Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

De auteurs willen Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, bedanken voor de CD spectrofotometer. V.J. en A.D. werden ondersteund door een fellowship van CSIR.

1. Werkconcentratie van de reactiecomponenten
<ol><li>Bereid de werkconcentraties van buffers voor CD en andere reactiecomponenten vers voor (zie tabel 1) en houd ze op 4 °C voordat u de reacties instelt. OPMERKING: Voor de cd-reacties die in dit artikel worden beschreven, zijn de werkconcentraties van componenten als volgt: Natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Eiwit 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol><stro...

Het doel van dit artikel is om de CD-spectroscopietechniek te introduceren als een benadering om de conformatieveranderingen in het DNA te bestuderen in de aanwezigheid van ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten en om deze conformatieveranderingen te koppelen aan genexpressie. CD-spectroscopie biedt een snelle en gemakkelijk toegankelijke methode om de conformationele veranderingen in DNA te bestuderen.

Een cruciaal punt om te overwegen voor deze techniek is de zuiverheid va...

Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die vertrouwt op de inherente chiraliteit van biologische macromoleculen die leidt tot differentiële absorptie van rechtshandig en linkshandig circulair gepolariseerd licht. Deze differentiële absorptie staat bekend als circulair dichroïsme. De techniek kan daarom worden gebruikt om de conformatie van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, die beide chirale centra bevatten1,2 af te bakenen.
Elektromagnetische golven bevatten zowel elektrische als magnetische componenten. Zowel het elektrische als het magnetisch veld oscilleren loodrecht op de richting van de golfvoortplanting. In het geval van ongepolariseerd licht oscilleren deze velden in vele richtingen. Wanneer het licht circulair gepolariseerd is, worden twee elektromagnetische velden verkregen met een faseverschil van 90° ten opzichte van elkaar. Chirale moleculen vertonen een cirkelvormige optische rotatie (birefringence) zodanig dat ze het rechtshandige circulair gepolariseerde licht en het linkshandige circulair gepolariseerde licht in verschillende mate zullen absorberen3. Het resulterende elektrische veld zal worden getraceerd als een ellips, een functie van de golflengte. Het CD-spectrum wordt dus geregistreerd als ellipticiteit (q) en de gegevens worden gepresenteerd als Mean Residue Ellipticity als functie van golflengte.
In het geval van eiwitten is de Cα van aminozuren (behalve glycine) chiraal, en dit wordt benut door CD-spectroscopie om de secundaire structuur van dit macromolecuul4 te bepalen. De CD-spectra van eiwitmoleculen worden meestal geregistreerd in het Verre UV-bereik. α-spiraalvormige eiwitten hebben twee negatieve banden bij 222 nm en 208 nm en één positieve piek bij 193 nm4. Eiwitten met anti-parallelle β-sheet secundaire structuur vertonen een negatieve piek bij 218 nm en een positieve piek bij 195 nm4. Eiwitten met ongeordende structuren vertonen een lage ellipticiteit in de buurt van 210 nm en een negatieve piek bij 195 nm4. De goed gedefinieerde piek/banden voor verschillende secundaire structuren maken CD dus een handig hulpmiddel om de conformatieveranderingen op te helderen die optreden in de secundaire structuur van de eiwitten tijdens denaturatie en ligandbinding.
Nucleïnezuren hebben drie bronnen van chiraliteit: het suikermolecuul, de heliciteit van de secundaire structuur en de tertiaire ordening van DNA op lange afstand in de omgeving5,6. De CD-spectra van nucleïnezuren worden meestal geregistreerd in het bereik van 190 tot 300 nm5,6. Elke conformatie van DNA geeft, net als eiwitten, een karakteristiek spectrum, hoewel de pieken / banden met enige mate kunnen variëren als gevolg van oplosmiddelomstandigheden en verschillen in DNA-sequenties7. B-DNA, de meest voorkomende vorm, wordt gekenmerkt door een positieve piek rond 260-280 nm en een negatieve piek rond 245 nm6. De pieken/banden van B-vorm DNA zijn over het algemeen klein omdat de basenparen loodrecht staan op de dubbele helix, waardoor het molecuul zwakke chiraliteit krijgt. A-DNA geeft een dominante positieve piek bij 260 nm en een negatieve piek rond 210 nm6. Z-DNA, de linkshandige helix, geeft een negatieve band bij 290 nm en een positieve piek rond 260 nm6. Dit DNA geeft ook een extreem negatieve piek bij 205 nm6.
Naast deze conformaties kan DNA ook triplexen, quadruplexen en haarspeldbochten vormen, die allemaal kunnen worden onderscheiden door CD-spectroscopie. De parallelle G-quadruplex geeft een dominante positieve band bij 260 nm, terwijl de anti-parallelle G-quadruplex een negatieve band geeft bij 260 nm en een positieve piek bij 290 nm, waardoor het gemakkelijk is om onderscheid te maken tussen de twee vormen van quadruplexstructuren6. Triplexen geven geen karakteristiek spectrum8. De spectra van een 36 nucleotide-lang DNA met de potentie om een intramoleculaire triple helix te vormen met G.G.C en T.A.T basenparen in aanwezigheid van Na+ vertonen bijvoorbeeld een sterke negatieve band bij 240 nm en een brede positieve piek. De brede positieve piek toont bijdragen op 266, 273 en 286 nm. Hetzelfde oligonucleotide in aanwezigheid van Na+ en Zn+ vertoont vier negatieve banden (213, 238, 266 en 282 nm) en een positieve piek bij 258 nm. De spectra van triplex-DNA kunnen dus variëren afhankelijk van de zoutcondities8.
Naast deze conformaties hebben CD-spectra de identificatie van een andere vorm van DNA mogelijk gemaakt, X-DNA genaamd. X-DNA wordt gevormd wanneer de DNA-sequentie alternatieve adenine- en thymineresiduen bevat. De CD-spectra van X-DNA bevatten twee negatieve pieken bij 250 en 280 nm. Er is zeer weinig informatie beschikbaar over X-DNA, hoewel er is gespeculeerd dat het functioneert als een gootsteen voor positieve supercoiling6,9. Veranderingen in CD-spectra kunnen ook details onthullen over ligand-eiwitinteracties en zijn daarom toegevoegd aan het arsenaal aan moleculaire methoden voor het detecteren van geneesmiddel-eiwitinteracties10,11,12,13,14. CD-spectra zijn ook gebruikt om de veranderingen in de secundaire structuur van eiwitten tijdens het vouwproces te volgen15. Op dezelfde manier kunnen CD-spectra ook worden gebruikt voor het onderzoeken van ligand-DNA-interacties16,17.
CD-spectroscopie is dus een eenvoudige, goedkope methode om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van DNA-conformatie, op voorwaarde dat er toegang is tot niet-zo-goedkope apparatuur en software. De methode is buitengewoon gevoelig en snel. Het vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA, waardoor het een voorsprong heeft op de alternatieve techniek van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Titraties met liganden en substraten zijn ook gemakkelijk uit te voeren. De belangrijkste beperking is dat het DNA zeer zuiver moet zijn. Het is raadzaam om polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) -gezuiverd DNA te gebruiken.
De informatie verkregen door CD-spectra is voornamelijk gebruikt om eiwitstructurele kenmerken af te leiden en om verschillende DNA-conformers te identificeren. In deze studie zijn CD-spectra gebruikt om de resultaten van een in vivo Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) experiment te integreren om af te bakenen of het eiwit van belang / voorspelde transcriptiefactor een conformatieverandering kan teweegbrengen in het promotorgebied van zijn effectorgenen. Deze samenwerking helpt bij de voortgang van traditionele CD-spectroscopische technieken door het mechanisme van transcriptieregulatie te voorspellen door de voorspelde transcriptiefactor op en rond de transcriptiestartplaats (TSS) van een promotor.
Chromatineremodellering is een goed gedefinieerd mechanisme waarvan bekend is dat het DNA-metabolische processen reguleert door het dicht opeengepakte chromatine toegankelijk te maken voor verschillende regulerende factoren zoals transcriptiefactoren, componenten van DNA-replicatie of schadehersteleiwitten. De ATP-afhankelijke chromatine-remodelers, ook bekend als de SWI / SNF-familie van eiwitten, zijn belangrijke remodeler-eiwitten die aanwezig zijn in eukaryote cellen18,19. Fylogenetische clustering heeft de SWI/SNF-familie van eiwitten ingedeeld in 6 subgroepen20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like en distant. SMARCAL1, het eiwit van belang in deze studie, behoort tot de verre subgroep20. Dit eiwit is gebruikt om de manier van transcriptionele regulatie te onderzoeken met behulp van CD-spectroscopie.
Van de meeste leden van de ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten is aangetoond dat ze nucleosomen herpositioneren of uitzetten of histonvariantuitwisseling op een ATP-afhankelijke manier bemiddelen21,22. Van sommige leden van deze familie is echter niet aangetoond dat ze nucleosomen hermodelleren, bijvoorbeeld SMARCAL1. Hoewel studies hebben aangetoond dat SMARCAL1 associeert met polyteenchromosomen, ontbreekt experimenteel bewijs met betrekking tot het vermogen om nucleosomen te hermodelleren23. Daarom werd gepostuleerd dat SMARCAL1 transcriptie kan reguleren door de conformatie van DNA24 te veranderen. CD-spectroscopie bood een eenvoudige en toegankelijke methode om deze hypothese te valideren.
SMARCAL1 is een ATP-afhankelijk chromatineremodelleringseiwit dat voornamelijk functioneert als een gloeiende helicase25,26,27. Het is gepostuleerd om transcriptie te moduleren door de DNA-conformatie te hermodelleren24. Om deze hypothese te testen, werd de rol van SMARCAL1 bij het reguleren van gentranscriptie tijdens doxorubicine-geïnduceerde DNA-schade bestudeerd. In deze studies werd SMARCAL1 gebruikt voor in vivo analyse en ADAAD voor in vitro assays28,29. Eerdere studies hebben aangetoond dat ADAAD DNA kan herkennen op een structuurafhankelijke maar sequentie-onafhankelijke manier30,31. Het eiwit bindt optimaal aan DNA-moleculen met dubbelstrengs naar enkelstrengs overgangsgebieden, vergelijkbaar met stamlus-DNA, en hydrolyseert ATP 30,31.
In vivo experimenten toonden aan dat SMARCAL1 de expressie van MYC, DROSHA, DGCR8 en DICER reguleert door zich te binden aan de promotorregio's28,29. Het interactiegebied werd geïdentificeerd door ChIP-experimenten28,29. De ChIP-techniek wordt gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn verwante DNA in de cel te analyseren. Het doel is om te bepalen of specifieke eiwitten, zoals transcriptiefactoren op promotors of andere DNA-bindingsplaatsen, gebonden zijn aan specifieke genomische gebieden. Het eiwit gebonden aan DNA wordt eerst verknoopt met behulp van formaldehyde. Dit wordt gevolgd door isolatie van het chromatine. Het geïsoleerde chromatine wordt afgeschoren tot 500 bp-fragmenten door ultrasoonapparaat of nucleasevertering, en het eiwit gebonden aan DNA wordt immunoprecipiteerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit. De cross-linking wordt omgekeerd en het DNA wordt geanalyseerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR) of kwantitatieve real-time PCR.
De ChIP-resultaten leidden tot de hypothese dat SMARCAL1 mogelijk transcriptionele regulatie bemiddelt door een conformatieverandering in de promotorregio's van deze genen te induceren. QGRS mapper en Mfold software werden gebruikt om het potentieel van deze promotorregio's te identificeren om secundaire structuren te vormen28,29. QGRS mapper wordt gebruikt voor het voorspellen van G-quadruplexes32, terwijl Mfold33 het vermogen van een sequentie analyseert om secundaire structuren zoals stamlussen te vormen.
Na secundaire structuuranalyse werden verdere in vitro experimenten uitgevoerd met recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), de runderhomologe van SMARCAL1, gezuiverd van Escherichia coli34. ATPase-testen werden uitgevoerd met behulp van ADAAD om vast te stellen dat de geïdentificeerde DNA-sequenties als effectoren konden fungeren28,29. Ten slotte werd CD-spectroscopie uitgevoerd om de conformatieveranderingen te volgen die door ADAAD28,29 in het DNA-molecuul werden geïnduceerd.
Om te bewijzen dat de ATPase-activiteit van het eiwit essentieel was voor het induceren van een conformatieverandering in het DNA-molecuul, werd ofwel ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toegevoegd aan chelaat Mg +2 of Active DNA-afhankelijk ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), een specifieke remmer van het SWI / SNF-eiwit, werd toegevoegd35,36 . Deze CD-spectroscopische techniek kan worden gebruikt met elk gezuiverd eiwit dat is aangetoond door ChIP of een andere relevante test om te binden aan een voorspeld genomisch gebied van een promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Circulaire dichroïsme (CD) spectroscopie is een eenvoudige en handige methode om de secundaire structuur en interacties van biomoleculen te onderzoeken. Recente ontwikkelingen in CD-spectroscopie hebben de studie van DNA-eiwitinteracties en conformatiedynamiek van DNA in verschillende micro-omgevingen in detail mogelijk gemaakt voor een beter begrip van transcriptionele regulatie in vivo. Het gebied rond een potentiële transcriptiezone moet worden afgewikkeld om transcriptie te laten plaatsvinden. Dit is een complex proces dat de coördinatie van histonmodificaties, binding van de transcriptiefactor aan DNA en andere chromatineremodelleringsactiviteiten vereist. Met behulp van CD-spectroscopie is het mogelijk om conformationele veranderingen in het promotorgebied te bestuderen die worden veroorzaakt door regulerende eiwitten, zoals ATP-afhankelijke chromatineremodelleurs, om transcriptie te bevorderen. De conformatieveranderingen die zich in het eiwit voordoen, kunnen ook worden gevolgd. Bovendien kunnen vragen over de affiniteit van het eiwit ten opzichte van het doel-DNA en de sequentiespecificiteit worden beantwoord door mutaties in het doel-DNA op te nemen. Kortom, het unieke begrip van deze gevoelige en goedkope methode kan veranderingen in de chromatinedynamica voorspellen, waardoor het begrip van transcriptionele regulatie wordt verbeterd.

ADAAD stabiliseert een steel-loop achtige structuur op de MYC promotor Eerder experimenteel bewijs toonde aan dat SMARCAL1 een negatieve regulator is van MYC29. Analyse van het 159 bp lange promotorgebied van het MYC-gen door QGRS mapper toonde aan dat de voorwaartse streng het potentieel had om een G-quadruplex te vormen (tabel 2). Mfold toonde aan dat beide strengen van het MYC-DNA een sten...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Het protocol stelt ons in staat om de veranderingen in de tweede herstructurering van DNA geïnduceerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten te visualiseren. De verandering in de DNA-structuur kan worden gecorreleerd aan transcriptieregulatie. Dit is een eenvoudige en zeer gevoelige techniek die een zeer kleine hoeveelheid zuiver DNA gebruikt om de structurele veranderingen in het oligonucleotide vast te leggen.Deze methode kan inzicht geven in transcriptieregulatie gemedieerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten. Bereid om te beginnen de werkconcentraties van buffers en andere reactiecomponenten vers voor en houd ze op vier graden Celsius voordat u de reacties instelt en meet vervolgens de ATPase-activiteit van het eiwit in aanwezigheid van verschillende DNA-moleculen met behulp van een NADH-gekoppelde oxidatietest. Meng 0,1 millimolar ADAAD, twee millimolar ATP, 10 nanomolair DNA en 1X REG-buffer in een 96-well plaat tot een eindvolume van 250 microliter.Incubeer vervolgens de reactie gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en meet vervolgens de hoeveelheid NAD + met behulp van de software die samen met de microplaatlezer wordt geleverd. Om de absorptie bij 340 nanometer te meten, klikt u op de NADH-test en plaatst u de 96-well plaat op de plaathouder in het instrument en klikt u vervolgens op de leesplaatknop om de absorptie te registreren. Verzamel de cd-spectra in hoogtransparante kwartscuvetten.Gebruik rechthoekige of cilindrische cuvetten. Om de cuvetten schoon te maken, was je ze meerdere keren met water en maak je vervolgens een scan van het water of de buffer in de cuvette om te controleren of deze schoon is. Gebruik voor de reacties PAGE-gezuiverde DNA-oligonucleotiden.Voor een snelle afkoeling verwarm je het DNA drie minuten lang op 94 graden Celsius op het verwarmingsblok en koel je het onmiddellijk af op ijs. Voor een langzame afkoeling, na het verwarmen van het DNA op 94 graden Celsius gedurende drie minuten, laat het afkoelen tot kamertemperatuur met een snelheid van één graad Celsius per minuut. Om de basisspectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf controlereacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in.Houd het reactievolume in alle reacties op 300 microliter. Om de CD-spectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf experimentele reacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in. Om de scan op te nemen, zet u het gas aan en schakelt u de CD-spectrometer in.Schakel na 10 tot 15 minuten de lamp in, schakel het waterbad in en stel de houdertemperatuur in op 37 graden Celsius. Open vervolgens de cd-spectrumsoftware en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius, het golflengtebereik op 180 tot 300 nanometer, de tijd per punt op 0,5 seconden en het scannummer op vijf, klik vervolgens op de pro data viewer, maak een nieuw bestand en hernoem het met de details van het experiment en de datum. Meng vervolgens de basislijn- en experimentele reacties door te pipetteren en breng de reactiemengsels voorzichtig één voor één over naar de cuvette, zodat er geen luchtbellen zijn.Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, incubeer dan de reacties bij 37 graden Celsius gedurende de vereiste tijd en neem vervolgens de scan. Voeg EDTA toe aan de buffer met het DNA, ATP, magnesium en eiwit om ATP-hydrolyse te stoppen. Om de ATPase-activiteit volledig te remmen, verhoogt u de EDTA-concentratie en incubatietijd.Trek de basislijnen af van de overeenkomstige reacties in de software en maak de gegevens glad in de CD-spectrumsoftware of in de dataplotsoftware, plot vervolgens een grafiek van golflengte tegen gemiddelde residu-ellipticiteit en analyseer de pieken. M-plooien toonden aan dat beide strengen van het MYC-DNA een stengellusachtige structuur konden vormen. De M-voudige structuren van de voorwaartse en de omgekeerde DNA-sequentie met de G quadruplex GECE worden hier getoond.De CD-spectra van snel gekoelde GECE in afwezigheid en aanwezigheid van ATP en ADAAD toonden aan dat ADAAD twee positieve pieken induceert, een bij 258 nanometer en de andere bij 210 nanometer. De toevoeging van EDTA maakt deze conformatieverandering ongedaan. De CD-spectra hebben nu een negatieve piek van 210 nanometer en een brede positieve band met pieken op 230 en 250 nanometer.QGRS mapper en M-fold analyse toonden aan dat de promotorregio's van DROSHA, DGCR8 en DICER het potentieel hebben om G quadruplex en stem-achtige structuren te vormen. De CD-spectra van het DROSHA-paar vijf toonden aan dat ADAAD een negatieve piek induceert op 210 nanometer en een positieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is een kenmerk van ADNA.De CD-spectra van DGCR8 paar één toonden een positieve piek op 210 nanometer en een brede negatieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is kenmerkend voor de overgang van B naar X. Voor het DGCR8-paar zeven werden sterke positieve pieken op 210 en 270 nanometer en een negatieve piek op 250 nanometer gezien.Dit spectrum is kenmerkend voor parallelle G quadruplex DNA-structuren. Ten slotte werd voor het DICER-paar één een positieve piek op 210 nanometer en twee negatieve pieken waargenomen, één op 230 nanometer en de andere op 260 nanometer. Deze pieken zijn kenmerkend voor een A naar X DNA overgang.Zorg ervoor dat de zuiverheid van DNA en eiwit 99% of meer is. De cuvette moet schoon zijn en de basislijn moet minder dan één millidegree zijn. Alle reagentia moeten zuiver zijn, zodat de achtergrond minder dan één millidegree is.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...