Name: isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av NIH R00HD082686. Vi tackar Endocrine Society Summer Research Fellowship till H.S.Z. Vi tackar också Dr. Yuan Kang för avel och underhåll av muskolonin.

Alla utförda djurförsök följde de protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) vid Auburn University.
OBS: Följande protokoll använder en testiklar (ca 100 mg) vid P28 från Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss (Mus musculus). Reagensvolymerna kan behöva justeras utifrån provtyperna och antalet vävnader.
1. Uppsamling av vävnader
<ol><li>Avliva mössen med en CO2-kammare , ...

<ol>
	<li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support.">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li><li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis.">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP).">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li><li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAP-rc,+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos.">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).</li><li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(trap)+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale.">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).</li><li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+ribosome+affinity+purification+(TRAP)+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo.">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).</li><li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo.">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li><li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog:+functions+and+mechanisms.">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li><li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+number+(RIN)-standardization+of+RNA+quality+control.">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , 1-8 (2004).</li><li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone.">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li><li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages.">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li><li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog.">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li><li>Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adult+Leydig+cells.">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li><li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11&#946;-hydroxysteroid+dehydrogenase:+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids.">Comparative aspects of 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li><li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline.">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li><li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice.">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481 (2009).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+single-cell+isolation.">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches.">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).</li><li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia.">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).</li><li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells.">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li><li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice.">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li></ol>

Användbarheten av transkriptomanalysen i hela vävnaden kan dämpas, särskilt när man studerar komplexa heterogena vävnader. Hur man erhåller celltypsspecifika RNA blir ett brådskande behov av att frigöra den kraftfulla RNA-seq-tekniken. Isoleringen av celltypspecifika RNA är vanligtvis beroende av insamling av en specifik typ av celler med hjälp av mikromanipulation, fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) eller laserfångningsmikrodissektion (LCM)18. Andra moderna encellsinsamling...

Metoder med hög genomströmning, inklusive RNA-sekvensering (RNA-seq) och mikroarray, har gjort det möjligt att förhöra genuttrycksprofiler på genomomfattande nivå. För komplexa vävnader som hjärta, hjärna och testiklar kommer celltypspecifika data att ge mer information som jämför användningen av RNA från hela vävnaden 1,2,3. För att övervinna effekterna av cellulär heterogenitet har metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) utvecklats sedan början av 2010-talet4. TRAP kan isolera ribosombundna RNA från specifika celltyper utan vävnadsdissociation. Denna metod har använts för translatom (mRNA som rekryteras till ribosomen för översättning) analys i olika organismer, inklusive inriktning på en extremt sällsynt population av muskelceller i Drosophila embryon5, studera olika rotceller i modellväxten Arabidopsis thaliana6 och utföra transkriptomanalys av endotelceller hos däggdjur7.
TRAP kräver en genetisk modifiering för att märka ribosomen hos en modellorganism. Evan Rosen och kollegor utvecklade nyligen en musmodell som heter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har varit tillgänglig via Jackson Laboratory sedan 2017. Genom att korsa med en Cre-muslinje kan forskare använda denna NuTRAP-musmodell för att isolera ribosombundna RNA och cellkärnor från Cre-uttryckande celler utan cellsortering. I Cre-uttryckande celler som också bär NuTRAP-allelen tillåter EGFP / L10a-taggad ribosom isolering av översättning av mRNA med hjälp av affinitetspulldown-analyser. I samma cell tillåter det biotinligasigenkänningspeptid (BLRP) -märkta kärnmembranet, som också är mCherry-positivt, kärnisolering genom att använda affinitets- eller fluorescensbaserad rening. Samma forskargrupp genererade också en liknande muslinje där kärnmembranet endast är märkt med mCherry utan biotin8. Dessa två genetiskt modifierade muslinjer ger tillgång till att karakterisera parade epigenomiska och transkriptomiska profiler av specifika typer av celler i intresse.
Signalvägen för igelkott (Hh) spelar en avgörande roll i vävnadsutveckling9. GLI1, en medlem av GLI-familjen, fungerar som en transkriptionell aktivator och förmedlar Hh-signaleringen. Gli1+ celler finns i många hormonutsöndrande organ, inklusive binjurarna och testiklarna. För att isolera celltypsspecifika DNA och RNA från Gli1+-celler med hjälp av NuTRAP-musmodellen korsades Gli1-CreERT2-möss med NuTRAP-mössen. Shh-CreERT2-möss korsades också med NuTRAP-mössen som syftar till att isolera sonisk igelkott (Shh) som uttrycker celler. Följande protokoll visar hur du använder Gli1-CreERT2; NuTRAP-möss för att isolera ribosombundna RNA från Gli1+-celler i vuxna mustestiklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actb</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>239764-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyp11a1</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass grinder set</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>BEANTOWN CHEMICAL</td>
			<td>139975-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsd3b</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>R004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Microarray service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>492018-50 Ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo (dT)20</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Dynabead</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>growcells</td>
			<td>NUPW-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox9</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sycp3</td>
			<td>eurofins</td>
			<td>qPCR primers</td>
			<td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62848</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolate cell-type-specific rnas from snap-frozen heterogeneous tissue samples without cell sorting

Cellulär heterogenitet innebär utmaningar för att förstå funktionen hos komplexa vävnader på transkriptomnivå. Genom att använda celltypspecifika RNA undviks potentiella fallgropar orsakade av vävnadernas heterogenitet och släpper loss den kraftfulla transkriptomanalysen. Protokollet som beskrivs här visar hur man använder metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) för att isolera ribosombundna RNA från en liten mängd EGFP-uttryckande celler i en komplex vävnad utan cellsortering. Detta protokoll är lämpligt för att isolera celltypspecifika RNA med den nyligen tillgängliga NuTRAP-musmodellen och kan också användas för att isolera RNA från alla EGFP-uttryckande celler.

Gli1-CreERT2-mus (Jackson Lab Stock Number: 007913) korsades först med NuTRAP-reportermusen (Jackson Lab Stock Number: 029899) för att generera dubbelmutanta möss. Möss som bär båda genetiskt modifierade genalleler (dvs. Gli1-CreERT2 och NuTRAP) injicerades med tamoxifen en gång om dagen, varannan dag, för tre injektioner. Vävnadsprover samlades in den 7:e dagen efter injektionens 1: a dag. Immunofluorescensanalys visade att EGFP uttrycktes i...

Watch this Scientific Journal Video about Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting at JoVE.com

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Detta protokoll syftar till att isolera celltypspecifika översättning ribosomala mRNA med hjälp av NuTRAP-musmodellen.

Isolera celltypspecifika RNA från snap-frozen heterogena vävnadsprover utan cellsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Detta protokoll syftar till att erhålla högkvalitativa celltyper specifika RNA från ett litet antal celler i en komplex vävnad utan cellsortering. Den använder en nyligen tillgänglig musmodell som gör det möjligt för forskare att isolera en ribosombunden RNA med GLP-neddragning. Metoden är också lämplig för att isolera ribosombundna RNA från alla EGFP-uttryckande celler.För att börja, tillsätt två milliliter iskall homogeniseringsbuffert till en glasvävnadskvarnsats. Placera snabbt det frusna provet i kvarnen och homogenisera vävnaden med 30 slag på is med en lös stöt. Överför homogenatet till ett två milliliter runt bottenrör och centrifugera vid 12 000 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Överför sedan supernatanten till ett nytt två milliliterrör utan att störa pelleten och reservera 100 mikroliter som ingång. Inkubera supernatanten med anti-GFP-antikroppen vid fyra grader Celsius på en ände över ändrotatorn över natten. Överför homogenat- och antikroppsblandningen till ett nytt två milliliter runt bottenrör som innehåller tvättade protein g-pärlor och inkuberas fyra grader Celsius på rotatorn vid 24 varv / min i två timmar.Separera magnetpärlorna från supernatanten med hjälp av ett magnetiskt ställ. Spara supernatanten som den negativa fraktionen som innehåller RNA i EGFP-negativa celler och RNA i EGFP-positiva celler som inte är bundna till ribosomer. Tillsätt en milliliter hög salttvättbuffert till pärlorna och virvla kort röret för att tvätta pärlorna.Placera sedan röret i ett magnetiskt ställ. Ta bort tvättbufferten och upprepa tvättstegen ytterligare två gånger för att erhålla pärlorna ribosom RNA-komplex från EGFP-positiva celler. Inkubera pärlorna med 50 mikroliter extraktionsbuffert från RNA-isoleringssatsen i en ThermoMixer i 30 minuter för att frigöra RNA från pärlorna.Separera pärlorna med ett magnetiskt ställ och överför supernatanten till ett 1,5 ml rör. Centrifugera röret vid 3000 g i två minuter. Pipettera sedan supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter rör.För att förkonditionera RNA-reningskolonnen, pipettera 250 mikroliter konditioneringsbuffert på reningskolonnen och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Centrifugera sedan kolonnen vid 16 000 g i en minut. Pipettera en lika stor volym av 70% etanol i cellextraktet och blanda väl genom pipettering.Pipettera upp till 200 mikroliter av blandningen i den förkonditionerade RNA-reningskolonnen. För att minska förlusten av prover fyller inte kolumnen mer än 80% av dess kapacitet. Upprepa detta steg flera gånger tills alla RNA samlas i samma kolumn för varje fraktion.Centrifugera kolonnen i två minuter för att binda RNA till membranet i kolonnen. Fortsätt sedan centrifugeringen i 30 sekunder. Kassera flödet genom och pipettera 100 mikroliter tvättbuffert en i kolonnen.Centrifugera i en minut och kassera sedan flödet igenom. Pipettera 75 mikroliter DNA-lösning blandas direkt i reningskolonnmembranet. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.Pipettera sedan 40 mikroliter tvättbuffert en i kolonnen och centrifugera i ytterligare 30 sekunder. Kasta flödet igenom. Pipettera 100 mikroliter tvättbuffert två i kolonnen och centrifugera vid 8 000 g i en minut.Kasta flödet igenom. Köp PET 100 mikroliter tvättbuffert två i kolonnen och centrifugera vid 16 000 g i två minuter. Kassera flödet genom och centrifugera samma kolonn vid 16 000 g i en minut för att ta bort alla spår av tvättbuffert.Överför kolonnen till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. pipettera 12 mikroliter RNasfritt vatten direkt på reningskolonnens membran så att pipettspetsen inte vidrör membranet. Inkubera vid rumstemperatur i en minut och centrifugera vid 1000 g i en minut.Sedan vid 16 000 G i en minut för att eluera RNA. Använd en bioanalysator för att bedöma kvaliteten och kvantiteten av det extraherade RNA. Förvara RNA i en 80 graders frys eller skicka ut för vidare analys.Möss som bär på både genmanipulerade genalleler, Gli1-CreERT2 och NuTRAP vi injiceras med tamoxifen en gång om dagen, varannan dag för tre injektioner. Immunofluorescensanalys av insamlade vävnader visar att EGFP uttrycktes i interstitiella celler i testiklarna. EGFP hittades också i binjurekapslar i Gli1-CreERT2, NuTRAP-möss.I Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-möss Den EGFP-positiva cellpopulationen finns i binjurens yttre cortex under kapseln, vilket bekräftar uttrycket av EGFP-föruttryckande celler. Efter extraktionen av celltypsspecifika RNA skickades det extraherade RNA för mikroarrayanalys. Resultaten visade att cirka 3000 gener berikades i den positiva fraktionen, jämfört med gener i den negativa fraktionen, medan cirka 4 000 gener berikades i den negativa fraktionen.Bland de differentiellt uttryckta generna berikades Leydig-cellassocierade gener Hsd11b1 och Hsd3b6 i den positiva fraktionen. I den negativa fraktionen berikades Sertoli-cellassocierade gener Desert Hedgehog och Gstm6. Endast ett fåtal differentiellt uttryckta gener identifierades vid jämförelse av den negativa fraktionen med ingången.Kvantitativ RT-PCR i realtid användes för att bekräfta uttrycket av nyckelgener i de positiva och negativa fraktionerna. I likhet med vad som hittades i mikroarrayanalysen berikades steroidogena enzymer 3-beta hydroxisteroiddehydrogenas och kolesterol sidokedjeklyvningsenzym i den positiva fraktionen. Under tiden berikades Sertoli-cellmarkören SRY-boxtranskriptionsfaktor nio och bakteriecellmarkören synaptonemalkomplexprotein tre i den negativa fraktionen.När du försöker detta protokoll är det viktigt att förbereda färsk homogeniseringsarbetsbuffert Lägg till DTT, cykloheximidrekombinant ribonuklease och proteinashämmare cocktail till homogeniseringsstamlösningen endast före användning. Det är också viktigt att förbereda färskt lågt salt och de höga salttvättbuffertarna före användning.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Teknik för analys av Cell Typspecifika Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotypning av vegetabiliskt och animaliskt prover utan Prior DNA Rening

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av små icke-kodande RNA från humant serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Förfarande för att mäta aktiviteten hos Deubiquitinating Enzymer i cellinjer och vävnadsprover

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...