Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Die Autoren danken der Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, für das CD-Spektralphotometer. V.J. und A.D. wurden durch ein Stipendium von CSIR unterstützt.

1. Arbeitskonzentration der Reaktionskomponenten
<ol><li>Die Arbeitskonzentrationen von Puffern für CD und andere Reaktionskomponenten frisch vorbereiten (siehe Tabelle 1) und bei 4 °C halten, bevor die Reaktionen aufgebaut werden. ANMERKUNG: Für die in dieser Arbeit beschriebenen CD-Reaktionen sind die Arbeitskonzentrationen der Komponenten wie folgt: Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>...

Der Zweck dieses Artikels ist es, die CD-Spektroskopie-Technik als einen Ansatz zur Untersuchung der Konformationsänderungen in der DNA in Gegenwart von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteinen einzuführen und diese Konformationsänderungen mit der Genexpression zu verknüpfen. Die CD-Spektroskopie bietet eine schnelle und leicht zugängliche Methode, um die Konformationsänderungen in der DNA zu untersuchen.

Ein entscheidender Punkt, der bei dieser Technik zu berücksichtigen ...

Zirkulardichroismus (CD) ist eine spektroskopische Technik, die auf der inhärenten Chiralität biologischer Makromoleküle beruht, die zu einer differentiellen Absorption von rechts- und linkshändig zirkular polarisiertem Licht führt. Diese differentielle Absorption wird als zirkulärer Dichroismus bezeichnet. Die Technik kann daher verwendet werden, um die Konformation von biologischen Makromolekülen wie Proteinen und DNA abzugrenzen, die beide chirale Zentren enthalten1,2.
Elektromagnetische Wellen enthalten sowohl elektrische als auch magnetische Komponenten. Sowohl das elektrische als auch das magnetische Feld schwingen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Welle. Bei unpolarisiertem Licht schwingen diese Felder in viele Richtungen. Wenn das Licht zirkular polarisiert ist, werden zwei elektromagnetische Felder bei 90° Phasendifferenz zueinander erhalten. Chirale Moleküle zeigen eine kreisförmige optische Rotation (Doppelbrechung), so dass sie das rechtshändig zirkular polarisierte Licht und das linkshändige zirkular polarisierte Licht in unterschiedlichem Maße absorbieren3. Das resultierende elektrische Feld wird als Ellipse, eine Funktion der Wellenlänge, nachgezeichnet. Das CD-Spektrum wird somit als Elliptizität (q) aufgezeichnet, und die Daten werden als mittlere Rückstandsellipizität als Funktion der Wellenlänge dargestellt.
Im Falle von Proteinen ist das Cα von Aminosäuren (außer Glycin) chiral, und dies wird von der CD-Spektroskopie ausgenutzt, um die Sekundärstruktur dieses Makromoleküls zu bestimmen4. Die CD-Spektren von Proteinmolekülen werden typischerweise im Fernen UV-Bereich aufgezeichnet. α-helikale Proteine haben zwei negative Banden bei 222 nm und 208 nm und einen positiven Peak bei 193 nm4. Proteine mit antiparalleler β-Sheet-Sekundärstruktur zeigen einen negativen Peak bei 218 nm und einen positiven Peak bei 195 nm4. Proteine mit ungeordneten Strukturen zeigen eine geringe Elliptik in der Nähe von 210 nm und einen negativen Peak bei 195 nm4. So machen die wohldefinierten Peak/Banden für verschiedene Sekundärstrukturen CD zu einem bequemen Werkzeug, um die Konformationsänderungen in der Sekundärstruktur der Proteine während der Denaturierung sowie der Ligandenbindung aufzuklären.
Nukleinsäuren haben drei Quellen der Chiralität: das Zuckermolekül, die Helizität der Sekundärstruktur und die langreichweitige tertiäre Ordnung der DNA in der Umwelt5,6. Die CD-Spektren von Nukleinsäuren werden typischerweise im Bereich von 190 bis 300 nm aufgezeichnet5,6. Jede Konformation der DNA, genau wie Proteine, ergibt ein charakteristisches Spektrum, obwohl die Peaks / Banden aufgrund von Lösungsmittelbedingungen und Unterschieden in den DNA-Sequenzen um einige Grade variieren können7. B-DNA, die häufigste Form, ist durch einen positiven Peak um 260-280 nm und einen negativen Peak um 245 nm6 gekennzeichnet. Die Peaks / Banden der B-Form-DNA sind im Allgemeinen klein, da die Basenpaare senkrecht zur Doppelhelix stehen, was dem Molekül eine schwache Chiralität verleiht. A-DNA ergibt einen dominanten positiven Peak bei 260 nm und einen negativen Peak um 210 nm6. Z-DNA, die linkshändige Helix, ergibt ein negatives Band bei 290 nm und einen positiven Peak um 260 nm6. Diese DNA ergibt auch einen extrem negativen Peak bei 205 nm6.
Zusätzlich zu diesen Konformationen kann DNA auch Triplexe, Quadruplexe und Haarnadelkurven bilden, die alle durch CD-Spektroskopie unterschieden werden können. Der parallele G-Quadruplex ergibt ein dominantes positives Band bei 260 nm, während der antiparallele G-Quadruplex ein negatives Band bei 260 nm und einen positiven Peak bei 290 nm ergibt, was es leicht macht, zwischen den beiden Formen von Quadruplexstrukturen zu unterscheiden6. Triplexe ergeben kein charakteristisches Spektrum8. Zum Beispiel zeigen die Spektren einer 36 Nukleotid-langen DNA mit dem Potenzial, eine intramolekulare Dreifachhelix zu bilden, die G.G.C und T.A.T-Basenpaare in Gegenwart von Na + enthält, eine starke negative Bande bei 240 nm und einen breiten positiven Peak. Der breite positive Peak zeigt Beiträge bei 266, 273 und 286 nm. Das gleiche Oligonukleotid in Gegenwart von Na+ und Zn+ zeigt vier negative Banden (213, 238, 266 und 282 nm) und einen positiven Peak bei 258 nm. Daher können die Spektren der Triplex-DNA je nach Salzbedingungen variieren8.
Zusätzlich zu diesen Konformationen haben CD-Spektren die Identifizierung einer anderen Form von DNA namens X-DNA ermöglicht. X-DNA entsteht, wenn die DNA-Sequenz alternative Adenin- und Thyminreste enthält. Die CD-Spektren der X-DNA enthalten zwei negative Peaks bei 250 und 280 nm. Über X-DNA liegen nur sehr wenige Informationen vor, obwohl spekuliert wurde, dass sie als Senke für positive Supercoiling fungiert6,9. Veränderungen in CD-Spektren können auch Details über Liganden-Protein-Wechselwirkungen offenbaren und wurden daher dem Arsenal molekularer Methoden zum Nachweis von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen hinzugefügt10,11,12,13,14. CD-Spektren wurden auch verwendet, um die Veränderungen in der Sekundärstruktur von Proteinen während des Faltungsprozesses zu überwachen15. In ähnlicher Weise können CD-Spektren auch zur Untersuchung von Liganden-DNA-Interaktionen verwendet werden16,17.
Die CD-Spektroskopie ist daher eine einfache, kostengünstige Methode, um zwischen den verschiedenen Formen der DNA-Konformation zu unterscheiden, vorausgesetzt, es besteht Zugang zu nicht so kostengünstigen Geräten und Software. Die Methode ist äußerst empfindlich und schnell. Es benötigt nur eine kleine Menge an DNA, was ihm einen Vorteil gegenüber der alternativen Technik der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verschafft. Titrationen mit Liganden und Substraten sind ebenfalls einfach durchzuführen. Die Haupteinschränkung ist, dass die DNA hochrein sein sollte. Es ist ratsam, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigte DNA zu verwenden.
Die durch CD-Spektren gewonnenen Informationen wurden hauptsächlich verwendet, um Proteinstrukturmerkmale abzuleiten und verschiedene DNA-Konformere zu identifizieren. In dieser Studie wurden CD-Spektren verwendet, um die Ergebnisse eines In-vivo-Experiments zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu integrieren, um zu beschreiben, ob das interessierende Protein / der vorhergesagte Transkriptionsfaktor eine Konformationsänderung in der Promotorregion seiner Effektorgene bewirken kann. Diese Zusammenarbeit unterstützt den Fortschritt traditioneller CD-spektroskopischer Techniken, indem sie den Mechanismus der Transkriptionsregulation durch den vorhergesagten Transkriptionsfaktor auf und um die Transkriptionsstartstelle (TSS) eines Promotors vorhersagt.
Chromatin-Remodeling ist ein klar definierter Mechanismus, der dafür bekannt ist, DNA-Stoffwechselprozesse zu regulieren, indem er das dicht gepackte Chromatin für verschiedene regulatorische Faktoren wie Transkriptionsfaktoren, Komponenten der DNA-Replikation oder Schadensreparaturproteine zugänglich macht. Die ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler, auch bekannt als die SWI/SNF-Familie von Proteinen, sind wichtige Remodeler-Proteine, die in eukaryotischen Zellen vorkommen18,19. Die phylogenetische Clusterbildung hat die SWI/SNF-Familie von Proteinen in 6 Untergruppen eingeteilt20: Snf2-ähnlich, Swr1-ähnlich, SSO1653-ähnlich, Rad54-ähnlich, Rad5/16-ähnlich und entfernt. SMARCAL1, das protein von Interesse in dieser Studie, gehört zur entfernten Untergruppe20. Dieses Protein wurde verwendet, um seine Art der transkriptionellen Regulation mittels CD-Spektroskopie zu untersuchen.
Es wurde gezeigt, dass die meisten Mitglieder der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteine entweder Nukleosomen neu positionieren oder vertreiben oder den Austausch von Histonvarianten atP-abhängig vermitteln21,22. Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass einige Mitglieder dieser Familie Nukleosomen umgestalten, z. B. SMARCAL1. Obwohl Studien gezeigt haben, dass SMARCAL1 mit Polyten-Chromosomen assoziiert ist, fehlen experimentelle Beweise für seine Fähigkeit, Nukleosomen umzugestalten23. Daher wurde postuliert, dass SMARCAL1 die Transkription regulieren kann, indem es die Konformation von DNA24 verändert. Die CD-Spektroskopie lieferte eine einfache und zugängliche Methode, um diese Hypothese zu validieren.
SMARCAL1 ist ein ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling-Protein, das in erster Linie als glühende Helikase fungiert25,26,27. Es wurde postuliert, die Transkription durch Umgestaltung der DNA-Konformation zu modulieren24. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Rolle von SMARCAL1 bei der Regulierung der Gentranskription während Doxorubicin-induzierter DNA-Schäden untersucht. In diesen Studien wurde SMARCAL1 für die In-vivo-Analyse und ADAAD für In-vitro-Assays verwendet28,29. Frühere Studien haben gezeigt, dass ADAAD DNA strukturabhängig, aber sequenzunabhängig erkennen kann30,31. Das Protein bindet optimal an DNA-Moleküle, die Doppelstrang-zu-Einzelstrang-Übergangsregionen besitzen, ähnlich der Stammschleifen-DNA, und hydrolysiert ATP 30,31.
In-vivo-Experimente zeigten, dass SMARCAL1 die Expression von MYC, DROSHA, DGCR8 und DICER reguliert, indem es an die Promotorregionen bindet28,29. Die Region der Interaktion wurde durch ChIP-Experimente identifiziert28,29. Die ChIP-Technik wird verwendet, um die Interaktion eines Proteins mit seiner verwandten DNA innerhalb der Zelle zu analysieren. Ziel ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine, wie Transkriptionsfaktoren auf Promotoren oder anderen DNA-Bindungsstellen, an bestimmte genomische Bereiche gebunden sind. Das an die DNA gebundene Protein wird zunächst mit Formaldehyd vernetzt. Es folgt die Isolierung des Chromatins. Das isolierte Chromatin wird entweder durch Beschallung oder Nukleaseverdauung auf 500 bp-Fragmente geschert, und das an dna gebundene Protein wird mit proteinspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Vernetzung wird umgekehrt und die DNA wird entweder mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder quantitativer Real-Time-PCR analysiert.
Die ChIP-Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass SMARCAL1 möglicherweise eine transkriptionelle Regulation vermittelt, indem es eine Konformationsänderung in den Promotorregionen dieser Gene induziert. QGRS-Mapper und Mfold-Software wurden verwendet, um das Potenzial dieser Projektträgerregionen zur Bildung sekundärer Strukturen zu ermitteln28,29. QGRS Mapper wird zur Vorhersage von G-Quadruplexen32 verwendet, während Mfold33 die Fähigkeit einer Sequenz analysiert, sekundäre Strukturen wie Stammschleifen zu bilden.
Nach der Sekundärstrukturanalyse wurden weitere In-vitro-Experimente mit rekombinanter 6X His-tagged Active DNA-abhängiger ATPase A Domain (ADAAD), dem Rinderhomolog von SMARCAL1, gereinigt aus Escherichia coli34, durchgeführt. ATPase-Assays wurden unter Verwendung von ADAAD durchgeführt, um festzustellen, dass die identifizierten DNA-Sequenzen als Effektoren wirken könnten28,29. Schließlich wurde cd-Spektroskopie durchgeführt, um die durch ADAAD28,29 induzierten Konformationsänderungen im DNA-Molekül zu überwachen.
Um nachzuweisen, dass die ATPase-Aktivität des Proteins für die Induktion einer Konformationsänderung im DNA-Molekül essentiell war, wurde entweder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu Mg+2 oder Aktiver DNA-abhängiger ATPase-A-Domäneninhibitor Neomycin (ADAADiN), ein spezifischer Inhibitor des SWI/SNF-Proteins, hinzugefügt35,36 . Diese CD-spektroskopische Technik kann mit jedem gereinigten Protein verwendet werden, das durch ChIP oder einen anderen relevanten Assay nachgewiesen wurde, um an eine vorhergesagte genomische Region eines Promotors zu binden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Die zirkuläre Dichroismusspektroskopie (CD) ist eine einfache und bequeme Methode, um die Sekundärstruktur und Wechselwirkungen von Biomolekülen zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der CD-Spektroskopie haben es ermöglicht, DNA-Protein-Interaktionen und die Konformationsdynamik von DNA in verschiedenen Mikroumgebungen im Detail zu untersuchen, um die Transkriptionsregulation in vivo besser zu verstehen. Der Bereich um eine potenzielle Transkriptionszone muss abgewickelt werden, damit eine Transkription stattfinden kann. Dies ist ein komplexer Prozess, der die Koordination von Histonmodifikationen, die Bindung des Transkriptionsfaktors an DNA und andere Chromatin-Remodeling-Aktivitäten erfordert. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie ist es möglich, Konformationsänderungen in der Promotorregion zu untersuchen, die durch regulatorische Proteine wie ATP-abhängige Chromatin-Remodeler verursacht werden, um die Transkription zu fördern. Die im Protein auftretenden Konformationsänderungen können ebenfalls überwacht werden. Darüber hinaus können Fragen zur Affinität des Proteins zu seiner Ziel-DNA und sequenziellen Spezifität durch die Integration von Mutationen in die Ziel-DNA beantwortet werden. Kurz gesagt, das einzigartige Verständnis dieser empfindlichen und kostengünstigen Methode kann Änderungen der Chromatindynamik vorhersagen und dadurch das Verständnis der transkriptionellen Regulation verbessern.

ADAAD stabilisiert eine stammschleifenartige Struktur auf dem MYC-Promotor Frühere experimentelle Beweise zeigten, dass SMARCAL1 ein negativer Regulator von MYC29 ist. Die Analyse der 159 bp langen Promotorregion des MYC-Gens durch den QGRS-Mapper zeigte, dass der vordere Strang das Potenzial hatte, einen G-Quadruplex zu bilden (Tabelle 2). Mfold zeigte, dass beide Stränge der MYC-DNA eine...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Das Protokoll ermöglicht es uns, die Veränderungen in der zweiten Umstrukturierung der DNA zu visualisieren, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine induziert wird. Die Veränderung der DNA-Struktur kann mit der Transkriptionsregulation korreliert werden. Dies ist eine einfache und hochempfindliche Technik, die eine sehr kleine Menge reiner DNA verwendet, um die strukturellen Veränderungen im Oligonukleotid aufzuzeichnen.Diese Methode kann Einblicke in die Transkriptionsregulation geben, die durch ATP-abhängige Chromatin-Remodeling-Proteine vermittelt wird. Bereiten Sie zunächst die Arbeitskonzentrationen von Puffern und anderen Reaktionskomponenten frisch vor und halten Sie sie bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Reaktionen einrichten, und messen Sie dann die ATPase-Aktivität des Proteins in Gegenwart verschiedener DNA-Moleküle mit einem NADH-gekoppelten Oxidationsassay. Mischen Sie 0,1 Millimolar ADAAD, zwei Millimolar ATP, 10 Nanomolar DNA und 1X REG Puffer in einer 96-Well-Platte zu einem Endvolumen von 250 Mikrolitern.Als nächstes inkubieren Sie die Reaktion für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und messen Dann die Menge an NAD + mit der mitgelieferten Software zusammen mit dem Mikroplattenleser. Um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen, klicken Sie auf den NADH-Assay und legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter im Instrument, dann klicken Sie auf die Taste zum Lesen der Platte, um die Absorption aufzuzeichnen. Sammeln Sie die CD-Spektren in hochtransparenten Quarzküvetten.Verwenden Sie entweder rechteckige oder zylindrische Küvetten. Um die Küvetten zu reinigen, waschen Sie sie mehrmals mit Wasser und scannen Sie dann das Wasser oder den Puffer in der Küvette, um zu überprüfen, ob sie sauber ist. Verwenden Sie für die Reaktionen PAGE-gereinigte DNA-Oligonukleotide.Für eine schnelle Abkühlung die DNA drei Minuten lang auf dem Heizblock bei 94 Grad Celsius erhitzen und sofort auf Eis abkühlen lassen. Für eine langsame Abkühlung, nachdem Sie die DNA drei Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzt haben, lassen Sie sie mit einer Rate von einem Grad Celsius pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen. Um die Baseline-Spektren zu erfassen, stellen Sie insgesamt fünf Kontrollreaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen ein.Halten Sie das Reaktionsvolumen bei allen Reaktionen bei 300 Mikrolitern. Um die CD-Spektren aufzuzeichnen, stellen Sie insgesamt fünf experimentelle Reaktionen nacheinander in 1,5 Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf. Um den Scan aufzuzeichnen, schalten Sie das Gas ein und schalten Sie das CD-Spektrometer ein.Nach 10 bis 15 Minuten schalten Sie die Lampe ein, schalten das Wasserbad ein und stellen die Haltertemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Öffnen Sie als Nächstes die CD-Spektrum-Software und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, den Wellenlängenbereich auf 180 bis 300 Nanometer, die Zeit pro Punkt auf 0,5 Sekunden und die Scannummer auf fünf, klicken Sie dann auf den Pro-Datenbetrachter, erstellen Sie eine neue Datei und benennen Sie sie mit den Details des Experiments und dem Datum um. Als nächstes mischen Sie die Basis- und experimentellen Reaktionen durch Pipettieren und übertragen Sie die Reaktionsmischungen vorsichtig nacheinander auf die Küvette, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Zeit und machen Sie dann den Scan. Fügen Sie EDTA zu dem Puffer hinzu, der die DNA, ATP, Magnesium und Protein enthält, um die ATP-Hydrolyse zu stoppen. Um die ATPase-Aktivität vollständig zu hemmen, erhöhen Sie die EDTA-Konzentration und die Inkubationszeit.Subtrahieren Sie die Baselines von den entsprechenden Reaktionen in der Software und glätten Sie die Daten entweder in der CD-Spektrum-Software oder in der Datendiagrammsoftware, zeichnen Sie dann einen Graphen der Wellenlänge gegen die mittlere Rückstandselliptik und analysieren Sie die Peaks. M-Falten zeigten, dass beide Stränge der MYC-DNA eine stammschleifenartige Struktur bilden könnten. Die M-faltigen Strukturen der vorderen und der umgekehrten DNA-Sequenz, die den G-Quadruplex GECE enthält, sind hier dargestellt.Die CD-Spektren von schnell gekühltem GECE in Abwesenheit und Anwesenheit von ATP und ADAAD zeigten, dass ADAAD zwei positive Peaks induziert, einen bei 258 Nanometern und den anderen bei 210 Nanometern. Die Zugabe von EDTA hebt diese Konformationsänderung auf. Die CD-Spektren haben nun einen negativen 210-Nanometer-Peak und ein breites positives Band mit Peaks bei 230 und 250 Nanometern.QGRS-Mapper- und M-Faltungsanalysen zeigten, dass die Promotorregionen von DROSHA, DGCR8 und DICER das Potenzial besitzen, G-Quadruplex- und stammartige Strukturen zu bilden. Die CD-Spektren des DROSHA-Paares fünf zeigten, dass ADAAD einen negativen Peak bei 210 Nanometern und einen positiven Peak bei 260 Nanometern induziert. Dieses Spektrum ist ein Merkmal von ADNA.Die CD-Spektren des DGCR8-Paares zeigten einen positiven Peak bei 210 Nanometern und einen breiten negativen Peak bei 260 Nanometern. Dieses Spektrum ist charakteristisch für den Übergang von B nach X. Für das DGCR8-Paar sieben wurden starke positive Peaks bei 210 und 270 Nanometern und ein negativer Peak bei 250 Nanometern beobachtet.Dieses Spektrum ist charakteristisch für parallele G-Quadruplex-DNA-Strukturen. Schließlich wurden für das DICER-Paar eins ein positiver Peak bei 210 Nanometern und zwei negative Peaks, einer bei 230 Nanometern und der andere bei 260 Nanometern, beobachtet. Diese Peaks sind charakteristisch für einen DNA-Übergang von A nach X.Stellen Sie sicher, dass die Reinheit von DNA und Protein 99% oder mehr beträgt. Die Küvette sollte sauber sein und die Grundlinie sollte weniger als einen Milligrad betragen. Alle Reagenzien sollten rein sein, so dass der Hintergrund weniger als ein Milligrad beträgt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

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Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

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Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...