Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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作者要感谢JNU的先进仪器研究机构为CD分光光度计。V.J.和AD得到了CSIR奖学金的支持。

1.反应组分的工作浓度
<ol><li>新鲜制备CD和其他反应组分的缓冲液的工作浓度（见 表1），并在设置反应前将其保持在4°C。 注：对于本文所述的CD反应，组分的工作浓度如下：磷酸钠缓冲液（pH 7.0）1mM，ATP 2 mM，DNA 500 nM，蛋白质1μM，MgCl2 10 mM，EDTA 50 mM，ADAADiN 5μM。</li>
</ol>2. ATP酶活性
<ol><li>在CD光谱学之前，在DNA分子存在的情况?...

本文的目的是介绍CD光谱技术，作为研究在ATP依赖性染色质重塑蛋白存在下DNA中发生的构象变化并将这些构象变化与基因表达联系起来的方法。CD光谱学提供了一种快速且易于访问的方法来研究DNA中的构象变化。

这项技术需要考虑的一个关键点是DNA和蛋白质的纯度。建议确保DNA和蛋白质的纯度>95%。在测定中必须使用PAGE纯化的寡核苷酸，并且蛋白质应优选亲和纯化至>95%?...

圆二色性（CD）是一种光谱技术，它依赖于生物大分子的固有手性，导致右旋和左旋圆偏振光的差异吸收。这种差分吸收被称为圆二色性。因此，该技术可用于描绘生物大分子的构象，例如蛋白质和DNA，它们都包含手性中心1，2。
电磁波包含电元件和磁元件。电场和磁场都垂直于波的传播方向振荡。在非偏振光的情况下，这些场在许多方向上振荡。当光被圆偏振时，两个电磁场以90°的相位差相互获得。手性分子表现出圆旋（双折射），使得它们将吸收右旋圆偏振光和左旋圆偏振光到不同程度3。产生的电场将被跟踪为椭圆，椭圆是波长的函数。因此，CD光谱被记录为椭圆度（q），数据被表示为平均残差椭圆度作为波长的函数。
在蛋白质的情况下，氨基酸（甘氨酸除外）的Cα是手性的，CD光谱利用这一点来确定该大分子的二级结构4。蛋白质分子的CD光谱通常记录在远紫外范围内。α螺旋蛋白在222 nm和208 nm处有两个负带，在193 nm4处有一个正峰。具有抗平行β片二级结构的蛋白质在218 nm处显示出负峰，在195 nm4处显示出正峰。具有无序结构的蛋白质在210nm附近显示出低椭圆度，在195nm4处显示出负峰。因此，不同二级结构的明确定义的峰/条带使CD成为阐明变性以及配体结合期间蛋白质二级结构中发生的构象变化的便捷工具。
核酸有三种手性来源：糖分子、二级结构的螺旋度以及DNA在环境中的长程三级排序5，6。核酸的CD光谱通常记录在190至300nm范围内5，6。DNA的每种构象，就像蛋白质一样，都给出了一个特征谱，尽管由于溶剂条件和DNA序列的差异，峰/条带可能会有所不同7。B-DNA是最常见的形式，其特征在于260-280nm左右的正峰和245nm6左右的负峰。B型DNA的峰/条通常很小，因为碱基对垂直于双螺旋，使分子具有弱手性。A-DNA在260nm处给出显性阳性峰，在210nm6附近给出阴性峰。左手螺旋Z-DNA在290nm处给出负带，在260nm6左右给出正峰。该DNA在205 nm6处也给出了极负的峰。
除了这些构象外，DNA还可以形成三层，四链体和发夹，所有这些都可以通过CD光谱来区分。平行的G-四链体在260nm处给出一个显性的正能带，而反平行的G-四链体在260nm处给出一个负条带，在290nm处给出一个正峰，这使得很容易区分两种形式的四链体结构6。三层不给出特征光谱8。例如，在Na + 存在下，具有可能形成含有G.G.C和T.A.T碱基对的分子内三螺旋的36核苷酸长DNA的光谱在240nm处显示出强烈的阴带和宽阔的正峰。宽正峰在266、273和286 nm处显示出贡献。在Na + 和Zn + 存在下相同的寡核苷酸显示出四个阴性条带（213，238，266和282 nm）和258 nm处的正峰。因此，三重DNA的光谱可能因盐条件而异8。
除了这些构象之外，CD光谱还能够鉴定另一种形式的DNA，称为X-DNA。当DNA序列含有交替腺嘌呤和胸腺嘧啶残基时，形成X-DNA。X-DNA的CD光谱在250和280nm处包含两个负峰。关于X-DNA的信息很少，尽管据推测它可作为阳性超螺旋的汇6，9。CD光谱的变化也可以揭示配体 - 蛋白质相互作用的细节，因此已被添加到检测药物 - 蛋白质相互作用的分子方法库中10，11，12，13，14。CD光谱也用于监测蛋白质在折叠过程中二级结构的变化15。同样，CD光谱也可用于探测配体-DNA相互作用16，17。
因此，CD光谱是一种简单，廉价的方法来区分不同形式的DNA构象，只要可以使用不那么便宜的设备和软件。该方法非常灵敏和快速。它只需要少量的DNA，使其比核磁共振（NMR）光谱的替代技术更具优势。使用配体和底物进行滴定也很容易进行。主要限制是DNA应该是高度纯净的。建议使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA。
CD光谱获得的信息主要用于推断蛋白质结构特征和识别不同的DNA构象。在这项研究中，CD光谱已被用于整合从 体内 染色质免疫沉淀（ChIP）实验中获得的结果，以描述感兴趣的蛋白质/预测的转录因子是否可以在其效应基因的启动子区域带来构象变化。这种合作通过预测启动子转录起始位点（TSS）上和周围的预测转录因子的转录调节机制，有助于传统CD光谱技术的进步。
染色质重塑是一种明确定义的机制，已知通过使紧密包装的染色质易于各种调节因子（如转录因子，DNA复制成分或损伤修复蛋白）来调节DNA代谢过程。ATP依赖性染色质重塑子，也称为SWI / SNF蛋白家族，是真核细胞中存在的关键重塑蛋白18，19。系统发育聚类将 SWI/SNF 家族的蛋白质分为 6 个亚组20：Snf2 样、Swr1 样、SSO1653 样、Rad54 样、Rad5/16 样和远端。SMARCAL1是本研究中感兴趣的蛋白质，属于遥远的亚组20。这种蛋白质已被用于研究其使用CD光谱的转录调控模式。
ATP依赖性染色质重塑蛋白的大多数成员已被证明可以重新定位或驱逐核小体，或者以ATP依赖性方式介导组蛋白变体交换21，22。然而，该家族的一些成员尚未被证明可以重塑核小体，例如SMARCAL1。尽管研究表明SMARCAL1与多烯染色体有关，但缺乏关于其重塑核小体能力的实验证据23。因此，假设SMARCAL1可以通过改变DNA24的构象来调节转录。CD光谱学提供了一种简单易用的方法来验证这一假设。
SMARCAL1是一种ATP依赖性染色质重塑蛋白，主要用作退火解旋酶25，26，27。据推测，它可以通过重塑DNA构象来调节转录24。为了验证这一假设，研究了SMARCAL1在阿霉素诱导的DNA损伤期间调节基因转录中的作用。在这些研究中，SMARCAL1用于 体内 分析，ADAAD用于 体外 测定28，29。先前的研究表明，ADAAD可以以结构依赖但序列无关的方式识别DNA30，31。该蛋白质与具有双链至单链过渡区域的DNA分子最佳结合，类似于茎环DNA，并水解ATP 30，31。
体内实验表明，SMARCAL1通过与启动子区域结合来调节MYC，DROSHA，DGCR8和DICER的表达28，29。通过ChIP实验确定了相互作用的区域28，29。ChIP技术用于分析蛋白质与其同源DNA在细胞内的相互作用。其目标是确定特定蛋白质（例如启动子或其他DNA结合位点上的转录因子）是否与特定的基因组区域结合。与DNA结合的蛋白质首先使用甲醛交联。随后分离染色质。通过超声处理或核酸酶消化将分离的染色质剪切成500 bp片段，并且使用特定于该蛋白质的抗体免疫沉淀与DNA结合的蛋白质。交联被逆转，并使用聚合酶链反应（PCR）或定量实时荧光定量PCR分析DNA。
ChIP结果导致了一种假设，即SMARCAL1可能通过诱导这些基因的启动子区域的构象变化来介导转录调控。使用QGRS映射器和Mfold软件来识别这些启动子区域形成二级结构的潜力28，29。QGRS映射器用于预测G-四链体32，而Mfold33 分析序列形成二级结构（如茎环）的能力。
二级结构分析后，使用重组的6X His标记活性DNA依赖性ATP酶A结构域（ADAAD）进行进一步的 体外 实验，这是SMARCAL1的牛同系物，从 大肠杆菌34纯化。使用ADAAD进行ATP酶测定，以确定鉴定的DNA序列可以作为效应子28，29。最后，进行CD光谱以监测ADAAD28，29在DNA分子中诱导的构象变化。
为了证明蛋白质的ATP酶活性对于诱导DNA分子的构象变化至关重要，添加了乙二胺四乙酸（EDTA）到螯合Mg + 2 或活性DNA依赖性ATP酶A结构域抑制剂新霉素（ADAADiN），SWI / SNF蛋白的特异性抑制剂）35，36.这种CD光谱技术可以与任何纯化的蛋白质一起使用，这些蛋白质已经通过ChIP或任何其他相关测定证明与启动子的预测基因组区域结合。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

圆二色性（CD）光谱是研究生物分子的二级结构和相互作用的一种简单方便的方法。CD光谱学的最新进展使得能够详细研究不同微环境中DNA的DNA-蛋白质相互作用和构象动力学，以更好地了解 体内的转录调控。需要解开潜在转录区域周围的区域才能进行转录。这是一个复杂的过程，需要协调组蛋白修饰，转录因子与DNA的结合以及其他染色质重塑活动。使用CD光谱，可以研究由调节蛋白（例如ATP依赖性染色质重塑剂）引起的启动子区域的构象变化，以促进转录。也可以监测蛋白质中发生的构象变化。此外，有关蛋白质对其靶DNA的亲和力和序列特异性的疑问可以通过在靶DNA中掺入突变来解决。简而言之，对这种灵敏且廉价的方法的独特理解可以预测染色质动力学的变化，从而提高对转录调控的理解。

ADAAD稳定MYC启动子上的茎环状结构 先前的实验证据表明，SMARCAL1是MYC29的负调节因子。QGRS映射器对MYC基因159 bp长启动子区域的分析表明，正向链具有形成G-四链体的潜力（表2）。Mfold表明MYC DNA的两条链都可以形成茎环状结构（表2）。合成了含有G-四链体（GECE）的34 bp长DN...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

使用CD光谱描述了ATP依赖性染色质重塑剂与DNA配体的相互作用。通过产生的峰分析的基因启动子上诱导的构象变化可用于了解转录调控的机制。

CD光谱学研究DNA-蛋白质相互作用

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

该协议使我们能够可视化由ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA第二次重组的变化。DNA结构的变化可能与转录调控相关。这是一种简单且高度敏感的技术，它使用非常少量的纯DNA来记录寡核苷酸的结构变化。该方法可以深入了解由ATP依赖性染色质重塑蛋白介导的转录调控。首先，新鲜制备缓冲液和其他反应组分的工作浓度，并在设置反应之前将它们保持在四摄氏度，然后使用NADH偶联氧化测定法在不同DNA分子存在下测量蛋白质的ATP酶活性。将0.1毫摩尔ADAAD，2毫摩尔ATP，10纳摩尔DNA和1X REG缓冲液在96孔板中混合至最终体积为250微升。接下来，在37摄氏度的培养箱中孵育反应30分钟，然后使用与酶标仪一起提供的软件测量NAD +的量。要测量340纳米处的吸光度，请单击NADH测定并将96孔板放在仪器中的板架上，然后单击读取板按钮以记录吸光度。在高透明度石英比色皿中收集CD光谱。使用矩形或圆柱形比色皿。要清洁比色皿，请用水清洗几次，然后扫描比色皿中的水或缓冲液以检查其是否干净。对于反应，使用PAGE纯化的DNA寡核苷酸。为了快速冷却，在加热块上将DNA在94摄氏度下加热三分钟，然后立即在冰上冷却。对于缓慢冷却，在将DNA加热到94摄氏度三分钟后，让它以每分钟一摄氏度的速度冷却到室温。为了记录基线光谱，在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个对照反应。在所有反应中将反应体积保持在300微升。为了记录CD光谱，在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个实验反应。要记录扫描，请打开气体并打开CD光谱仪。10到15分钟后，打开灯，打开水浴，并将支架温度设置为37摄氏度。接下来，打开CD光谱软件，将温度设置为37摄氏度，波长范围在180至300纳米，每个点的时间为0.5秒，扫描编号设置为5，然后单击pro数据查看器，制作一个新文件，并使用实验的详细信息和日期对其进行重命名。接下来，通过移液混合基线和实验反应，并小心地将反应混合物逐个转移到比色皿中，确保没有气泡。如果进行时间过程实验，请在37摄氏度下孵育反应所需的时间，然后进行扫描。将EDTA加入含有DNA，ATP，镁和蛋白质的缓冲液中以阻止ATP水解。为了完全抑制ATP酶活性，增加EDTA浓度和孵育时间。从软件中的相应反应中减去基线，并在CD光谱软件或数据绘图软件中平滑数据，然后绘制波长与平均残差椭圆度的图表并分析峰值。M-folds表明MYC DNA的两条链都可以形成茎环状结构。这里显示了包含G四链体GECE的正向和反向DNA序列的M折叠结构。在ATP和ADAAD不存在和存在的情况下，快速冷却的GECE的CD光谱表明，ADAAD诱导了两个正峰，一个在258纳米处，另一个在210纳米处。EDTA的加入废除了这种构象变化。CD光谱现在有一个负210纳米的峰值和一个宽的正波段，峰值在230和250纳米。QGRS映射器和M折叠分析表明，DROSHA，DGCR8和DICER的启动子区域具有形成G四链体和茎状结构的潜力。DROSHA对5的CD光谱显示，ADAAD在210纳米处诱导负峰，在260纳米处诱导正峰。该光谱是ADNA的特征。DGCR8对一的CD光谱在210纳米处显示正峰，在260纳米处显示宽负峰。该谱是B到X过渡的特征。对于DGCR8对7，在210纳米和270纳米处看到了强烈的正峰，在250纳米处看到了负峰。该光谱是平行G四链体DNA结构的特征。最后，对于DICER对一，在210纳米处观察到一个正峰和两个负峰，一个在230纳米处，另一个在260纳米处。这些峰是A到X DNA过渡的特征。确保DNA和蛋白质的纯度为99%以上。比色皿应干净，基线应小于一百分之一。所有试剂应为纯正，使背景小于一毫微。

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