Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا مرفق بحوث الأجهزة المتقدمة، JNU، على مقياس الطيف المضغوط. وقد تم دعم V.J. و A.D. من قبل زمالة من CSIR.

1. تركيز العمل من مكونات التفاعل
<ol><li>إعداد تركيزات العمل من المخازن المؤقتة لمؤتمر نزع السلاح وغيرها من مكونات رد الفعل حديثا (انظر الجدول 1) والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية قبل إعداد ردود الفعل. ملاحظة: بالنسبة لتفاعلات CD الموضحة في هذه الورقة، فإن تركيزات عمل المكونات ه?...

الغرض من هذه المقالة هو إدخال تقنية التحليل الطيفي لمؤتمر نزع السلاح كنهج لدراسة التغيرات التشكيلية التي تحدث في الحمض النووي في وجود بروتينات إعادة عرض الكروماتين المعتمدة على ATP وربط هذه التغييرات التشكيلية بالتعبير الجيني. يوفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة طريقة سريعة وسهلة الوصو...

الديسكروزم الدائري (CD) هو تقنية طيفية تعتمد على التشهر المتأصل في الجزيئات الكلية البيولوجية التي تؤدي إلى امتصاص تفاضلي للضوء المستقطب بشكل دائري باليد اليمنى والأعسر. ويعرف هذا الامتصاص التفاضلي باسم الإملاء الدائري. ولذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد تشكيل الجزيئات البيولوجية، مثل البروتينات والحمض النووي، وكلاهما يحتوي على مراكز chiral1،2.
الموجات الكهرومغناطيسية تحتوي على كل من المكونات الكهربائية والمغناطيسية. ويتذبذب المجالان الكهربائي والمغناطيسي عموديا على اتجاه انتشار الموجات. في حالة الضوء غير القطبي ، تتأرجح هذه الحقول في اتجاهات عديدة. عندما يكون الضوء مستقطبا بشكل دائري ، يتم الحصول على حقلين كهرومغناطيسيين عند اختلاف المرحلة 90 درجة مع بعضهما البعض. تظهر جزيئات Chiral دوران بصري دائري (ثنائية الدوران) بحيث تمتص الضوء المستقطب دائريا الأيمن والضوء المستقطب دائريا الأيسر إلى مدى مختلف3. سيتم تتبع الحقل الكهربائي الناتج كقطع ناقص ، وهو دالة الطول الموجي. وبالتالي، يتم تسجيل طيف القرص المضغوط على أنه بيضاوي الشكل (q)، ويتم تقديم البيانات على أنها متوسط بقايا القطع الناقص كدالة للطول الموجي.
في حالة البروتينات ، فإن Cα من الأحماض الأمينية (باستثناء الجليسين) هو chiral ، ويتم استغلال هذا عن طريق التحليل الطيفي للقرص المضغوط لتحديد الهيكل الثانوي لهذا الجزيئات الكبيرة4. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من جزيئات البروتين في نطاق الأشعة فوق البنفسجية البعيدة. α-البروتينات هيليكال لها اثنين من العصابات السلبية في 222 نانومتر و 208 نانومتر وذروة إيجابية واحدة في 193 nm4. تظهر البروتينات ذات البنية الثانوية المضادة لالتوازي β ورقة ذروة سلبية عند 218 نانومتر وذروة إيجابية عند 195 نانومتر4. البروتينات مع هياكل مضطربة تظهر بيضاوية منخفضة بالقرب من 210 نانومتر وذروة سلبية في 195 nm4. وهكذا، فإن الذروة/النطاقات المحددة جيدا لمختلف الهياكل الثانوية تجعل من CD أداة مريحة لتوضيح التغيرات التركيبية التي تحدث في الهيكل الثانوي للبروتينات أثناء التشبع وكذلك الربط الرابط.
الأحماض النووية لديها ثلاثة مصادر من chirality: جزيء السكر، وهتك الهيكل الثانوي، وترتيب الثالثية طويلة المدى من الحمض النووي في البيئة5،6. عادة ما يتم تسجيل أطياف CD من الأحماض النووية في نطاق 190 إلى 300 نانومتر5،6. كل تشكيل الحمض النووي، تماما مثل البروتينات، ويعطي طيف مميز، على الرغم من أن القمم / النطاقات يمكن أن تختلف من قبل بعض الدرجات بسبب ظروف المذيبات والاختلافات في تسلسل الحمض النووي7. يتميز B-DNA ، الشكل الأكثر شيوعا ، بذروة إيجابية حول 260-280 نانومتر وذروة سلبية حول 245 nm6. قمم / عصابات من الحمض النووي B-شكل صغيرة عموما لأن أزواج قاعدة عمودي على الحلزون المزدوج، مما يمنح chirality ضعيفة للجزيء. يعطي A-DNA ذروة إيجابية مهيمنة عند 260 نانومتر وذروة سلبية حول 210 nm6. Z-DNA، الحلزون أعسر، يعطي الفرقة السلبية في 290 نانومتر وذروة إيجابية حول 260 nm6. هذا الحمض النووي يعطي أيضا ذروة سلبية للغاية في 205 nm6.
بالإضافة إلى هذه التشكيلات، يمكن أن يشكل الحمض النووي أيضا ثلاثية ورباعية دبابيس شعر، وكلها يمكن تمييزها بالمنظار المضغوط. تعطي رباعية G-quadruplex المتوازية نطاقا إيجابيا مهيمنا عند 260 نانومترا ، في حين أن G-quadruplex المضاد للموازي يعطي نطاقا سلبيا عند 260 نانومترا وذروة إيجابية عند 290 نانومترا ، مما يجعل من السهل التمييز بين شكلي الهياكل الرباعية6. الثلاثيات لا تعطي الطيف المميز8. على سبيل المثال، تظهر أطياف الحمض النووي الذي يبلغ طوله 36 نيوكليوتيد مع إمكانية تشكيل حلزون ثلاثي داخل الجزيئي يحتوي على أزواج قاعدة G.G.C و T.A.T في وجود Na+ نطاقا سلبيا قويا عند 240 نانومترا وذروة إيجابية واسعة. تظهر الذروة الإيجابية الواسعة المساهمات عند 266 و273 و286 نانومتر. نفس oligonucleotide في وجود نا + و Zn + يظهر أربعة نطاقات سلبية (213، 238، 266، و 282 نانومتر) وذروة إيجابية في 258 نانومتر. وبالتالي، يمكن أن تختلف أطياف الحمض النووي الثلاثي وفقا لظروف الملح8.
وبالإضافة إلى هذه التشكيلات، مكنت أطياف الأقراص المضغوطة من تحديد شكل آخر من الحمض النووي يسمى X-DNA. يتكون الحمض النووي X عندما يحتوي تسلسل الحمض النووي على بقايا أدينين والثيمين البديلة. تحتوي أطياف القرص المضغوط للحمض النووي X على ذروتين سالبتين عند 250 و 280 نانومتر. معلومات قليلة جدا متاحة حول X-DNA, على الرغم من أنه قد تم التكهن لتعمل بمثابة بالوعة لsupercoiling6,9 إيجابية. التغيرات في أطياف CD يمكن أن تكشف أيضا تفاصيل عن التفاعلات بين البروتين ليغاند، وبالتالي، قد أضيفت إلى ترسانة من الطرق الجزيئية للكشف عن التفاعلات بين المخدرات والبروتين10،11،12،13،14. كما تم استخدام أطياف الأقراص المضغوطة لرصد التغيرات في البنية الثانوية للبروتينات أثناء عملية الطي15. وبالمثل، يمكن أيضا استخدام أطياف القرص المضغوط للتحقيق في تفاعلات ligand-DNA16,17.
وبالتالي، فإن التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة هو طريقة سهلة وغير مكلفة للتمييز بين الأشكال المختلفة لتطابق الحمض النووي، شريطة أن يكون هناك إمكانية الوصول إلى معدات وبرامج غير مكلفة. الأسلوب حساس للغاية وسريع. فهو يتطلب فقط كمية صغيرة من الحمض النووي، مما يعطيها ميزة على التقنية البديلة للرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. المعايرة مع الليجاند والركائز هي أيضا سهلة الأداء. القيد الرئيسي هو أن الحمض النووي يجب أن يكون نقيا للغاية. فمن المستحسن استخدام البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (الصفحة) تنقية الحمض النووي.
وقد استخدمت المعلومات التي تم الحصول عليها من أطياف CD بشكل رئيسي لاستقراء السمات الهيكلية للبروتين وتحديد مطابقي الحمض النووي المتميزين. في هذه الدراسة، تم استخدام أطياف CD لدمج النتائج التي تم الحصول عليها من تجربة في الجسم الحي كروماتين المناعي (ChIP) لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة / عامل النسخ المتوقع يمكن أن يحدث تغييرا تشكيليا في المنطقة المروجة لجيناتها التأثيرية. يساعد هذا التعاون في تقدم التقنيات الطيفية التقليدية لمؤتمر نزع السلاح من خلال التنبؤ بآلية تنظيم النسخ من خلال عامل النسخ المتوقع في موقع بدء النسخ وحوله (TSS) للمروج.
Chromatin إعادة عرض هو آلية محددة جيدا معروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي من خلال جعل الكروماتين معبأة بإحكام في متناول مختلف العوامل التنظيمية مثل عوامل النسخ، ومكونات تكرار الحمض النووي، أو البروتينات إصلاح الضرر. إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP ، والمعروفة أيضا باسم عائلة SWI / SNF من البروتينات ، هي بروتينات إعادة تشكيل رئيسية موجودة في الخلايا eukaryotic18،19. وقد صنفت التجمع النباتي عائلة SWI / SNF من البروتينات إلى 6 مجموعات فرعية20: Snf2 مثل، Swr1 مثل، SSO1653 مثل، راد54 مثل، Rad5/16 مثل، وبعيدة. SMARCAL1، البروتين من الفائدة في هذه الدراسة، ينتمي إلى المجموعة الفرعية البعيدة20. وقد استخدم هذا البروتين للتحقيق في طريقة التنظيم النسخي باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط.
وقد ثبت أن معظم أعضاء البروتينات إعادة عرض الكروماتين تعتمد ATP إما لإعادة وضع أو طرد النيوكليوسومات أو التوسط تبادل البديل الهستون بطريقة تعتمد على ATP21,22. ومع ذلك، لم يثبت أن بعض أفراد هذه الأسرة يعيدون تشكيل النيوكليوسومات، مثل SMARCAL1. على الرغم من أن الدراسات قد أظهرت أن SMARCAL1 يرتبط مع كروموسومات البوليتين، الأدلة التجريبية بشأن قدرتها على إعادة تشكيل النوى تفتقر23. لذلك ، كان من المسلم به أن SMARCAL1 قد تنظم النسخ عن طريق تغيير تشكيل DNA24. وقد وفر التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة طريقة سهلة وسهلة المنال للتحقق من صحة هذه الفرضية.
SMARCAL1 هو بروتين إعادة عرض الكروماتين المعتمد على ATP الذي يعمل في المقام الأول كهيلية طية25,26,27. وقد افترض لتعديل النسخ عن طريق إعادة عرض تشكيل الحمض النووي24. لاختبار هذه الفرضية ، تمت دراسة دور SMARCAL1 في تنظيم نسخ الجينات أثناء تلف الحمض النووي الناجم عن الدوكسوروبيسين. في هذه الدراسات، تم استخدام SMARCAL1 لتحليل الجسم الحي وADAAD للمقاسات في المختبر28،29. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن ADAAD يمكن التعرف على الحمض النووي بطريقة تعتمد على الهيكل ولكن تسلسل مستقل30،31. يرتبط البروتين على النحو الأمثل بجزيئات الحمض النووي التي تمتلك حبلا مزدوجا إلى مناطق انتقالية ذات حبل واحد ، على غرار الحمض النووي الحلقي الجذعي ، ويتحلل ATP 30,31.
في تجارب الجسم الحي أظهرت أن SMARCAL1 ينظم التعبير عن MYC، DROSHA، DGCR8، و DICER عن طريق ربط المناطق المروج28،29. تم تحديد منطقة التفاعل من خلال تجارب ChIP28,29. يتم استخدام تقنية ChIP لتحليل تفاعل البروتين مع الحمض النووي cognate داخل الخلية. وهدفها هو تحديد ما إذا كانت بروتينات محددة، مثل عوامل النسخ على المروجين أو مواقع ربط الحمض النووي الأخرى، مرتبطة بمجالات جينومية محددة. البروتين المرتبط بالحمض النووي هو أول مرتبط عبر باستخدام الفورمالديهايد. ويتبع ذلك عزل الكروماتين. يتم قص الكروماتين المعزول إلى شظايا 500 bp إما عن طريق سونيكيشن أو هضم النيوكليز ، ويتم إهلاك البروتين المرتبط بالحمض النووي باستخدام أجسام مضادة خاصة بالبروتين. يتم عكس الربط المتبادل ، ويتم تحليل الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو PCR الكمي في الوقت الفعلي.
أدت نتائج ChIP إلى فرضية أن SMARCAL1 ربما يتوسط تنظيم النسخ من خلال إحداث تغيير تشكيلي في المناطق المروجة لهذه الجينات. واستخدمت برامجيات خرائط QGRS و Mfold لتحديد إمكانات هذه المناطق المروجة لتشكيل هياكل ثانوية28,29. يستخدم مخطط QGRS للتنبؤ ب G-quadruplexes32، بينما يحلل Mfold33 قدرة التسلسل على تشكيل هياكل ثانوية مثل الحلقات الجذعية.
بعد تحليل البنية الثانوية ، تم إجراء المزيد من التجارب في المختبر مع 6X 6X النشطة الموسومة الحمض النووي النشط تعتمد على ATPase A Domain (ADAAD) ، وهو متجانس البقري من SMARCAL1 ، منقى من Escherichia coli34. وأجريت اختبارات ATPase باستخدام ADAAD لإثبات أن تسلسل الحمض النووي المحدد يمكن أن يكون بمثابة التأثيرات28,29. وأخيرا، تم إجراء التحليل الطيفي للأقراص المضغوطة لرصد التغيرات التوافقية الناجمة في جزيء الحمض النووي من قبل ADAAD28,29.
لإثبات أن نشاط ATPase من البروتين كان أساسيا لإحداث تغيير تشكيلي في جزيء الحمض النووي، إما حمض الإيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) تمت إضافته إلى تشيلات Mg +2 أو نشط معتمد على الحمض النووي ATPase A مجال المانع Neomycin (ADAADiN)، مثبط محدد للبروتين SWI / SNF، أضيفت 35،36 . يمكن استخدام هذه التقنية الطيفية CD مع أي بروتين منقى تم إثباته من قبل ChIP أو أي مأساء أخرى ذات صلة لربط منطقة الجينوم المتوقعة للمروج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

التحليل الطيفي الدائري (CD) هو طريقة بسيطة ومريحة للتحقيق في البنية الثانوية وتفاعلات الجزيئات الحيوية. وقد مكنت التطورات الأخيرة في التحليل الطيفي لمؤتمر نزع السلاح من دراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين والديناميات التوافقية للحمض النووي في مختلف البيئات الدقيقة بالتفصيل من أجل فهم أفضل للتنظيم النسخي في الجسم الحي. المنطقة المحيطة بمنطقة النسخ المحتملة يجب أن تكون غير مجروحة لتحدث النسخ. هذه عملية معقدة تتطلب تنسيق تعديلات الهستون ، وربط عامل النسخ بالحمض النووي ، وأنشطة إعادة عرض الكروماتين الأخرى. باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط ، من الممكن دراسة التغيرات التشكيلية في منطقة المروج الناجمة عن البروتينات التنظيمية ، مثل إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP ، لتعزيز النسخ. ويمكن أيضا رصد التغيرات تشكيلية التي تحدث في البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن معالجة الاستفسارات المتعلقة بتقارب البروتين مع الحمض النووي المستهدف وخصوصية التسلسل من خلال دمج الطفرات في الحمض النووي المستهدف. باختصار، يمكن للفهم الفريد لهذه الطريقة الحساسة وغير المكلفة التنبؤ بالتغيرات في ديناميكيات الكروماتين، وبالتالي تحسين فهم التنظيم النسخي.

ADAAD يستقر حلقة الجذعية مثل هيكل على المروج MYC أظهرت الأدلة التجريبية السابقة أن SMARCAL1 هو منظم سلبي ل MYC29. وأظهر تحليل لمنطقة المروج الطويلة البالغ طولها 159 نقطة أساس لجين MYC من قبل مخطط QGRS أن الخيط الأمامي لديه القدرة على تشكيل رباعي G (<...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

يوصف تفاعل مضمار الكروماتين المعتمد على ATP مع ليغند الحمض النووي باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط. يمكن استخدام التغييرات التنظيمية المستحثة على مروج الجينات التي تم تحليلها بواسطة القمم المتولدة لفهم آلية التنظيم النسخي.

التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي والبروتين

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

يسمح لنا البروتوكول بتصور التغييرات في إعادة الهيكلة الثانية للحمض النووي الناجم عن بروتينات الكروماتين المعتمدة على ATP. يمكن ربط التغيير في بنية الحمض النووي بتنظيم النسخ. هذه تقنية سهلة وحساسة للغاية تستخدم كمية صغيرة جدا من الحمض النووي النقي لتسجيل التغيرات الهيكلية في أوليغونوكليوتيد.يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في تنظيم النسخ بوساطة الكروماتين المعتمد على ATP إعادة عرض البروتينات. للبدء، وإعداد تركيزات العمل من المخازن المؤقتة وغيرها من مكونات التفاعل الطازجة والاحتفاظ بها في أربع درجات مئوية قبل إعداد ردود الفعل، ثم قياس نشاط ATPase من البروتين في وجود جزيئات الحمض النووي المختلفة باستخدام NADH مقرونة فحص الأكسدة. مزيج 0.1 ملليمولار ADAAD، اثنين من ATP ملليمولار، 10 نانومولار الحمض النووي، و1X REG العازلة في لوحة 96 جيدا إلى حجم النهائي من 250 ميكرولتر.بعد ذلك ، احتضن التفاعل لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، ثم قم بقياس كمية NAD + باستخدام البرنامج المقدم مع قارئ اللوحة الدقيقة. لقياس الامتصاص عند 340 نانومتر، انقر على المقايسة NADH وضع لوحة 96 جيدا على حامل لوحة في الصك، ثم انقر على زر لوحة القراءة لتسجيل الامتصاص. جمع أطياف القرص المضغوط في cuvettes كوارتز عالية الشفافية.استخدام إما مستطيلة أو أسطوانية cuvettes. لتنظيف cuvettes، وغسلها بالماء عدة مرات، ثم أخذ مسح للمياه أو العازلة في cuvette للتحقق ما إذا كان نظيفا. لردود الفعل، استخدم حمض نووي منقي PAGE أوليغونوكليوتيدات.لالتبريد السريع، سخني الحمض النووي عند 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق على كتلة التدفئة وبرده على الفور على الجليد. لتبريد بطيء، بعد تسخين الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، والسماح لها لتبرد لدرجة حرارة الغرفة بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة الواحدة. لتسجيل أطياف خط الأساس، قم بإعداد ما مجموعه خمسة تفاعلات تحكم واحدة تلو الأخرى في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.الحفاظ على حجم رد الفعل في 300 ميكرولتر في جميع ردود الفعل. لتسجيل أطياف القرص المضغوط، قم بإعداد ما مجموعه خمسة ردود فعل تجريبية واحدا تلو الآخر في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. لتسجيل المسح الضوئي، قم بتشغيل الغاز وتشغيل مطياف القرص المضغوط.بعد 10 إلى 15 دقيقة، قم بتشغيل المصباح، قم بتشغيل حمام الماء وحدد درجة حرارة الحامل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، افتح برنامج طيف القرص المضغوط وحدد درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، ونطاق الطول الموجي عند 180 إلى 300 نانومتر ، والوقت لكل نقطة إلى 0.5 ثانية ، ورقم المسح الضوئي إلى خمسة ، ثم انقر على عارض البيانات المحترف ، وجعل ملف جديد ، وإعادة تسميته بتفاصيل التجربة والتاريخ. بعد ذلك ، اخلط ردود الفعل الأساسية والتجريبية عن طريق الأنابيب ونقل التفاعل بعناية واحدة تلو الآخر إلى cuvette ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هوائية.إذا كان أداء تجربة دورة زمنية، واحتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب، ثم أخذ المسح الضوئي. إضافة EDTA إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحمض النووي، ATP، المغنيسيوم، والبروتين لوقف التحلل المائي ATP. لمنع نشاط ATPase تماما، قم بزيادة تركيز EDTA ووقت الحضانة.طرح خطوط الأساس من ردود الفعل المقابلة في البرنامج وتنعيم البيانات إما في برنامج الطيف CD أو في برنامج رسم البيانات، ثم رسم رسم بياني للطول الموجي ضد الناقصة بقايا متوسط وتحليل القمم. M-طيات أظهرت أن كلا فروع الحمض النووي MYC يمكن أن تشكل بنية الجذعية حلقة مثل. تظهر هنا هياكل M-fold للأمام وتسلسل الحمض النووي العكسي الذي يحتوي على G quadruplex GECE.وأظهرت أطياف القرص المضغوط من GECE تبريد سريع في غياب ووجود ATP وADAAD أن ADAAD يحفز اثنين من القمم الإيجابية، واحدة في 258 نانومتر والآخر في 210 نانومتر. إضافة EDTA يلغي هذا التغيير التوافقي. أطياف القرص المضغوط لديها الآن ذروة سلبية 210 نانومتر وفرقة إيجابية واسعة مع قمم في 230 و 250 نانومتر.وأظهر تحليل مخطط QGRS وتحليل M-fold أن المناطق المروجة ل DROSHA و DGCR8 و DICER تمتلك القدرة على تشكيل رباعيات G وهياكل تشبه الجذع. وأظهرت أطياف القرص المضغوط للزوج DROSHA خمسة أن ADAAD يحفز ذروة سلبية في 210 نانومتر وذروة إيجابية في 260 نانومتر. هذا الطيف هو سمة من سمات ADNA.وأظهرت أطياف القرص المضغوط للزوج DGCR8 واحد ذروة إيجابية في 210 نانومتر وذروة سلبية واسعة في 260 نانومتر. هذا الطيف هو سمة من سمات الانتقال من B إلى X. بالنسبة للزوج DGCR8 سبعة ، شوهدت قمم إيجابية قوية في 210 و 270 نانومتر وذروة سلبية عند 250 نانومتر.هذا الطيف هو سمة من سمات مواز G رباعية هياكل الحمض النووي. وأخيرا، بالنسبة للزوج DICER واحد، لوحظت ذروة إيجابية في 210 نانومتر وقممتين سلبيتين، واحدة في 230 نانومتر والأخرى في 260 نانومتر. هذه القمم هي سمة من سمات انتقال الحمض النووي من A إلى X.تأكد من أن نقاء الحمض النووي والبروتين هو 99٪ أو أكثر. يجب أن يكون cuvette نظيفا ويجب أن يكون خط الأساس أقل من ميليدغري واحد. يجب أن تكون جميع الكواشف نقية بحيث تكون الخلفية أقل من ميليدغري واحد.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

والتحليل الطيفي رامان المتكاملة وكتله الطيف الكتلي لدراسة امتصاص المخدرات خليه واحده, الأيض, والآثار

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...