliana6, og utføre transkriptomanalyse av endotelceller hos pattedyr7.
TRAP krever en genetisk modifisering for å merke ribosomet til en modellorganisme. Evan Rosen og kolleger utviklet nylig en musemodell kalt Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har vært tilgjengelig gjennom Jackson Laboratory siden 2017. Ved å krysse med en Cre-muselinje, kan forskere bruke denne NuTRAP-musemodellen til å isolere ribosombundne RNAer og cellekjerner fra Cre-uttrykkende celler uten cellesortering. I Cre-uttrykkende celler som også bærer NuTRAP-allelet , tillater EGFP / L10a-merket ribosom isolering av oversettelse av mRNA ved hjelp av affinitetsnedtrekksanalyser. I samme celle tillater biotinligasegjenkjenningspeptidet (BLRP) -merket nukleær membran, som også er mCherry-positiv, den kjernefysiske isolasjonen ved å bruke affinitets- eller fluorescensbasert rensing. Det samme forskerteamet genererte også en lignende muselinje der kjernemembranen bare er merket med mCherry uten biotin8. Disse to genmodifiserte muselinjene gir tilgang til å karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler av spesifikke typer celler i interesse.
Pinnsvinet (Hh) signalveien spiller en kritisk rolle i vevsutvikling9. GLI1, et medlem av GLI-familien, fungerer som en transkripsjonsaktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+-celler finnes i mange hormonutskillende organer, inkludert binyrene og testisene. For å isolere celletypespesifikke DNAer og RNA fra Gli1+-celler ved hjelp av NuTRAP-musemodellen, ble Gli1-CreERT2-mus krysset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus ble også krysset med NuTRAP-musene som mål å isolere sonisk pinnsvin (Shh) som uttrykker celler. Følgende protokoll viser hvordan du bruker Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus for å isolere ribosombundne RNA fra Gli1+-celler i voksne musetester.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Cellulær heterogenitet gir utfordringer for å forstå funksjonen til komplekse vev på transkriptomnivå. Ved å bruke celletypespesifikke RNA unngår potensielle fallgruver forårsaket av heterogeniteten til vev og frigjør den kraftige transkriptomanalysen. Protokollen beskrevet her demonstrerer hvordan du bruker TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) for å isolere ribosombundne RNA fra en liten mengde EGFP-uttrykkende celler i et komplekst vev uten cellesortering. Denne protokollen er egnet for å isolere celletypespesifikke RNAer ved hjelp av den nylig tilgjengelige NuTRAP-musemodellen , og kan også brukes til å isolere RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.

Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) ble først krysset med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) for å generere dobbeltmutante mus. Mus som bærer begge genmodifiserte genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 og NuTRAP) ble injisert med tamoxifen en gang daglig, annenhver dag, for tre injeksjoner. Vevsprøver ble tatt den 7. dagen etter injeksjonens 1.dag. Immunfluorescensanalyse viste at EGFP ble uttrykt i interstitielle celle...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Denne protokollen tar sikte på å isolere celletypespesifikke oversette ribosomale mRNA ved hjelp av NuTRAP-musemodellen.

Isoler celletypespesifikke RNAer fra snapfrosne heterogene vevsprøver uten cellesortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Denne protokollen tar sikte på å oppnå høy kvalitet celletyper spesifikke RNA fra et lite antall celler i et komplekst vev uten cellesortering. Den bruker en nylig tilgjengelig musemodell som gjør det mulig for forskere å isolere et ribosombundet RNA ved hjelp av GLP-nedtrekk. Metoden er også egnet for å isolere ribosombundne RNA fra alle EGFP-uttrykkende celler.For å begynne med, legg til to milliliter iskald homogeniseringsarbeidsbuffer til et glassvevkvernsett. Legg den frosne prøven raskt i kvernen og homogeniser vevet med 30 slag på is ved hjelp av en løs pestle. Overfør homogenatet til et to milliliter rundbunnsrør og sentrifuger ved 12.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Overfør deretter supernatanten til et nytt to milliliter rør uten å forstyrre pelleten, og reserver 100 mikroliter som inngang. Inkuber supernatanten med anti-GFP-antistoffet ved fire grader Celsius på en ende over ende rotator over natten. Overfør homogenat- og antistoffblandingen til et nytt to milliliter rundbunnsrør som inneholder vasket protein g-perler og inkuberes fire grader Celsius på rotator ved 24 o / min i to timer.Skill de magnetiske perlene fra supernatanten ved hjelp av et magnetisk stativ. Lagre supernatanten som den negative fraksjonen som inneholder RNA i EGFP-negative celler og RNA i EGFP-positive celler som ikke er bundet til ribosomer. Tilsett en milliliter høy saltvaskbuffer til perlene og vortex kort røret for å vaske perlene.Plasser deretter røret i et magnetisk stativ. Fjern vaskebufferen og gjenta vasketrinnene to ganger til for å oppnå perlene ribosom-RNA-komplekset fra EGFP-positive celler. Inkuber perlene med 50 mikroliter ekstraksjonsbuffer fra RNA-isolasjonssettet i en ThermoMixer i 30 minutter for å frigjøre RNA fra perlene.Skill perlene med et magnetisk stativ og overfør supernatanten til et 1,5 milliliter rør. Sentrifuge røret ved 3000 g i to minutter. Pipetter deretter supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør.For å forhåndskondisjonere RNA-rensingskolonnen, pipetter 250 mikroliter kondisjoneringsbuffer på rensekolonnen og inkuberes i fem minutter ved romtemperatur. Sentrifuger deretter kolonnen ved 16.000 g i ett minutt. Pipette et likt volum av 70% etanol inn i celleekstraktet og bland godt ved pipettering.Pipette opptil 200 mikroliter av blandingen inn i den forutbestemte RNA-rensingskolonnen. Hvis du vil redusere tapet av prøver, må du ikke fylle kolonnen mer enn 80 % av kapasiteten. Gjenta dette trinnet flere ganger til alle RNA er samlet i samme kolonne i hver fraksjon.Sentrifuge kolonnen i to minutter for å binde RNA til membranen i kolonnen. Fortsett deretter sentrifugering i 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen og pipett 100 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen.Sentrifuge i ett minutt, og kast deretter gjennomstrømningen. Pipette 75 mikroliter DNA-løsning blandes direkte inn i rensekolonnemembranen. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.Deretter pipetter 40 mikroliter vaskebuffer en inn i kolonnen og sentrifugen i ytterligere 30 sekunder. Kast gjennomstrømningen. Pipette 100 mikroliter vaskebuffer to inn i kolonnen og sentrifugen ved 8.000 g i ett minutt.Kast gjennomstrømningen. Kjøp PET 100 mikroliter vaskebuffer to i kolonnen og sentrifuge ved 16.000 g i to minutter. Kast gjennomstrømningen, og sentrifuger den samme kolonnen ved 16.000 g i ett minutt for å fjerne alle spor av vaskebuffer.Overfør kolonnen til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. pipette 12 mikroliter RNasefritt vann direkte på membranen i rensekolonnen, slik at pipettespissen ikke berører membranen. Inkuber ved romtemperatur i ett minutt og sentrifuger ved 1000 g i ett minutt.Deretter ved 16.000 G i ett minutt for å eluere RNA. Bruk en bioanalysator for å vurdere kvaliteten og mengden av det ekstraherte RNA. Oppbevar RNA i en 80 graders fryser eller send ut for videre analyse.Mus som bærer både genmodifiserte genalleler, Gli1-CreERT2 og NuTRAP, blir injisert med tamoxifen en gang om dagen, annenhver dag for tre injeksjoner. Immunfluorescensanalyse av oppsamlet vev viser at EGFP ble uttrykt i interstitielle celler i testiklene. EGFP ble også funnet i binyrene capsulære celler i Gli1-CreERT2, NuTRAP mus.I Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-mus Den EGFP-positive cellepopulasjonen ligger i den ytre cortex av binyrene under kapselen, og bekrefter uttrykket av EGFP-foruttrykkende celler. Etter ekstraksjonen av celletypespesifikke RNAer ble det ekstraherte RNA sendt til mikroarray-analyse. Resultatene viste at ca. 3000 gener var beriket i den positive fraksjonen, sammenlignet med gener i den negative fraksjonen, mens ca. 4000 gener ble beriket i den negative fraksjonen.Blant de differensialuttrykte genene ble Leydig-celleassosierte gener Hsd11b1 og Hsd3b6 beriket i den positive fraksjonen. I den negative fraksjonen ble de Sertoli-celleassosierte genene Desert Hedgehog og Gstm6 beriket. Bare noen få differensielt uttrykte gener ble identifisert ved å sammenligne den negative fraksjonen med inngangen.Realtime kvantitativ RT-PCR ble brukt til å bekrefte uttrykket av nøkkelgener i de positive og negative fraksjonene. I likhet med det som ble funnet i mikromatriseanalysen, ble steroidogene enzymer 3-beta hydroksysteroid dehydrogenase og kolesterol sidekjede spaltningsenzym beriket i den positive fraksjonen. I mellomtiden ble Sertoli-cellemarkøren SRY-bokstranskripsjonsfaktor ni og kimcellemarkøren synaptonemal komplekst protein tre beriket i den negative fraksjonen.Når du prøver denne protokollen, er det viktig å forberede fersk homogeniseringsarbeidsbuffer Tilsett DTT, cykloheksimid rekombinant ribonuklease og proteinaseinhibitorcocktail til homogeniseringsstamløsningen bare før bruk. Det er også viktig å tilberede ferske lavsalt- og høysaltvaskebuffere før bruk.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotyping av planter og dyr prøver uten Prior DNA Rensing

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av Small kodende RNA fra Menneskelig Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Metode for måling av aktiviteten til Deubiquitinating Enzymer i cellelinjer og vevsprøver

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktivert celle sortering strategier for å isolere og rense Synovial Fluid-avledet Mesenchymal stamceller fra en kanin modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...