Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier l’Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pour le spectrophotomètre CD. V.J. et A.D. ont été soutenus par une bourse du CSIR.

1. Concentration en fonction des composants de la réaction
<ol><li>Préparer à nouveau les concentrations de travail des tampons pour la MC et d’autres composants de réaction (voir tableau 1) et les maintenir à 4 °C avant de mettre en place les réactions. REMARQUE: Pour les réactions CD décrites dans le présent article, les concentrations de travail des composants sont les suivantes: tampon phosphate de sodium (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, protéine 1 μM, MgC...

Le but de cet article est d’introduire la technique de spectroscopie CD comme une approche pour étudier les changements conformationnels se produisant dans l’ADN en présence de protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP et de lier ces changements conformationnels à l’expression des gènes. La spectroscopie CD fournit une méthode rapide et facilement accessible pour étudier les changements conformationnels dans l’ADN.

Un point crucial à considérer p...

Le dichroïsme circulaire (CD) est une technique spectroscopique qui repose sur la chiralité inhérente des macromolécules biologiques qui conduit à l’absorption différentielle de la lumière polarisée circulairement pour droitiers et gauchers. Cette absorption différentielle est connue sous le nom de dichroïsme circulaire. La technique peut donc être utilisée pour délimiter la conformation des macromolécules biologiques, telles que les protéines et l’ADN, qui contiennent toutes deux des centres chiraux1,2.
Les ondes électromagnétiques contiennent à la fois des composants électriques et magnétiques. Les champs électrique et magnétique oscillent perpendiculairement à la direction de propagation des ondes. Dans le cas de la lumière non polarisée, ces champs oscillent dans de nombreuses directions. Lorsque la lumière est polarisée circulairement, deux champs électromagnétiques sont obtenus à une différence de phase de 90° l’un par rapport à l’autre. Les molécules chirales présentent une rotation optique circulaire (biréfringence) telle qu’elles absorbent la lumière polarisée circulairement droite et la lumière polarisée circulairement gaucher à des degrés différents3. Le champ électrique résultant sera tracé comme une ellipse, une fonction de la longueur d’onde. Le spectre CD est donc enregistré comme ellipticité (q), et les données sont présentées comme ellipticité résiduelle moyenne en fonction de la longueur d’onde.
Dans le cas des protéines, le Cα des acides aminés (à l’exception de la glycine) est chiral, et ceci est exploité par spectroscopie CD pour déterminer la structure secondaire de cette macromolécule4. Les spectres CD des molécules de protéines sont généralement enregistrés dans la gamme Far UV. α-hélicoïdales ont deux bandes négatives à 222 nm et 208 nm et un pic positif à 193 nm4. Les protéines à structure secondaire anti-parallèle β feuille montrent un pic négatif à 218 nm et un pic positif à 195 nm4. Les protéines aux structures désordonnées présentent une faible ellipticité proche de 210 nm et un pic négatif à 195 nm4. Ainsi, les pics/bandes bien définis pour différentes structures secondaires font de la CD un outil pratique pour élucider les changements conformationnels qui se produisent dans la structure secondaire des protéines pendant la dénaturation ainsi que la liaison aux ligands.
Les acides nucléiques ont trois sources de chiralité : la molécule de sucre, l’hélicité de la structure secondaire et l’ordre tertiaire à longue distance de l’ADN dans l’environnement5,6. Les spectres CD des acides nucléiques sont généralement enregistrés dans la gamme de 190 à 300 nm5,6. Chaque conformation de l’ADN, tout comme les protéines, donne un spectre caractéristique, bien que les pics/bandes puissent varier de certains degrés en raison des conditions de solvant et des différences dans les séquences d’ADN7. L’ADN-B, la forme la plus courante, se caractérise par un pic positif autour de 260-280 nm et un pic négatif autour de 245 nm6. Les pics/bandes de l’ADN de forme B sont généralement petits parce que les paires de bases sont perpendiculaires à la double hélice, conférant une faible chiralité à la molécule. L’ADN-A donne un pic positif dominant à 260 nm et un pic négatif autour de 210 nm6. L’ADN-Z, l’hélice gaucher, donne une bande négative à 290 nm et un pic positif autour de 260 nm6. Cet ADN donne également un pic extrêmement négatif à 205 nm6.
En plus de ces conformations, l’ADN peut également former des triplex, des quadruplexes et des épingles à cheveux, qui peuvent tous être distingués par spectroscopie CD. Le G-quadruplex parallèle donne une bande positive dominante à 260 nm, tandis que le G-quadruplex anti-parallèle donne une bande négative à 260 nm et un pic positif à 290 nm, ce qui facilite la distinction entre les deux formes de structures quadruplex6. Les triplex ne donnent pas de spectre caractéristique8. Par exemple, les spectres d’un ADN de 36 nucléotides ayant le potentiel de former une triple hélice intramoléculaire contenant des paires de bases G.G.C et T.A.T en présence de Na+ montrent une forte bande négative à 240 nm et un large pic positif. Le pic positif général montre des contributions à 266, 273 et 286 nm. Le même oligonucléotide en présence de Na+ et Zn+ montre quatre bandes négatives (213, 238, 266 et 282 nm) et un pic positif à 258 nm. Ainsi, les spectres de l’ADN triplex peuvent varier en fonction des conditions de sel8.
En plus de ces conformations, les spectres CD ont permis l’identification d’une autre forme d’ADN appelée X-ADN. L’ADN-X se forme lorsque la séquence d’ADN contient des résidus alternatifs d’adénine et de thymine. Les spectres CD de l’ADN-X contiennent deux pics négatifs à 250 et 280 nm. Très peu d’informations sont disponibles sur l’ADN-X, bien qu’il ait été spéculé pour fonctionner comme un puits pour le superenroulage positif6,9. Les changements dans les spectres DE LA MC peuvent également révéler des détails sur les interactions ligand-protéine et, par conséquent, ont été ajoutés à l’arsenal des méthodes moléculaires pour détecter les interactions médicament-protéine10,11,12,13,14. Les spectres CD ont également été utilisés pour surveiller les changements dans la structure secondaire des protéines pendant le processus de repliement15. De même, les spectres CD peuvent également être utilisés pour sonder les interactions ligand-ADN16,17.
La spectroscopie CD est donc une méthode facile et peu coûteuse pour distinguer les différentes formes de conformation de l’ADN, à condition qu’il y ait accès à des équipements et des logiciels moins coûteux. La méthode est extrêmement sensible et rapide. Il ne nécessite qu’une petite quantité d’ADN, ce qui lui donne un avantage sur la technique alternative de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Les titrages avec des ligands et des substrats sont également faciles à effectuer. La contrainte majeure est que l’ADN doit être très pur. Il est conseillé d’utiliser de l’ADN purifié par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE).
Les informations obtenues par les spectres CD ont été principalement utilisées pour déduire les caractéristiques structurelles des protéines et pour identifier des conformateurs d’ADN distincts. Dans cette étude, les spectres CD ont été utilisés pour intégrer les résultats obtenus d’une expérience in vivo d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) afin de déterminer si la protéine d’intérêt / facteur de transcription prédit peut entraîner un changement conformationnel dans la région promotrice de ses gènes effecteurs. Cette collaboration contribue à la progression des techniques spectroscopiques CD traditionnelles en prédisant le mécanisme de régulation de la transcription par le facteur de transcription prédit sur et autour du site de début de transcription (SCT) d’un promoteur.
Le remodelage de la chromatine est un mécanisme bien défini connu pour réguler les processus métaboliques de l’ADN en rendant la chromatine étroitement emballée accessible à divers facteurs régulateurs tels que les facteurs de transcription, les composants de la réplication de l’ADN ou les protéines de réparation des dommages. Les remodeleurs de chromatine dépendants de l’ATP, également connus sous le nom de famille de protéines SWI/SNF, sont des protéines remodelantes clés présentes dans les cellules eucaryotes18,19. Le regroupement phylogénétique a classé la famille de protéines SWI/SNF en 6 sous-groupes20 : Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, et distant. SMARCAL1, la protéine d’intérêt dans cette étude, appartient au sous-groupe distant20. Cette protéine a été utilisée pour étudier son mode de régulation transcriptionnelle à l’aide de la spectroscopie CD.
Il a été démontré que la plupart des membres des protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP se repositionnent ou éliminent les nucléosomes ou interviennent dans l’échange de variantes d’histones d’une manière dépendante de l’ATP21,22. Cependant, il n’a pas été démontré que certains membres de cette famille remodelent les nucléosomes, par exemple SMARCAL1. Même si des études ont montré que SMARCAL1 s’associe aux chromosomes polytènes, les preuves expérimentales concernant sa capacité à remodeler les nucléosomes font défaut23. Par conséquent, il a été postulé que SMARCAL1 peut réguler la transcription en modifiant la conformation de l’ADN24. La spectroscopie CD a fourni une méthode facile et accessible pour valider cette hypothèse.
SMARCAL1 est une protéine de remodelage de la chromatine dépendante de l’ATP qui fonctionne principalement comme une hélicase de recuit25,26,27. Il a été postulé pour moduler la transcription en remodelant la conformation de l’ADN24. Pour tester cette hypothèse, le rôle de SMARCAL1 dans la régulation de la transcription des gènes lors des dommages à l’ADN induits par la doxorubicine a été étudié. Dans ces études, SMARCAL1 a été utilisé pour l’analyse in vivo et ADAAD pour les essais in vitro28,29. Des études antérieures ont montré que l’ADAAD peut reconnaître l’ADN d’une manière dépendante de la structure mais indépendante de la séquence30,31. La protéine se lie de manière optimale aux molécules d’ADN possédant des régions de transition double brin à simple brin, similaires à l’ADN de boucle tige, et hydrolyse l’ATP 30,31.
Des expériences in vivo ont montré que SMARCAL1 régule l’expression de MYC, DROSHA, DGCR8 et DICER en se liant aux régions promotrices28,29. La région d’interaction a été identifiée par les expériences ChIP28,29. La technique ChIP est utilisée pour analyser l’interaction d’une protéine avec son ADN apparenté dans la cellule. Son objectif est de déterminer si des protéines spécifiques, telles que des facteurs de transcription sur des promoteurs ou d’autres sites de liaison à l’ADN, sont liées à des domaines génomiques spécifiques. La protéine liée à l’ADN est d’abord réticulée à l’aide de formaldéhyde. Ceci est suivi par l’isolement de la chromatine. La chromatine isolée est cisaillée en fragments de 500 pb soit par sonication, soit par digestion nucléase, et la protéine liée à l’ADN est immunoprécipitée à l’aide d’anticorps spécifiques à la protéine. La réticulation est inversée et l’ADN est analysé à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou d’une PCR quantitative en temps réel.
Les résultats du ChIP ont conduit à l’hypothèse que SMARCAL1 intervient peut-être dans la régulation transcriptionnelle en induisant un changement conformationnel dans les régions promotrices de ces gènes. Le cartographe QGRS et le logiciel Mfold ont été utilisés pour identifier le potentiel de ces régions promotrices à former des structures secondaires28,29. Le mappeur QGRS est utilisé pour prédire les G-quadruplex32, tandis que Mfold33 analyse la capacité d’une séquence à former des structures secondaires telles que des boucles de tige.
Après l’analyse de la structure secondaire, d’autres expériences in vitro ont été réalisées avec l’ATPase A A (ADAAD) recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain, l’homologue bovin de SMARCAL1, purifié à partir d’Escherichia coli34. Des tests ATPase ont été effectués à l’aide de l’ADAAD pour établir que les séquences d’ADN identifiées pouvaient agir comme effecteurs28,29. Enfin, la spectroscopie CD a été réalisée pour surveiller les changements conformationnels induits dans la molécule d’ADN par ADAAD28,29.
Pour prouver que l’activité ATPase de la protéine était essentielle pour induire un changement conformationnel dans la molécule d’ADN, soit de l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) a été ajouté au chélate Mg+2, soit de la néomycine inhibiteur du domaine de l’ATPase A dépendante de l’ADN actif (ADAADiN), un inhibiteur spécifique de la protéine SWI/SNF, a été ajoutée35,36 . Cette technique spectroscopique CD peut être utilisée avec n’importe quelle protéine purifiée qui a été démontrée par ChIP ou tout autre test pertinent pour se lier à une région génomique prédite d’un promoteur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) est une méthode simple et pratique pour étudier la structure secondaire et les interactions des biomolécules. Les progrès récents de la spectroscopie CD ont permis d’étudier en détail les interactions ADN-protéine et la dynamique conformationnelle de l’ADN dans différents microenvironnements pour une meilleure compréhension de la régulation transcriptionnelle in vivo. La zone autour d’une zone de transcription potentielle doit être déroulée pour que la transcription se produise. Il s’agit d’un processus complexe nécessitant la coordination des modifications des histones, la liaison du facteur de transcription à l’ADN et d’autres activités de remodelage de la chromatine. En utilisant la spectroscopie CD, il est possible d’étudier les changements conformationnels dans la région promotrice causés par les protéines régulatrices, telles que les remodeleurs de chromatine dépendants de l’ATP, pour favoriser la transcription. Les changements conformationnels qui se produisent dans la protéine peuvent également être surveillés. En outre, les questions concernant l’affinité de la protéine pour son ADN cible et la spécificité de la séquence peuvent être traitées en incorporant des mutations dans l’ADN cible. En bref, la compréhension unique de cette méthode sensible et peu coûteuse peut prédire les changements dans la dynamique de la chromatine, améliorant ainsi la compréhension de la régulation transcriptionnelle.

ADAAD stabilise une structure en forme de boucle de tige sur le promoteur MYC Des preuves expérimentales antérieures ont montré que SMARCAL1 est un régulateur négatif de MYC29. L’analyse de la région promotrice de 159 pb de long du gène MYC par le cartographe QGRS a montré que le brin avant avait le potentiel de former un G-quadruplex (tableau 2). Mfold a montré que les deux brins de l’A...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Le protocole nous permet de visualiser les changements dans la deuxième restructuration de l’ADN induits par les protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. Le changement dans la structure de l’ADN peut être corrélé à la régulation de la transcription. Il s’agit d’une technique facile et très sensible qui utilise une très petite quantité d’ADN pur pour enregistrer les changements structurels dans l’oligonucléotide.Cette méthode peut fournir un aperçu de la régulation de la transcription médiée par les protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. Pour commencer, préparez les concentrations de travail des tampons et autres composants de réaction fraîchement et maintenez-les à quatre degrés Celsius avant de mettre en place les réactions, puis mesurez l’activité ATPase de la protéine en présence de différentes molécules d’ADN à l’aide d’un test d’oxydation couplé au NADH. Mélanger 0,1 millimolaire ADAAD, deux millimolaires ATP, 10 nanomolaires ADN et 1X tampon REG dans une plaque de 96 puits pour un volume final de 250 microlitres.Ensuite, incubez la réaction pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius, puis mesurez la quantité de NAD + à l’aide du logiciel fourni avec le lecteur de microplaques. Pour mesurer l’absorbance à 340 nanomètres, cliquez sur le test NADH et placez la plaque de 96 puits sur le support de plaque dans l’instrument, puis cliquez sur le bouton de la plaque de lecture pour enregistrer l’absorbance. Collectez les spectres de CD dans des cuvettes de quartz à haute transparence.Utilisez des cuvettes rectangulaires ou cylindriques. Pour nettoyer les cuvettes, lavez-les à l’eau plusieurs fois, puis faites un scan de l’eau ou du tampon dans la cuvette pour vérifier si elle est propre. Pour les réactions, utilisez des oligonucléotides d’ADN purifiés page.Pour un refroidissement rapide, chauffez l’ADN à 94 degrés Celsius pendant trois minutes sur le bloc chauffant et refroidissez-le immédiatement sur de la glace. Pour un refroidissement lent, après avoir chauffé l’ADN à 94 degrés Celsius pendant trois minutes, laissez-le refroidir à la température ambiante à un taux d’un degré Celsius par minute. Pour enregistrer les spectres de base, mettez en place un total de cinq réactions de contrôle une par une dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre.Maintenir le volume de réaction à 300 microlitres dans toutes les réactions. Pour enregistrer les spectres CD, mettez en place un total de cinq réactions expérimentales une par une dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre. Pour enregistrer le scan, allumez le gaz et allumez le spectromètre CD.Après 10 à 15 minutes, allumez la lampe, allumez le bain-marie et réglez la température du support à 37 degrés Celsius. Ensuite, ouvrez le logiciel de spectre CD et réglez la température à 37 degrés Celsius, la plage de longueurs d’onde de 180 à 300 nanomètres, le temps par point à 0,5 seconde et le nombre de numérisation à cinq, puis cliquez sur la visionneuse de données pro, créez un nouveau fichier et renommez-le avec les détails de l’expérience et la date. Ensuite, mélangez les réactions de base et expérimentales par pipetage et transférez soigneusement les mélanges réactionnels un par un à la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.Si vous effectuez une expérience de cours temporel, incubez les réactions à 37 degrés Celsius pendant le temps requis, puis prenez le scan. Ajoutez de l’EDTA au tampon contenant l’ADN, l’ATP, le magnésium et les protéines pour arrêter l’hydrolyse de l’ATP. Pour inhiber complètement l’activité de l’ATPase, augmentez la concentration d’EDTA et le temps d’incubation.Soustrayez les lignes de base des réactions correspondantes dans le logiciel et lissez les données soit dans le logiciel de spectre CD, soit dans le logiciel de traçage de données, puis tracez un graphique de longueur d’onde par rapport à l’ellipticité moyenne des résidus et analysez les pics. Les plis M ont montré que les deux brins de l’ADN MYC pouvaient former une structure en forme de boucle de tige. Les structures du pli M de la séquence d’ADN avant et arrière contenant le G quadruplex GECE sont montrées ici.Les spectres CD du GECE à refroidissement rapide en l’absence et en présence d’ATP et d’ADAAD ont montré que l’ADAAD induit deux pics positifs, l’un à 258 nanomètres et l’autre à 210 nanomètres. L’ajout d’EDTA abroge ce changement conformationnel. Les spectres CD ont maintenant un pic négatif de 210 nanomètres et une large bande positive avec des pics à 230 et 250 nanomètres.L’analyse du mappeur QGRS et du M-fold a montré que les régions promotrices de DROSHA, DGCR8 et DICER possèdent le potentiel de former des structures G quadruplex et de type tige. Les spectres CD de la paire DROSHA cinq ont montré que l’ADAAD induit un pic négatif à 210 nanomètres et un pic positif à 260 nanomètres. Ce spectre est une caractéristique de l’ADNA.Les spectres CD de la première paire DGCR8 ont montré un pic positif à 210 nanomètres et un large pic négatif à 260 nanomètres. Ce spectre est caractéristique de la transition B vers X. Pour la paire DGCR8 sept, de forts pics positifs à 210 et 270 nanomètres et un pic négatif à 250 nanomètres ont été observés.Ce spectre est caractéristique des structures parallèles de l’ADN G quadruplex. Enfin, pour la paire DICER un, un pic positif à 210 nanomètres et deux pics négatifs, l’un à 230 nanomètres et l’autre à 260 nanomètres ont été observés. Ces pics sont caractéristiques d’une transition de l’ADN de A à X.Assurez-vous que la pureté de l’ADN et des protéines est de 99% ou plus. La cuvette doit être propre et la ligne de base doit être inférieure à un millidegree. Tous les réactifs doivent être purs de sorte que l’arrière-plan soit inférieur à un millidegree.

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