Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Die Autoren danken der Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, für das CD-Spektralphotometer. V.J. und A.D. wurden durch ein Stipendium von CSIR unterstützt.

1. Arbeitskonzentration der Reaktionskomponenten
<ol><li>Die Arbeitskonzentrationen von Puffern für CD und andere Reaktionskomponenten frisch vorbereiten (siehe Tabelle 1) und bei 4 °C halten, bevor die Reaktionen aufgebaut werden. ANMERKUNG: Für die in dieser Arbeit beschriebenen CD-Reaktionen sind die Arbeitskonzentrationen der Komponenten wie folgt: Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>...

Der Zweck dieses Artikels ist es, die CD-Spektroskopie-Technik als einen Ansatz zur Untersuchung der Konformationsänderungen in der DNA in Gegenwart von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteinen einzuführen und diese Konformationsänderungen mit der Genexpression zu verknüpfen. Die CD-Spektroskopie bietet eine schnelle und leicht zugängliche Methode, um die Konformationsänderungen in der DNA zu untersuchen.

Ein entscheidender Punkt, der bei dieser Technik zu berücksichtigen ...

Zirkulardichroismus (CD) ist eine spektroskopische Technik, die auf der inhärenten Chiralität biologischer Makromoleküle beruht, die zu einer differentiellen Absorption von rechts- und linkshändig zirkular polarisiertem Licht führt. Diese differentielle Absorption wird als zirkulärer Dichroismus bezeichnet. Die Technik kann daher verwendet werden, um die Konformation von biologischen Makromolekülen wie Proteinen und DNA abzugrenzen, die beide chirale Zentren enthalten1,2.
Elektromagnetische Wellen enthalten sowohl elektrische als auch magnetische Komponenten. Sowohl das elektrische als auch das magnetische Feld schwingen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Welle. Bei unpolarisiertem Licht schwingen diese Felder in viele Richtungen. Wenn das Licht zirkular polarisiert ist, werden zwei elektromagnetische Felder bei 90° Phasendifferenz zueinander erhalten. Chirale Moleküle zeigen eine kreisförmige optische Rotation (Doppelbrechung), so dass sie das rechtshändig zirkular polarisierte Licht und das linkshändige zirkular polarisierte Licht in unterschiedlichem Maße absorbieren3. Das resultierende elektrische Feld wird als Ellipse, eine Funktion der Wellenlänge, nachgezeichnet. Das CD-Spektrum wird somit als Elliptizität (q) aufgezeichnet, und die Daten werden als mittlere Rückstandsellipizität als Funktion der Wellenlänge dargestellt.
Im Falle von Proteinen ist das Cα von Aminosäuren (außer Glycin) chiral, und dies wird von der CD-Spektroskopie ausgenutzt, um die Sekundärstruktur dieses Makromoleküls zu bestimmen4. Die CD-Spektren von Proteinmolekülen werden typischerweise im Fernen UV-Bereich aufgezeichnet. α-helikale Proteine haben zwei negative Banden bei 222 nm und 208 nm und einen positiven Peak bei 193 nm4. Proteine mit antiparalleler β-Sheet-Sekundärstruktur zeigen einen negativen Peak bei 218 nm und einen positiven Peak bei 195 nm4. Proteine mit ungeordneten Strukturen zeigen eine geringe Elliptik in der Nähe von 210 nm und einen negativen Peak bei 195 nm4. So machen die wohldefinierten Peak/Banden für verschiedene Sekundärstrukturen CD zu einem bequemen Werkzeug, um die Konformationsänderungen in der Sekundärstruktur der Proteine während der Denaturierung sowie der Ligandenbindung aufzuklären.
Nukleinsäuren haben drei Quellen der Chiralität: das Zuckermolekül, die Helizität der Sekundärstruktur und die langreichweitige tertiäre Ordnung der DNA in der Umwelt5,6. Die CD-Spektren von Nukleinsäuren werden typischerweise im Bereich von 190 bis 300 nm aufgezeichnet5,6. Jede Konformation der DNA, genau wie Proteine, ergibt ein charakteristisches Spektrum, obwohl die Peaks / Banden aufgrund von Lösungsmittelbedingungen und Unterschieden in den DNA-Sequenzen um einige Grade variieren können7. B-DNA, die häufigste Form, ist durch einen positiven Peak um 260-280 nm und einen negativen Peak um 245 nm6 gekennzeichnet. Die Peaks / Banden der B-Form-DNA sind im Allgemeinen klein, da die Basenpaare senkrecht zur Doppelhelix stehen, was dem Molekül eine schwache Chiralität verleiht. A-DNA ergibt einen dominanten positiven Peak bei 260 nm und einen negativen Peak um 210 nm6. Z-DNA, die linkshändige Helix, ergibt ein negatives Band bei 290 nm und einen positiven Peak um 260 nm6. Diese DNA ergibt auch einen extrem negativen Peak bei 205 nm6.
Zusätzlich zu diesen Konformationen kann DNA auch Triplexe, Quadruplexe und Haarnadelkurven bilden, die alle durch CD-Spektroskopie unterschieden werden können. Der parallele G-Quadruplex ergibt ein dominantes positives Band bei 260 nm, während der antiparallele G-Quadruplex ein negatives Band bei 260 nm und einen positiven Peak bei 290 nm ergibt, was es leicht macht, zwischen den beiden Formen von Quadruplexstrukturen zu unterscheiden6. Triplexe ergeben kein charakteristisches Spektrum8. Zum Beispiel zeigen die Spektren einer 36 Nukleotid-langen DNA mit dem Potenzial, eine intramolekulare Dreifachhelix zu bilden, die G.G.C und T.A.T-Basenpaare in Gegenwart von Na + enthält, eine starke negative Bande bei 240 nm und einen breiten positiven Peak. Der breite positive Peak zeigt Beiträge bei 266, 273 und 286 nm. Das gleiche Oligonukleotid in Gegenwart von Na+ und Zn+ zeigt vier negative Banden (213, 238, 266 und 282 nm) und einen positiven Peak bei 258 nm. Daher können die Spektren der Triplex-DNA je nach Salzbedingungen variieren8.
Zusätzlich zu diesen Konformationen haben CD-Spektren die Identifizierung einer anderen Form von DNA namens X-DNA ermöglicht. X-DNA entsteht, wenn die DNA-Sequenz alternative Adenin- und Thyminreste enthält. Die CD-Spektren der X-DNA enthalten zwei negative Peaks bei 250 und 280 nm. Über X-DNA liegen nur sehr wenige Informationen vor, obwohl spekuliert wurde, dass sie als Senke für positive Supercoiling fungiert6,9. Veränderungen in CD-Spektren können auch Details über Liganden-Protein-Wechselwirkungen offenbaren und wurden daher dem Arsenal molekularer Methoden zum Nachweis von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen hinzugefügt10,11,12,13,14. CD-Spektren wurden auch verwendet, um die Veränderungen in der Sekundärstruktur von Proteinen während des Faltungsprozesses zu überwachen15. In ähnlicher Weise können CD-Spektren auch zur Untersuchung von Liganden-DNA-Interaktionen verwendet werden16,17.
Die CD-Spektroskopie ist daher eine einfache, kostengünstige Methode, um zwischen den verschiedenen Formen der DNA-Konformation zu unterscheiden, vorausgesetzt, es besteht Zugang zu nicht so kostengünstigen Geräten und Software. Die Methode ist äußerst empfindlich und schnell. Es benötigt nur eine kleine Menge an DNA, was ihm einen Vorteil gegenüber der alternativen Technik der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verschafft. Titrationen mit Liganden und Substraten sind ebenfalls einfach durchzuführen. Die Haupteinschränkung ist, dass die DNA hochrein sein sollte. Es ist ratsam, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigte DNA zu verwenden.
Die durch CD-Spektren gewonnenen Informationen wurden hauptsächlich verwendet, um Proteinstrukturmerkmale abzuleiten und verschiedene DNA-Konformere zu identifizieren. In dieser Studie wurden CD-Spektren verwendet, um die Ergebnisse eines In-vivo-Experiments zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu integrieren, um zu beschreiben, ob das interessierende Protein / der vorhergesagte Transkriptionsfaktor eine Konformationsänderung in der Promotorregion seiner Effektorgene bewirken kann. Diese Zusammenarbeit unterstützt den Fortschritt traditioneller CD-spektroskopischer Techniken, indem sie den Mechanismus der Transkriptionsregulation durch den vorhergesagten Transkriptionsfaktor auf und um die Transkriptionsstartstelle (TSS) eines Promotors vorhersagt.
Chromatin-Remodeling ist ein klar definierter Mechanismus, der dafür bekannt ist, DNA-Stoffwechselprozesse zu regulieren, indem er das dicht gepackte Chromatin für verschiedene regulatorische Faktoren wie Transkriptionsfaktoren, Komponenten der DNA-Replikation oder Schadensreparaturproteine zugänglich macht. Die ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler, auch bekannt als die SWI/SNF-Familie von Proteinen, sind wichtige Remodeler-Proteine, die in eukaryotischen Zellen vorkommen18,19. Die phylogenetische Clusterbildung hat die SWI/SNF-Familie von Proteinen in 6 Untergruppen eingeteilt20: Snf2-ähnlich, Swr1-ähnlich, SSO1653-ähnlich, Rad54-ähnlich, Rad5/16-ähnlich und entfernt. SMARCAL1, das protein von Interesse in dieser Studie, gehört zur entfernten Untergruppe20. Dieses Protein wurde verwendet, um seine Art der transkriptionellen Regulation mittels CD-Spektroskopie zu untersuchen.
Es wurde gezeigt, dass die meisten Mitglieder der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteine entweder Nukleosomen neu positionieren oder vertreiben oder den Austausch von Histonvarianten atP-abhängig vermitteln21,22. Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass einige Mitglieder dieser Familie Nukleosomen umgestalten, z. B. SMARCAL1. Obwohl Studien gezeigt haben, dass SMARCAL1 mit Polyten-Chromosomen assoziiert ist, fehlen experimentelle Beweise für seine Fähigkeit, Nukleosomen umzugestalten23. Daher wurde postuliert, dass SMARCAL1 die Transkription regulieren kann, indem es die Konformation von DNA24 verändert. Die CD-Spektroskopie lieferte eine einfache und zugängliche Methode, um diese Hypothese zu validieren.
SMARCAL1 ist ein ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling-Protein, das in erster Linie als glühende Helikase fungiert25,26,27. Es wurde postuliert, die Transkription durch Umgestaltung der DNA-Konformation zu modulieren24. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Rolle von SMARCAL1 bei der Regulierung der Gentranskription während Doxorubicin-induzierter DNA-Schäden untersucht. In diesen Studien wurde SMARCAL1 für die In-vivo-Analyse und ADAAD für In-vitro-Assays verwendet28,29. Frühere Studien haben gezeigt, dass ADAAD DNA strukturabhängig, aber sequenzunabhängig erkennen kann30,31. Das Protein bindet optimal an DNA-Moleküle, die Doppelstrang-zu-Einzelstrang-Übergangsregionen besitzen, ähnlich der Stammschleifen-DNA, und hydrolysiert ATP 30,31.
In-vivo-Experimente zeigten, dass SMARCAL1 die Expression von MYC, DROSHA, DGCR8 und DICER reguliert, indem es an die Promotorregionen bindet28,29. Die Region der Interaktion wurde durch ChIP-Experimente identifiziert28,29. Die ChIP-Technik wird verwendet, um die Interaktion eines Proteins mit seiner verwandten DNA innerhalb der Zelle zu analysieren. Ziel ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine, wie Transkriptionsfaktoren auf Promotoren oder anderen DNA-Bindungsstellen, an bestimmte genomische Bereiche gebunden sind. Das an die DNA gebundene Protein wird zunächst mit Formaldehyd vernetzt. Es folgt die Isolierung des Chromatins. Das isolierte Chromatin wird entweder durch Beschallung oder Nukleaseverdauung auf 500 bp-Fragmente geschert, und das an dna gebundene Protein wird mit proteinspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Vernetzung wird umgekehrt und die DNA wird entweder mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder quantitativer Real-Time-PCR analysiert.
Die ChIP-Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass SMARCAL1 möglicherweise eine transkriptionelle Regulation vermittelt, indem es eine Konformationsänderung in den Promotorregionen dieser Gene induziert. QGRS-Mapper und Mfold-Software wurden verwendet, um das Potenzial dieser Projektträgerregionen zur Bildung sekundärer Strukturen zu ermitteln28,29. QGRS Mapper wird zur Vorhersage von G-Quadruplexen32 verwendet, während Mfold33 die Fähigkeit einer Sequenz analysiert, sekundäre Strukturen wie Stammschleifen zu bilden.
Nach der Sekundärstrukturanalyse wurden weitere In-vitro-Experimente mit rekombinanter 6X His-tagged Active DNA-abhängiger ATPase A Domain (ADAAD), dem Rinderhomolog von SMARCAL1, gereinigt aus Escherichia coli34, durchgeführt. ATPase-Assays wurden unter Verwendung von ADAAD durchgeführt, um festzustellen, dass die identifizierten DNA-Sequenzen als Effektoren wirken könnten28,29. Schließlich wurde cd-Spektroskopie durchgeführt, um die durch ADAAD28,29 induzierten Konformationsänderungen im DNA-Molekül zu überwachen.
Um nachzuweisen, dass die ATPase-Aktivität des Proteins für die Induktion einer Konformationsänderung im DNA-Molekül essentiell war, wurde entweder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu Mg+2 oder Aktiver DNA-abhängiger ATPase-A-Domäneninhibitor Neomycin (ADAADiN), ein spezifischer Inhibitor des SWI/SNF-Proteins, hinzugefügt35,36 . Diese CD-spektroskopische Technik kann mit jedem gereinigten Protein verwendet werden, das durch ChIP oder einen anderen relevanten Assay nachgewiesen wurde, um an eine vorhergesagte genomische Region eines Promotors zu binden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Die zirkuläre Dichroismusspektroskopie (CD) ist eine einfache und bequeme Methode, um die Sekundärstruktur und Wechselwirkungen von Biomolekülen zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der CD-Spektroskopie haben es ermöglicht, DNA-Protein-Interaktionen und die Konformationsdynamik von DNA in verschiedenen Mikroumgebungen im Detail zu untersuchen, um die Transkriptionsregulation in vivo besser zu verstehen. Der Bereich um eine potenzielle Transkriptionszone muss abgewickelt werden, damit eine Transkription stattfinden kann. Dies ist ein komplexer Prozess, der die Koordination von Histonmodifikationen, die Bindung des Transkriptionsfaktors an DNA und andere Chromatin-Remodeling-Aktivitäten erfordert. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie ist es möglich, Konformationsänderungen in der Promotorregion zu untersuchen, die durch regulatorische Proteine wie ATP-abhängige Chromatin-Remodeler verursacht werden, um die Transkription zu fördern. Die im Protein auftretenden Konformationsänderungen können ebenfalls überwacht werden. Darüber hinaus können Fragen zur Affinität des Proteins zu seiner Ziel-DNA und sequenziellen Spezifität durch die Integration von Mutationen in die Ziel-DNA beantwortet werden. Kurz gesagt, das einzigartige Verständnis dieser empfindlichen und kostengünstigen Methode kann Änderungen der Chromatindynamik vorhersagen und dadurch das Verständnis der transkriptionellen Regulation verbessern.

ADAAD stabilisiert eine stammschleifenartige Struktur auf dem MYC-Promotor Frühere experimentelle Beweise zeigten, dass SMARCAL1 ein negativer Regulator von MYC29 ist. Die Analyse der 159 bp langen Promotorregion des MYC-Gens durch den QGRS-Mapper zeigte, dass der vordere Strang das Potenzial hatte, einen G-Quadruplex zu bilden (Tabelle 2). Mfold zeigte, dass beide Stränge der MYC-DNA eine...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Das Protokoll ermöglicht es uns, die Veränderungen in der zweiten Umstrukturierung der DNA zu visualisieren, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine induziert wird. Die Veränderung der DNA-Struktur kann mit der Transkriptionsregulation korreliert werden. Dies ist eine einfache und hochempfindliche Technik, die eine sehr kleine Menge reiner DNA verwendet, um die strukturellen Veränderungen im Oligonukleotid aufzuzeichnen.Diese Methode kann Einblicke in die Transkriptionsregulation geben, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine vermittelt wird. Bereiten Sie zunächst die Arbeitskonzentrationen von Puffern und anderen Reaktionskomponenten frisch vor und halten Sie sie bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Reaktionen einrichten, und messen Sie dann die ATPase-Aktivität des Proteins in Gegenwart verschiedener DNA-Moleküle mit einem NADH-gekoppelten Oxidationsassay. Mischen Sie 0,1 Millimolar ADAAD, zwei Millimolar ATP, 10 Nanomolar DNA und 1X REG Puffer in einer 96-Well-Platte zu einem Endvolumen von 250 Mikrolitern.Als nächstes inkubieren Sie die Reaktion für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und messen Dann die Menge an NAD + mit der mitgelieferten Software zusammen mit dem Mikroplattenleser. Um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen, klicken Sie auf den NADH-Assay und legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter im Instrument, dann klicken Sie auf die Taste zum Lesen der Platte, um die Absorption aufzuzeichnen. Sammeln Sie die CD-Spektren in hochtransparenten Quarzküvetten.Verwenden Sie entweder rechteckige oder zylindrische Küvetten. Um die Küvetten zu reinigen, waschen Sie sie mehrmals mit Wasser und scannen Sie dann das Wasser oder den Puffer in der Küvette, um zu überprüfen, ob sie sauber ist. Verwenden Sie für die Reaktionen PAGE-gereinigte DNA-Oligonukleotide.Für eine schnelle Abkühlung die DNA drei Minuten lang auf dem Heizblock bei 94 Grad Celsius erhitzen und sofort auf Eis abkühlen lassen. Für eine langsame Abkühlung, nachdem Sie die DNA drei Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzt haben, lassen Sie sie mit einer Rate von einem Grad Celsius pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen. Um die Baseline-Spektren zu erfassen, stellen Sie insgesamt fünf Kontrollreaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen ein.Halten Sie das Reaktionsvolumen bei allen Reaktionen bei 300 Mikrolitern. Um die CD-Spektren aufzuzeichnen, stellen Sie insgesamt fünf experimentelle Reaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf. Um den Scan aufzuzeichnen, schalten Sie das Gas ein und schalten Sie das CD-Spektrometer ein.Nach 10 bis 15 Minuten schalten Sie die Lampe ein, schalten das Wasserbad ein und stellen die Haltertemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Öffnen Sie als Nächstes die CD-Spektrum-Software und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, den Wellenlängenbereich auf 180 bis 300 Nanometer, die Zeit pro Punkt auf 0,5 Sekunden und die Scannummer auf fünf, klicken Sie dann auf den Pro-Datenbetrachter, erstellen Sie eine neue Datei und benennen Sie sie mit den Details des Experiments und dem Datum um. Als nächstes mischen Sie die Basis- und experimentellen Reaktionen durch Pipettieren und übertragen Sie die Reaktionsmischungen vorsichtig nacheinander auf die Küvette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Zeit und machen Sie dann den Scan. Fügen Sie EDTA zu dem Puffer hinzu, der die DNA, ATP, Magnesium und Protein enthält, um die ATP-Hydrolyse zu stoppen. Um die ATPase-Aktivität vollständig zu hemmen, erhöhen Sie die EDTA-Konzentration und die Inkubationszeit.Subtrahieren Sie die Baselines von den entsprechenden Reaktionen in der Software und glätten Sie die Daten entweder in der CD-Spektrum-Software oder in der Datendiagrammsoftware, zeichnen Sie dann einen Graphen der Wellenlänge gegen die mittlere Rückstandselliptik und analysieren Sie die Peaks. M-Falten zeigten, dass beide Stränge der MYC-DNA eine stammschleifenartige Struktur bilden könnten. Die M-faltigen Strukturen der vorderen und der umgekehrten DNA-Sequenz, die den G-Quadruplex GECE enthält, sind hier dargestellt.Die CD-Spektren von schnell gekühltem GECE in Abwesenheit und Anwesenheit von ATP und ADAAD zeigten, dass ADAAD zwei positive Peaks induziert, einen bei 258 Nanometern und den anderen bei 210 Nanometern. Die Zugabe von EDTA hebt diese Konformationsänderung auf. Die CD-Spektren haben nun einen negativen 210-Nanometer-Peak und ein breites positives Band mit Peaks bei 230 und 250 Nanometern.QGRS-Mapper- und M-Faltungsanalysen zeigten, dass die Promotorregionen von DROSHA, DGCR8 und DICER das Potenzial besitzen, G-Quadruplex- und stammartige Strukturen zu bilden. Die CD-Spektren des DROSHA-Paares fünf zeigten, dass ADAAD einen negativen Peak bei 210 Nanometern und einen positiven Peak bei 260 Nanometern induziert. Dieses Spektrum ist ein Merkmal von ADNA.Die CD-Spektren des DGCR8-Paares zeigten einen positiven Peak bei 210 Nanometern und einen breiten negativen Peak bei 260 Nanometern. Dieses Spektrum ist charakteristisch für den Übergang von B nach X. Für das DGCR8-Paar sieben wurden starke positive Peaks bei 210 und 270 Nanometern und ein negativer Peak bei 250 Nanometern beobachtet.Dieses Spektrum ist charakteristisch für parallele G-Quadruplex-DNA-Strukturen. Schließlich wurden für das DICER-Paar eins ein positiver Peak bei 210 Nanometern und zwei negative Peaks, einer bei 230 Nanometern und der andere bei 260 Nanometern, beobachtet. Diese Peaks sind charakteristisch für einen DNA-Übergang von A nach X.Stellen Sie sicher, dass die Reinheit von DNA und Protein 99% oder mehr beträgt. Die Küvette sollte sauber sein und die Grundlinie sollte weniger als einen Milligrad betragen. Alle Reagenzien sollten rein sein, so dass der Hintergrund weniger als ein Milligrad beträgt.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Forschung

Biochemie

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...