Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
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Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.

Todos los experimentos con animales realizados siguieron los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Auburn.
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un testículo (aproximadamente 100 mg) en P28 de Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Mus musculus). Es posible que sea necesario ajustar los volúmenes de reactivos en función de los tipos de muestras y el número de tejidos.
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<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura lás...

Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capaz de aislar ARN unidos a ribosomas de tipos celulares específicos sin disociación tisular. Este método se ha utilizado para el análisis de translatoma (ARNm que están siendo reclutados para el ribosoma para la traducción) en diferentes organismos, incluyendo la orientación a una población extremadamente rara de células musculares en embriones de Drosophila5, el estudio de diferentes células radiculares en la planta modelo Arabidopsis thaliana6, y la realización de análisis del transcriptoma de células endoteliales en mamíferos7.
TRAP requiere una modificación genética para marcar el ribosoma de un organismo modelo. Evan Rosen y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de ratón llamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, que ha estado disponible a través del Laboratorio Jackson desde 2017. Al cruzarse con una línea de ratón Cre, los investigadores pueden usar este modelo de ratón NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas y núcleos celulares de células que expresan Cre sin clasificación celular. En las células que expresan Cre que también portan el alelo NuTRAP , el ribosoma marcado con EGFP / L10a permite el aislamiento de la traducción de ARNm utilizando ensayos de afinidad pulldown. En la misma célula, la membrana nuclear marcada con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP), que también es mCherry positivo, permite el aislamiento nuclear mediante el uso de purificación basada en afinidad o fluorescencia. El mismo equipo de investigación también generó una línea de ratón similar en la que la membrana nuclear se etiqueta solo con mCherry sin biotina8. Estas dos líneas de ratones modificados genéticamente dan acceso a caracterizar perfiles epigenómicos y transcriptómicos pareados de tipos específicos de células de interés.
La vía de señalización del erizo (Hh) juega un papel crítico en el desarrollo del tejido9. GLI1, un miembro de la familia GLI, actúa como un activador transcripcional y media la señalización de Hh. Las células Gli1+ se pueden encontrar en muchos órganos secretores de hormonas, incluyendo la glándula suprarrenal y los testículos. Para aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de las células Gli1+ utilizando el modelo de ratón NuTRAP, se cruzaron ratones Gli1-CreERT2 con ratones NuTRAP. Los ratones Shh-CreERT2 también se cruzaron con los ratones NuTRAP con el objetivo de aislar las células que expresan erizo sónico (Shh). El siguiente protocolo muestra cómo utilizar Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas de células Gli1+ en testículos de ratones adultos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.

El ratón Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) se cruzó por primera vez con el ratón reportero NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para generar ratones de doble mutación. Los ratones portadores de ambos alelos genéticos genéticamente modificados (es decir, Gli1-CreERT2 y NuTRAP) fueron inyectados con tamoxifeno una vez al día, cada dos días, para tres inyecciones. Las muestras de tejido se recogieron el 7º día después del1º día de la...

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Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Este protocolo tiene como objetivo obtener ARN específicos de tipos celulares de alta calidad a partir de un pequeño número de células en un tejido complejo sin clasificación celular. Emplea un modelo de ratón recientemente disponible que permite a los investigadores aislar un ARN unido a ribosomas utilizando GLP pull down. El método también es adecuado para aislar ARN unidos a ribosomas de cualquier célula que exprese EGFP.Para comenzar, agregue dos mililitros de tampón de trabajo de homogeneización helada a un juego de molinillo de papel de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto. transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros y centrifugar a 12, 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros sin alterar el pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar el sobrenadante con el anticuerpo anti-GFP a cuatro grados centígrados en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Transfiera la mezcla de homogeneización y anticuerpos a un nuevo tubo inferior redondo de dos mililitros que contenga perlas de proteína g lavadas e incube cuatro grados centígrados en el rotador a 24 RPM durante dos horas.Separe las perlas magnéticas del sobrenadante utilizando una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la fracción negativa que contiene los ARN en las células negativas de EGFP y los ARN en las células positivas de EGFP que no están unidas a los ribosomas. Agregue un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y vorete brevemente el tubo para lavar las perlas.Luego coloque el tubo en una rejilla magnética. Retire el tampón de lavado y repita los pasos de lavado dos veces más para obtener el complejo de ARN ribosómico de las perlas de las células positivas para EGFP. Incubar las perlas con 50 microlitros de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN en un ThermoMixer durante 30 minutos para liberar ARN de las perlas.Separe las perlas con una rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 3000 g durante dos minutos. A continuación, pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Para acondicionar previamente la columna de purificación de ARN, pipetear 250 microlitros de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar la columna a 16, 000 g durante un minuto. Pipetear un volumen igual de etanol al 70% en el extracto celular y mezclar bien mediante pipeteo.Pipetear hasta 200 microlitros de la mezcla en la columna de purificación de ARN preacondicionada. Para reducir la pérdida de muestras no llene la columna más del 80% de su capacidad. Repita este paso varias veces hasta que todos los ARN se recojan en la misma columna de cada fracción.Centrifugar la columna durante dos minutos para unir el ARN a la membrana de la columna. Luego continúe la centrifugación durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y pipete 100 microlitros de tampón de lavado uno en la columna.Centrifugar durante un minuto, luego desechar el flujo a través. La pipeta 75 microlitros de solución de ADN se mezcla directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.Luego, pipetear 40 microlitros de tampón de lavado uno en la columna y centrifugar durante otros 30 segundos. Deseche el flujo a través. Pipetear 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 8, 000 g durante un minuto.Deseche el flujo a través. Compre PET 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 16, 000 g durante dos minutos. Deseche el flujo y vuelva a centrifugar la misma columna a 16, 000 g durante un minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado.Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. pipetear 12 microlitros de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación asegurando que la punta de la pipeta no toque la membrana. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar a 1000 g durante un minuto.Luego, a 16, 000 G durante un minuto para eluyir el ARN. Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído. Almacene los ARN en un congelador de 80 grados o envíelos para su posterior análisis.Ratones portadores de alelos genéticos genéticamente modificados, Gli1-CreERT2 y NuTRAP se nos inyecta tamoxifeno una vez al día, cada dos días para tres inyecciones. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos recolectados muestra que el EGFP se expresó en células intersticiales en los testículos. EGFP también se encontró en células capsulares suprarrenales en ratones Gli1-CreERT2, NuTRAP.En Sonic Hedgehog-CreERT2, ratones NuTRAP La población celular positiva de EGFP reside en la corteza externa de la glándula suprarrenal debajo de la cápsula, confirmando la expresión de células que expresan previamente EGFP. Después de la extracción de los ARN específicos del tipo de célula, el ARN extraído se envió para el análisis de microarrays. Los resultados mostraron que alrededor de 3000 genes se enriquecieron en la fracción positiva, en comparación con los genes en la fracción negativa, mientras que alrededor de 4.000 genes se enriquecieron en la fracción negativa.Entre los genes diferenciales expresados, los genes asociados a células de Leydig Hsd11b1 y Hsd3b6 se enriquecieron en la fracción positiva. En la fracción negativa, se enriquecieron los genes asociados a las células de Sertoli Desert Hedgehog y Gstm6. Solo se identificaron unos pocos genes expresados diferencialmente al comparar la fracción negativa con la entrada.Se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real para confirmar la expresión de genes clave en las fracciones positiva y negativa. Similar a lo que se encontró en el ensayo de microarrays, las enzimas esteroidogénicas 3-beta hidroxi esteroide deshidrogenasa y la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras tanto, el marcador celular de Sertoli SRY box factor de transcripción nueve y el marcador de células germinales sinaptonemal proteína tres del complejo se enriquecieron en la fracción negativa.Al intentar este protocolo, es importante preparar un nuevo tampón de trabajo de homogeneización Agregue DTT, ribonucleasa recombinante de cicloheximida y cóctel de inhibidores de proteinasa a la solución madre de homogeneización solo antes de usar. También es importante preparar tampones frescos bajos en sal y los tampones de lavado con alto contenido de sal antes de su uso.

Research

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Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

El genotipado de muestras de plantas y animales, sin previa purificación del ADN

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...