Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

De auteurs willen Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, bedanken voor de CD spectrofotometer. V.J. en A.D. werden ondersteund door een fellowship van CSIR.

1. Werkconcentratie van de reactiecomponenten
<ol><li>Bereid de werkconcentraties van buffers voor CD en andere reactiecomponenten vers voor (zie tabel 1) en houd ze op 4 °C voordat u de reacties instelt. OPMERKING: Voor de cd-reacties die in dit artikel worden beschreven, zijn de werkconcentraties van componenten als volgt: Natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Eiwit 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol><stro...

Het doel van dit artikel is om de CD-spectroscopietechniek te introduceren als een benadering om de conformatieveranderingen in het DNA te bestuderen in de aanwezigheid van ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten en om deze conformatieveranderingen te koppelen aan genexpressie. CD-spectroscopie biedt een snelle en gemakkelijk toegankelijke methode om de conformationele veranderingen in DNA te bestuderen.

Een cruciaal punt om te overwegen voor deze techniek is de zuiverheid va...

Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die vertrouwt op de inherente chiraliteit van biologische macromoleculen die leidt tot differentiële absorptie van rechtshandig en linkshandig circulair gepolariseerd licht. Deze differentiële absorptie staat bekend als circulair dichroïsme. De techniek kan daarom worden gebruikt om de conformatie van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, die beide chirale centra bevatten1,2 af te bakenen.
Elektromagnetische golven bevatten zowel elektrische als magnetische componenten. Zowel het elektrische als het magnetisch veld oscilleren loodrecht op de richting van de golfvoortplanting. In het geval van ongepolariseerd licht oscilleren deze velden in vele richtingen. Wanneer het licht circulair gepolariseerd is, worden twee elektromagnetische velden verkregen met een faseverschil van 90° ten opzichte van elkaar. Chirale moleculen vertonen een cirkelvormige optische rotatie (birefringence) zodanig dat ze het rechtshandige circulair gepolariseerde licht en het linkshandige circulair gepolariseerde licht in verschillende mate zullen absorberen3. Het resulterende elektrische veld zal worden getraceerd als een ellips, een functie van de golflengte. Het CD-spectrum wordt dus geregistreerd als ellipticiteit (q) en de gegevens worden gepresenteerd als Mean Residue Ellipticity als functie van golflengte.
In het geval van eiwitten is de Cα van aminozuren (behalve glycine) chiraal, en dit wordt benut door CD-spectroscopie om de secundaire structuur van dit macromolecuul4 te bepalen. De CD-spectra van eiwitmoleculen worden meestal geregistreerd in het Verre UV-bereik. α-spiraalvormige eiwitten hebben twee negatieve banden bij 222 nm en 208 nm en één positieve piek bij 193 nm4. Eiwitten met anti-parallelle β-sheet secundaire structuur vertonen een negatieve piek bij 218 nm en een positieve piek bij 195 nm4. Eiwitten met ongeordende structuren vertonen een lage ellipticiteit in de buurt van 210 nm en een negatieve piek bij 195 nm4. De goed gedefinieerde piek/banden voor verschillende secundaire structuren maken CD dus een handig hulpmiddel om de conformatieveranderingen op te helderen die optreden in de secundaire structuur van de eiwitten tijdens denaturatie en ligandbinding.
Nucleïnezuren hebben drie bronnen van chiraliteit: het suikermolecuul, de heliciteit van de secundaire structuur en de tertiaire ordening van DNA op lange afstand in de omgeving5,6. De CD-spectra van nucleïnezuren worden meestal geregistreerd in het bereik van 190 tot 300 nm5,6. Elke conformatie van DNA geeft, net als eiwitten, een karakteristiek spectrum, hoewel de pieken / banden met enige mate kunnen variëren als gevolg van oplosmiddelomstandigheden en verschillen in DNA-sequenties7. B-DNA, de meest voorkomende vorm, wordt gekenmerkt door een positieve piek rond 260-280 nm en een negatieve piek rond 245 nm6. De pieken/banden van B-vorm DNA zijn over het algemeen klein omdat de basenparen loodrecht staan op de dubbele helix, waardoor het molecuul zwakke chiraliteit krijgt. A-DNA geeft een dominante positieve piek bij 260 nm en een negatieve piek rond 210 nm6. Z-DNA, de linkshandige helix, geeft een negatieve band bij 290 nm en een positieve piek rond 260 nm6. Dit DNA geeft ook een extreem negatieve piek bij 205 nm6.
Naast deze conformaties kan DNA ook triplexen, quadruplexen en haarspeldbochten vormen, die allemaal kunnen worden onderscheiden door CD-spectroscopie. De parallelle G-quadruplex geeft een dominante positieve band bij 260 nm, terwijl de anti-parallelle G-quadruplex een negatieve band geeft bij 260 nm en een positieve piek bij 290 nm, waardoor het gemakkelijk is om onderscheid te maken tussen de twee vormen van quadruplexstructuren6. Triplexen geven geen karakteristiek spectrum8. De spectra van een 36 nucleotide-lang DNA met de potentie om een intramoleculaire triple helix te vormen met G.G.C en T.A.T basenparen in aanwezigheid van Na+ vertonen bijvoorbeeld een sterke negatieve band bij 240 nm en een brede positieve piek. De brede positieve piek toont bijdragen op 266, 273 en 286 nm. Hetzelfde oligonucleotide in aanwezigheid van Na+ en Zn+ vertoont vier negatieve banden (213, 238, 266 en 282 nm) en een positieve piek bij 258 nm. De spectra van triplex-DNA kunnen dus variëren afhankelijk van de zoutcondities8.
Naast deze conformaties hebben CD-spectra de identificatie van een andere vorm van DNA mogelijk gemaakt, X-DNA genaamd. X-DNA wordt gevormd wanneer de DNA-sequentie alternatieve adenine- en thymineresiduen bevat. De CD-spectra van X-DNA bevatten twee negatieve pieken bij 250 en 280 nm. Er is zeer weinig informatie beschikbaar over X-DNA, hoewel er is gespeculeerd dat het functioneert als een gootsteen voor positieve supercoiling6,9. Veranderingen in CD-spectra kunnen ook details onthullen over ligand-eiwitinteracties en zijn daarom toegevoegd aan het arsenaal aan moleculaire methoden voor het detecteren van geneesmiddel-eiwitinteracties10,11,12,13,14. CD-spectra zijn ook gebruikt om de veranderingen in de secundaire structuur van eiwitten tijdens het vouwproces te volgen15. Op dezelfde manier kunnen CD-spectra ook worden gebruikt voor het onderzoeken van ligand-DNA-interacties16,17.
CD-spectroscopie is dus een eenvoudige, goedkope methode om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van DNA-conformatie, op voorwaarde dat er toegang is tot niet-zo-goedkope apparatuur en software. De methode is buitengewoon gevoelig en snel. Het vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA, waardoor het een voorsprong heeft op de alternatieve techniek van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Titraties met liganden en substraten zijn ook gemakkelijk uit te voeren. De belangrijkste beperking is dat het DNA zeer zuiver moet zijn. Het is raadzaam om polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) -gezuiverd DNA te gebruiken.
De informatie verkregen door CD-spectra is voornamelijk gebruikt om eiwitstructurele kenmerken af te leiden en om verschillende DNA-conformers te identificeren. In deze studie zijn CD-spectra gebruikt om de resultaten van een in vivo Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) experiment te integreren om af te bakenen of het eiwit van belang / voorspelde transcriptiefactor een conformatieverandering kan teweegbrengen in het promotorgebied van zijn effectorgenen. Deze samenwerking helpt bij de voortgang van traditionele CD-spectroscopische technieken door het mechanisme van transcriptieregulatie te voorspellen door de voorspelde transcriptiefactor op en rond de transcriptiestartplaats (TSS) van een promotor.
Chromatineremodellering is een goed gedefinieerd mechanisme waarvan bekend is dat het DNA-metabolische processen reguleert door het dicht opeengepakte chromatine toegankelijk te maken voor verschillende regulerende factoren zoals transcriptiefactoren, componenten van DNA-replicatie of schadehersteleiwitten. De ATP-afhankelijke chromatine-remodelers, ook bekend als de SWI / SNF-familie van eiwitten, zijn belangrijke remodeler-eiwitten die aanwezig zijn in eukaryote cellen18,19. Fylogenetische clustering heeft de SWI/SNF-familie van eiwitten ingedeeld in 6 subgroepen20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like en distant. SMARCAL1, het eiwit van belang in deze studie, behoort tot de verre subgroep20. Dit eiwit is gebruikt om de manier van transcriptionele regulatie te onderzoeken met behulp van CD-spectroscopie.
Van de meeste leden van de ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten is aangetoond dat ze nucleosomen herpositioneren of uitzetten of histonvariantuitwisseling op een ATP-afhankelijke manier bemiddelen21,22. Van sommige leden van deze familie is echter niet aangetoond dat ze nucleosomen hermodelleren, bijvoorbeeld SMARCAL1. Hoewel studies hebben aangetoond dat SMARCAL1 associeert met polyteenchromosomen, ontbreekt experimenteel bewijs met betrekking tot het vermogen om nucleosomen te hermodelleren23. Daarom werd gepostuleerd dat SMARCAL1 transcriptie kan reguleren door de conformatie van DNA24 te veranderen. CD-spectroscopie bood een eenvoudige en toegankelijke methode om deze hypothese te valideren.
SMARCAL1 is een ATP-afhankelijk chromatineremodelleringseiwit dat voornamelijk functioneert als een gloeiende helicase25,26,27. Het is gepostuleerd om transcriptie te moduleren door de DNA-conformatie te hermodelleren24. Om deze hypothese te testen, werd de rol van SMARCAL1 bij het reguleren van gentranscriptie tijdens doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade bestudeerd. In deze studies werd SMARCAL1 gebruikt voor in vivo analyse en ADAAD voor in vitro assays28,29. Eerdere studies hebben aangetoond dat ADAAD DNA kan herkennen op een structuurafhankelijke maar sequentie-onafhankelijke manier30,31. Het eiwit bindt optimaal aan DNA-moleculen met dubbelstrengs naar enkelstrengs overgangsgebieden, vergelijkbaar met stamlus-DNA, en hydrolyseert ATP 30,31.
In vivo experimenten toonden aan dat SMARCAL1 de expressie van MYC, DROSHA, DGCR8 en DICER reguleert door zich te binden aan de promotorregio's28,29. Het interactiegebied werd geïdentificeerd door ChIP-experimenten28,29. De ChIP-techniek wordt gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn verwante DNA in de cel te analyseren. Het doel is om te bepalen of specifieke eiwitten, zoals transcriptiefactoren op promotors of andere DNA-bindingsplaatsen, gebonden zijn aan specifieke genomische gebieden. Het eiwit gebonden aan DNA wordt eerst verknoopt met behulp van formaldehyde. Dit wordt gevolgd door isolatie van het chromatine. Het geïsoleerde chromatine wordt afgeschoren tot 500 bp-fragmenten door ultrasoonapparaat of nucleasevertering, en het eiwit gebonden aan DNA wordt immunoprecipiteerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit. De cross-linking wordt omgekeerd en het DNA wordt geanalyseerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) of kwantitatieve real-time PCR.
De ChIP-resultaten leidden tot de hypothese dat SMARCAL1 mogelijk transcriptionele regulatie bemiddelt door een conformatieverandering in de promotorregio's van deze genen te induceren. QGRS mapper en Mfold software werden gebruikt om het potentieel van deze promotorregio's te identificeren om secundaire structuren te vormen28,29. QGRS mapper wordt gebruikt voor het voorspellen van G-quadruplexes32, terwijl Mfold33 het vermogen van een sequentie analyseert om secundaire structuren zoals stamlussen te vormen.
Na secundaire structuuranalyse werden verdere in vitro experimenten uitgevoerd met recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), de runderhomologe van SMARCAL1, gezuiverd van Escherichia coli34. ATPase-testen werden uitgevoerd met behulp van ADAAD om vast te stellen dat de geïdentificeerde DNA-sequenties als effectoren konden fungeren28,29. Ten slotte werd CD-spectroscopie uitgevoerd om de conformatieveranderingen te volgen die door ADAAD28,29 in het DNA-molecuul werden geïnduceerd.
Om te bewijzen dat de ATPase-activiteit van het eiwit essentieel was voor het induceren van een conformatieverandering in het DNA-molecuul, werd ofwel ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toegevoegd aan chelaat Mg +2 of Active DNA-afhankelijk ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), een specifieke remmer van het SWI / SNF-eiwit, werd toegevoegd35,36 . Deze CD-spectroscopische techniek kan worden gebruikt met elk gezuiverd eiwit dat is aangetoond door ChIP of een andere relevante test om te binden aan een voorspeld genomisch gebied van een promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie is een eenvoudige en handige methode om de secundaire structuur en interacties van biomoleculen te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CD-spectroscopie hebben de studie van DNA-eiwitinteracties en conformatiedynamiek van DNA in verschillende micro-omgevingen in detail mogelijk gemaakt voor een beter begrip van transcriptionele regulatie in vivo. Het gebied rond een potentiële transcriptiezone moet worden afgewikkeld om transcriptie te laten plaatsvinden. Dit is een complex proces dat de coördinatie van histonmodificaties, binding van de transcriptiefactor aan DNA en andere chromatineremodelleringsactiviteiten vereist. Met behulp van CD-spectroscopie is het mogelijk om conformationele veranderingen in het promotorgebied te bestuderen die worden veroorzaakt door regulerende eiwitten, zoals ATP-afhankelijke chromatineremodelleurs, om transcriptie te bevorderen. De conformatieveranderingen die zich in het eiwit voordoen, kunnen ook worden gevolgd. Bovendien kunnen vragen over de affiniteit van het eiwit ten opzichte van het doel-DNA en de sequentiespecificiteit worden beantwoord door mutaties in het doel-DNA op te nemen. Kortom, het unieke begrip van deze gevoelige en goedkope methode kan veranderingen in de chromatinedynamica voorspellen, waardoor het begrip van transcriptionele regulatie wordt verbeterd.

ADAAD stabiliseert een steel-loop achtige structuur op de MYC promotor Eerder experimenteel bewijs toonde aan dat SMARCAL1 een negatieve regulator is van MYC29. Analyse van het 159 bp lange promotorgebied van het MYC-gen door QGRS mapper toonde aan dat de voorwaartse streng het potentieel had om een G-quadruplex te vormen (tabel 2). Mfold toonde aan dat beide strengen van het MYC-DNA een sten...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Het protocol stelt ons in staat om de veranderingen in de tweede herstructurering van DNA geïnduceerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten te visualiseren. De verandering in de DNA-structuur kan worden gecorreleerd aan transcriptieregulatie. Dit is een eenvoudige en zeer gevoelige techniek die een zeer kleine hoeveelheid zuiver DNA gebruikt om de structurele veranderingen in het oligonucleotide vast te leggen.Deze methode kan inzicht geven in transcriptieregulatie gemedieerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten. Bereid om te beginnen de werkconcentraties van buffers en andere reactiecomponenten vers voor en houd ze op vier graden Celsius voordat u de reacties instelt en meet vervolgens de ATPase-activiteit van het eiwit in aanwezigheid van verschillende DNA-moleculen met behulp van een NADH-gekoppelde oxidatietest. Meng 0,1 millimolar ADAAD, twee millimolar ATP, 10 nanomolair DNA en 1X REG-buffer in een 96-well plaat tot een eindvolume van 250 microliter.Incubeer vervolgens de reactie gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en meet vervolgens de hoeveelheid NAD + met behulp van de software die samen met de microplaatlezer wordt geleverd. Om de absorptie bij 340 nanometer te meten, klikt u op de NADH-test en plaatst u de 96-well plaat op de plaathouder in het instrument en klikt u vervolgens op de leesplaatknop om de absorptie te registreren. Verzamel de cd-spectra in hoogtransparante kwartscuvetten.Gebruik rechthoekige of cilindrische cuvetten. Om de cuvetten schoon te maken, was je ze meerdere keren met water en maak je vervolgens een scan van het water of de buffer in de cuvette om te controleren of deze schoon is. Gebruik voor de reacties PAGE-gezuiverde DNA-oligonucleotiden.Voor een snelle afkoeling verwarm je het DNA drie minuten lang op 94 graden Celsius op het verwarmingsblok en koel je het onmiddellijk af op ijs. Voor een langzame afkoeling, na het verwarmen van het DNA op 94 graden Celsius gedurende drie minuten, laat het afkoelen tot kamertemperatuur met een snelheid van één graad Celsius per minuut. Om de basisspectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf controlereacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in.Houd het reactievolume in alle reacties op 300 microliter. Om de CD-spectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf experimentele reacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in. Om de scan op te nemen, zet u het gas aan en schakelt u de CD-spectrometer in.Schakel na 10 tot 15 minuten de lamp in, schakel het waterbad in en stel de houdertemperatuur in op 37 graden Celsius. Open vervolgens de cd-spectrumsoftware en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius, het golflengtebereik op 180 tot 300 nanometer, de tijd per punt op 0,5 seconden en het scannummer op vijf, klik vervolgens op de pro data viewer, maak een nieuw bestand en hernoem het met de details van het experiment en de datum. Meng vervolgens de basislijn- en experimentele reacties door te pipetteren en breng de reactiemengsels voorzichtig één voor één over naar de cuvette, zodat er geen luchtbellen zijn.Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, incubeer dan de reacties bij 37 graden Celsius gedurende de vereiste tijd en neem vervolgens de scan. Voeg EDTA toe aan de buffer met het DNA, ATP, magnesium en eiwit om ATP-hydrolyse te stoppen. Om de ATPase-activiteit volledig te remmen, verhoogt u de EDTA-concentratie en incubatietijd.Trek de basislijnen af van de overeenkomstige reacties in de software en maak de gegevens glad in de CD-spectrumsoftware of in de dataplotsoftware, plot vervolgens een grafiek van golflengte tegen gemiddelde residu-ellipticiteit en analyseer de pieken. M-plooien toonden aan dat beide strengen van het MYC-DNA een stengellusachtige structuur konden vormen. De M-voudige structuren van de voorwaartse en de omgekeerde DNA-sequentie met de G quadruplex GECE worden hier getoond.De CD-spectra van snel gekoelde GECE in afwezigheid en aanwezigheid van ATP en ADAAD toonden aan dat ADAAD twee positieve pieken induceert, een bij 258 nanometer en de andere bij 210 nanometer. De toevoeging van EDTA maakt deze conformatieverandering ongedaan. De CD-spectra hebben nu een negatieve piek van 210 nanometer en een brede positieve band met pieken op 230 en 250 nanometer.QGRS mapper en M-fold analyse toonden aan dat de promotorregio's van DROSHA, DGCR8 en DICER het potentieel hebben om G quadruplex en stem-achtige structuren te vormen. De CD-spectra van het DROSHA-paar vijf toonden aan dat ADAAD een negatieve piek induceert op 210 nanometer en een positieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is een kenmerk van ADNA.De CD-spectra van DGCR8 paar één toonden een positieve piek op 210 nanometer en een brede negatieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is kenmerkend voor de overgang van B naar X. Voor het DGCR8-paar zeven werden sterke positieve pieken op 210 en 270 nanometer en een negatieve piek op 250 nanometer gezien.Dit spectrum is kenmerkend voor parallelle G quadruplex DNA-structuren. Ten slotte werd voor het DICER-paar één een positieve piek op 210 nanometer en twee negatieve pieken waargenomen, één op 230 nanometer en de andere op 260 nanometer. Deze pieken zijn kenmerkend voor een A naar X DNA overgang.Zorg ervoor dat de zuiverheid van DNA en eiwit 99% of meer is. De cuvette moet schoon zijn en de basislijn moet minder dan één millidegree zijn. Alle reagentia moeten zuiver zijn, zodat de achtergrond minder dan één millidegree is.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...