Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo NIH R00HD082686. Agradecemos à Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Também agradecemos ao Dr. Yuan Kang por criar e manter a colônia de ratos.

Todos os experimentos em animais realizados seguiram os protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Auburn.
NOTA: O protocolo a seguir usa um testículo (cerca de 100 mg) em P28 de Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Mus musculus). Os volumes de reagentes podem precisar ser ajustados com base nos tipos de amostras e no número de tecidos.
1. Coleta de tecidos
...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

A utilidade da análise do transcriptoma de todo o tecido pode ser atenuada, especialmente quando se estuda tecidos heterogêneos complexos. Como obter RNAs específicos do tipo celular torna-se uma necessidade urgente para liberar a poderosa técnica de RNA-seq. O isolamento de RNAs específicos do tipo celular geralmente depende da coleta de um tipo específico de células usando micromanipulação, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou microdissecção por captura a laser (LCM)...

Abordagens de alto rendimento, incluindo sequenciamento de RNA (RNA-seq) e microarray, tornaram possível interrogar perfis de expressão gênica no nível de todo o genoma. Para tecidos complexos, como coração, cérebro e testículos, os dados específicos do tipo celular fornecerão mais detalhes comparando o uso de RNAs de todo o tecido 1,2,3. Para superar o impacto da heterogeneidade celular, o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) vem sendo desenvolvido desde o início da década de 20104. O TRAP é capaz de isolar RNAs ligados a ribossomos de tipos celulares específicos sem dissociação tecidual. Este método tem sido utilizado para análise de translatomos (mRNAs que estão sendo recrutados para o ribossomo para tradução) em diferentes organismos, incluindo a segmentação de uma população extremamente rara de células musculares em embriões de Drosophila5, o estudo de diferentes células radiculares na planta modelo Arabidopsis thaliana6 e a realização de análise de transcriptoma de células endoteliais em mamíferos7.
O TRAP requer uma modificação genética para marcar o ribossomo de um organismo modelo. Evan Rosen e seus colegas desenvolveram recentemente um modelo de rato chamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)mouse 8, que está disponível no Jackson Laboratory desde 2017. Ao cruzar com uma linha de camundongo Cre, os pesquisadores podem usar este modelo de camundongo NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos e núcleos celulares de células que expressam Cre sem classificação celular. Em células que expressam Cre que também carregam o alelo NuTRAP , o ribossomo marcado com EGFP/L10a permite o isolamento de mRNAs de tradução usando ensaios pulldown de afinidade. Na mesma célula, a membrana nuclear marcada com peptídeo de reconhecimento de ligase de biotina (BLRP), que também é mCherry positivo, permite o isolamento nuclear usando purificação baseada em afinidade ou fluorescência. A mesma equipe de pesquisa também gerou uma linha de camundongo semelhante na qual a membrana nuclear é marcada apenas com mCherry sem biotina8. Essas duas linhagens de camundongos geneticamente modificados dão acesso para caracterizar perfis epigenômicos e transcriptômicos emparelhados de tipos específicos de células em interesse.
A via de sinalização do ouriço (Hh) desempenha um papel crítico no desenvolvimento tecidual9. GLI1, um membro da família GLI, atua como um ativador transcricional e medeia a sinalização Hh. As células Gli1+ podem ser encontradas em muitos órgãos secretores de hormônios, incluindo a glândula adrenal e o testículo. Para isolar DNAs e RNAs específicos do tipo celular de células Gli1+ usando o modelo de camundongo NuTRAP, camundongos Gli1-CreERT2 foram cruzados com os camundongos NuTRAP. Camundongos Shh-CreERT2 também foram cruzados com os camundongos NuTRAP com o objetivo de isolar células expressivas de ouriço sônico (Shh). O protocolo a seguir mostra como usar o Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos de células Gli1+ em testículos de camundongos adultos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

A heterogeneidade celular coloca desafios para a compreensão da função de tecidos complexos em um nível de transcriptoma. O uso de RNAs específicos do tipo celular evita possíveis armadilhas causadas pela heterogeneidade dos tecidos e desencadeia a poderosa análise do transcriptoma. O protocolo descrito aqui demonstra como usar o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) para isolar RNAs ligados a ribossomos de uma pequena quantidade de células que expressam EGFP em um tecido complexo sem classificação celular. Este protocolo é adequado para isolar RNAs específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP recentemente disponível e também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.

O rato Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) foi cruzado pela primeira vez com o rato repórter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para gerar ratos com dupla mutação. Camundongos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados (ou seja, Gli1-CreERT2 e NuTRAP) foram injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias, para três injeções. As amostras de tecido foram coletadas no 7º dia após o1º dia da i...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Este protocolo visa obter RNAs específicos de tipos celulares de alta qualidade a partir de um pequeno número de células em um tecido complexo sem classificação celular. Ele emprega um modelo de rato recentemente disponível que permite aos pesquisadores isolar um RNAs ligados ao ribossomo usando GLP pull down. O método também é adequado para isolar RNAs ligados a ribossomos de quaisquer células que expressem EGFP.Para começar, adicione dois mililitros de tampão de trabalho de homogeneização gelado a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto. transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 12.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros sem perturbar o pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar o sobrenadante com o anticorpo anti-GFP a quatro graus Celsius em um rotador de extremidade sobre extremidade durante a noite. Transfira a mistura de homogeneizados e anticorpos para um novo tubo de fundo redondo de dois mililitros contendo grânulos de proteína g lavados e incubado quatro graus Celsius no rotador a 24 RPM por duas horas.Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a fração negativa que contém os RNAs em células negativas EGFP e os RNAs em células positivas EGFP que não estão ligadas a ribossomos. Adicione um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas.Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético. Remova o tampão de lavagem e repita as etapas de lavagem mais duas vezes para obter o complexo de RNA ribossomo de contas de células positivas para EGFP. Incubar as contas com 50 microlitros de tampão de extração do kit de isolamento de RNA em um ThermoMixer por 30 minutos para liberar RNAs das contas.Separe as contas com um rack magnético e transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 3000 g durante dois minutos. Em seguida, pipete o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.Para pré-condicionar a coluna de purificação de RNA, pipete 250 microlitros de tampão condicionante para a coluna de purificação e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a coluna a 16 000 g durante um minuto. Pipetar um volume igual de etanol a 70% para o extracto da célula e misturar bem por pipetagem.Pipetar até 200 microlitros da mistura para a coluna de purificação de RNA pré-condicionada. Para reduzir a perda de amostras não encher a coluna mais de 80% da sua capacidade. Repita esta etapa várias vezes até que todos os RNAs sejam coletados na mesma coluna de cada fração.Centrifugar a coluna por dois minutos para ligar o RNA à membrana na coluna. Em seguida, continue a centrifugação por 30 segundos. Descarte o fluxo através e pipete 100 microlitros de tampão de lavagem um na coluna.Centrifugar por um minuto e, em seguida, descartar o fluxo. Pipeta 75 microlitros de solução de DNA misturam-se diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos.Em seguida, pipete 40 microlitros de tampão de lavagem um na coluna e centrifugar por mais 30 segundos. Descarte o fluxo. Pipetar 100 microlitros de tampão de lavagem dois para a coluna e centrifugar a 8 000 g durante um minuto.Descarte o fluxo. Compre PET 100 microlitros de tampão de lavagem dois na coluna e centrífuga a 16.000 g por dois minutos. Descarte o fluxo e recentrifugar a mesma coluna a 16.000 g por um minuto para remover todos os vestígios de tampão de lavagem.Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. pipeta 12 microlitros de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna de purificação, garantindo que a ponta da pipeta não toque na membrana. Incubar à temperatura ambiente durante um minuto e centrifugar a 1000 g durante um minuto.Em seguida, a 16.000 G por um minuto para eluir o RNA. Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA extraído. Armazene os RNAs em um freezer de 80 graus ou envie para uma análise mais aprofundada.Ratos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados, Gli1-CreERT2 e NuTRAP, somos injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias para três injeções. A análise de imunofluorescência dos tecidos coletados mostra que o EGFP foi expresso em células intersticiais nos testículos. O EGFP também foi encontrado em células capsulares adrenais em camundongos Gli1-CreERT2, NuTRAP.Em Sonic Hedgehog-CreERT2, camundongos NuTRAP A população de células positivas para EGFP reside no córtex externo da glândula adrenal sob a cápsula, confirmando a expressão de células pré-expressas de EGFP. Após a extração dos RNAs específicos do tipo celular, o RNA extraído foi enviado para análise de microarray. Os resultados mostraram que cerca de 3000 genes foram enriquecidos na fração positiva, em comparação com os genes na fração negativa, enquanto cerca de 4.000 genes foram enriquecidos na fração negativa.Dentre os genes diferenciais expressos, os genes associados às células de Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 foram enriquecidos na fração positiva. Na fração negativa, os genes associados à célula de Sertoli Ouriço do Deserto e Gstm6 foram enriquecidos. Apenas alguns genes diferencialmente expressos foram identificados na comparação da fração negativa com a entrada.RT-PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para confirmar a expressão de genes-chave nas frações positiva e negativa. Semelhante ao que foi encontrado no ensaio de microarray, as enzimas esteroidogênicas 3-beta hidroxi esteroide desidrogenase e a enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol foram enriquecidas na fração positiva. Enquanto isso, o marcador de células de Sertoli SRY box transcription factor nine e o marcador de células germinativas synaptonemal complex protein three foram enriquecidos na fração negativa.Ao tentar este protocolo, é importante preparar o tampão de trabalho de homogeneização fresco Adicionar TDT, riboniceração recombinante ciclo-heximida e coquetel inibidor de proteinase à solução de estoque de homogeneização somente antes do uso. Também é importante preparar o baixo teor de sal fresco e os tampões de lavagem com alto teor de sal antes do uso.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotipagem de amostras de plantas e animais, sem purificação DNA Antes

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolamento de ARN a partir de pequenas não-codificante de Soro Humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...