Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана NIH R00HD082686. Мы благодарим Летнюю исследовательскую стипендию Эндокринного общества H.S.Z. Мы также благодарим доктора Юань Кана за разведение и поддержание колонии мышей.

Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Обернском университете.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует одно яичко (около 100 мг) при...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Полезность анализа транскриптома всей ткани может быть ослаблена, особенно при изучении сложных гетерогенных тканей. Как получить специфические для клеток РНК становится насущной необходимостью для высвобождения мощной техники РНК-seq. Выделение специфических для клеток РНК обычно о?...

Высокопроизводительные подходы, включая секвенирование РНК (RNA-seq) и микрочипы, позволили исследовать профили экспрессии генов на уровне всего генома. Для сложных тканей, таких как сердце, мозг и яичко, специфические для клеточного типа данные предоставят более подробную информацию, сравнивающую использование РНК из всей ткани 1,2,3. Чтобы преодолеть влияние клеточной гетерогенности, с начала 2010-х годов был разработан метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP)4. TRAP способен изолировать рибосомно-связанные РНК из определенных типов клеток без диссоциации тканей. Этот метод был использован для анализа транслейлома (мРНК, которые набираются в рибосому для трансляции) в различных организмах, включая нацеливание на чрезвычайно редкую популяцию мышечных клеток в эмбрионах дрозофилы5, изучение различных корневых клеток в модельном растении Arabidopsis thaliana6 и выполнение транскриптомного анализа эндотелиальных клеток у млекопитающих7.
TRAP требует генетической модификации для маркировки рибосомы модельного организма. Эван Розен и его коллеги недавно разработали модель мыши под названием Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, которая доступна через Лабораторию Джексона с 2017 года. Пересекаясь с линией мыши Cre, исследователи могут использовать эту модель мыши NuTRAP для выделения рибосомных РНК и клеточных ядер из Cre-экспрессирующих клеток без сортировки клеток. В cre-экспрессирующих клетках, которые также несут аллель NuTRAP , рибосома с меткой EGFP / L10a позволяет изолировать транслирующие мРНК с использованием аффинных вытягивающих анализов. В той же клетке ядерная мембрана, помеченная пептидом распознавания биотин-лигазы (BLRP), которая также является mCherry положительной, позволяет ядерную изоляцию с использованием аффинной или флуоресцентной очистки. Та же исследовательская группа также создала аналогичную линию мышей, в которой ядерная мембрана помечена только mCherry без биотина8. Эти две генетически модифицированные линии мыши дают доступ к характеристике парных эпигеномных и транскриптомных профилей конкретных типов клеток, представляющих интерес.
Сигнальный путь ежа (Hh) играет решающую роль в развитии тканей9. GLI1, член семейства GLI, действует как транскрипционный активатор и опосредует передачу сигналов Hh. Клетки Gli1+ можно найти во многих гормон-секретирующих органах, включая надпочечники и яичко. Чтобы изолировать специфические для клеток ДНК и РНК из клеток Gli1+ с использованием мышиной модели NuTRAP , мышей Gli1-CreERT2 скрещивали с мышами NuTRAP . Мышей Shh-CreERT2 также скрещивали с мышами NuTRAP с целью выделения клеток, экспрессирующих звукового ежа (Shh). Следующий протокол показывает, как использовать Gli1-CreERT2; Мыши NuTRAP для выделения рибосомно-связанных РНК из клеток Gli1+ во взрослых мышах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Клеточная гетерогенность создает проблемы для понимания функции сложных тканей на уровне транскриптома. Использование специфических для клеточного типа РНК позволяет избежать потенциальных ловушек, вызванных неоднородностью тканей, и высвобождает мощный анализ транскриптома. Протокол, описанный здесь, демонстрирует, как использовать метод трансляционной рибосомной аффинной очистки (TRAP) для выделения рибосомно-связанных РНК из небольшого количества EGFP-экспрессирующих клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Этот протокол подходит для выделения специфических для клеток РНК с использованием недавно доступной мышиной модели NuTRAP , а также может быть использован для выделения РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.

Мыши Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) были впервые скрещены с мышью-репортером NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) для генерации двухмутантных мышей. Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов (то есть Gli1-CreERT2 и NuTRAP), вводили тамоксифен один раз в день, через день, в течение т?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Этот протокол направлен на изоляцию специфических для клеточного типа транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP.

Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Этот протокол направлен на получение высококачественных специфических РНК типов клеток из небольшого количества клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Он использует недавно доступную модель мыши, которая позволяет исследователям изолировать рибосомные связанные РНК с помощью GLP pull down. Метод также подходит для выделения рибосомных связанных РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.Для начала добавьте два миллилитра рабочего буфера гомогенизации ледяного холода в комплект измельчителя стеклянной ткани. Быстро поместите замороженный образец в мясорубку и гомогенизируйте ткань 30 ударами по льду с помощью рыхлого пестика. переложить гомогенат на двухмиллилитровую трубку с круглым дном и центрифугу по 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Затем перенесите супернатант в новую двухмиллилитровую трубку, не нарушая гранулу, резервируя 100 микролитров в качестве входных данных. Инкубируйте супернатант с антителом против GFP при четырех градусах Цельсия на конце торцевого ротатора в течение ночи. Переложите смесь гомогената и антител в новую двухмиллилитровую трубку с круглым дном, содержащую промытые белковые шарики g, и инкубировали четыре градуса Цельсия на ротаторе при 24 об/мин в течение двух часов.Отделите магнитные шарики от супернатанта с помощью магнитной стойки. Сохраните супернатант как отрицательную фракцию, которая содержит РНК в отрицательных клетках EGFP и РНК в положительных клетках EGFP, которые не связаны с рибосомами. Добавьте один миллилитр буфера для промывки высокой соли в бусины и ненадолго вихрьте трубку, чтобы промыть бусины.Затем поместите трубку в магнитную стойку. Удалите буфер промывки и повторите шаги промывки еще два раза, чтобы получить комплекс РНК рибосомы шариков из EGFP-положительных клеток. Инкубируйте шарики с 50 микролитрами экстракционного буфера из комплекта изоляции РНК в ThermoMixer в течение 30 минут, чтобы освободить РНК из шариков.Отделите бусины с помощью магнитной стойки и перенесите супернатант в трубку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте пробирку по 3000 г в течение двух минут. Затем пипетку супернатанта в новую трубку объемом 1,5 миллилитра.Чтобы предварительно кондиционировать колонну очистки РНК, пипетку 250 микролитров кондиционирующего буфера на очистительную колонну и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифугируют колонну при 16 000 г в течение одной минуты. Пипетка равного объема 70% этанола в клеточный экстракт и хорошо перемешивается путем пипетки.Пипетка до 200 микролитров смеси в предварительно кондиционированную колонку очистки РНК. Для уменьшения потерь образцов не заполняйте колонну более чем на 80% ее емкости. Повторяйте этот шаг несколько раз, пока все РНК не будут собраны в один столбец каждой фракции.Центрифугируют колонну в течение двух минут, чтобы связать РНК с мембраной в колонке. Затем продолжайте центрифугирование в течение 30 секунд. Отбросьте поток и пипетку 100 микролитров промывочного буфера один в колонну.Центрифугируйте в течение одной минуты, затем отбросьте поток насквозь. Пипетка 75 микролитров раствора ДНК смешивается непосредственно с мембраной колонки очистки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.Затем пипетка 40 микролитров промывочного буфера один в колонну и центрифугу еще на 30 секунд. Отбросьте поток. Пипетка 100 микролитров промывки буфера два в колонну и центрифугу по 8 000 г в течение одной минуты.Отбросьте поток. Купить ПЭТ 100 микролитров промывочного буфера два в колонну и центрифугу по 16 000 г в течение двух минут. Отбросьте поток и повторно центрифугируйте ту же колонну по 16 000 г в течение одной минуты, чтобы удалить все следы промывочного буфера.Перенесите колонну на новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. пипетка 12 микролитров рваной воды непосредственно на мембрану очистительной колонны, гарантируя, что наконечник пипетки не коснется мембраны. Инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты и центрифугировать по 1000 г в течение одной минуты.Затем при 16 000 G в течение одной минуты элюировать РНК. Используйте биоанализатор для оценки качества и количества экстрагированной РНК. Храните РНК в морозильной камере на 80 градусов или отправляйте на дальнейший анализ.Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов, Gli1-CreERT2 и NuTRAP, нам вводят тамоксифен один раз в день, через день для трех инъекций. Иммунофлуоресцентный анализ собранных тканей показывает, что EGFP экспрессировался в интерстициальных клетках в яичках. EGFP также был обнаружен в капсульных клетках надпочечников у мышей Gli1-CreERT2, NuTRAP.У мышей Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP Популяция EGFP-положительных клеток находится во внешней коре надпочечников под капсулой, подтверждая экспрессию EGFP предварительно экспрессирующих клеток. После экстракции специфических РНК клеточного типа экстрагированную РНК отправляли на анализ микрочипов. Результаты показали, что около 3000 генов были обогащены положительной фракцией, по сравнению с генами в отрицательной фракции, тогда как около 4000 генов были обогащены отрицательной фракцией.Среди дифференциально экспрессированных генов клетки Лейдига гены Hsd11b1 и Hsd3b6 были обогащены положительной фракцией. В отрицательной фракции были обогащены связанные с клетками Сертоли гены Desert Hedgehog и Gstm6. Только несколько дифференциально экспрессированных генов были идентифицированы при сравнении отрицательной фракции с входом.Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени использовалась для подтверждения экспрессии ключевых генов в положительных и отрицательных фракциях. Подобно тому, что было обнаружено в анализе микрочипов, стероидогенные ферменты 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа и фермент расщепления боковой цепи холестерина были обогащены положительной фракцией. Между тем, клеточный маркер Сертоли SRY бокс транскрипционный фактор девять и маркер зародышевых клеток синаптонемального комплексного белка три были обогащены отрицательной фракцией.При попытке этого протокола важно приготовить свежий рабочий буфер гомогенизации Добавить DTT, циклогексимид рекомбинантную рибонуклеазу и коктейль ингибитора протеиназы в раствор гомогенизации только перед использованием. Также важно приготовить свежие буферы с низким содержанием соли и буферы для промывки с высоким содержанием соли перед использованием.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Актина сотрудничества седиментации Пробирной; для анализа связывание белка с F-актин

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Генотипирование растений и животных образцов без предварительного очистки ДНК

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...