Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למתקן מחקר מכשור מתקדם, JNU, על ספקטרופוטומטר התקליטורים. V.J. ו- A.D. נתמכו על ידי מלגה מ CSIR.

1. ריכוז עבודה של רכיבי התגובה
<ol><li>הכן את ריכוזי העבודה של מאגרים עבור תקליטור ורכיבי תגובה אחרים טריים (ראה טבלה 1) ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F) לפני הגדרת התגובות. הערה: עבור תגובות התקליטור המתוארות במאמר זה, ריכוזי העבודה של רכיבים הם כדלקמן: מאגר נתרן פוספט (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA...

מטרת מאמר זה היא להציג את טכניקת ספקטרוסקופיית התקליטורים כגישה לחקור את השינויים הקונפורמציה המתרחשים ב- DNA בנוכחות חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP ולקשר את השינויים הקונפורמיים האלה לביטוי גנים. ספקטרוסקופיה של תקליטור מספקת שיטה מהירה ונגישה לחקר השינויים הקונפורמציה בדנ"א.

<p class=...

דיכרויזם מעגלי (CD) היא טכניקה ספקטרוסקופית הנשענת על כיראליות אינהרנטית של מקרומולקולים ביולוגיים המובילה לספיגה דיפרנציאלית של אור מקוטב ימני ושמאלי. ספיגה דיפרנציאלית זו ידועה כדיכרואיזם מעגלי. הטכניקה, אם כן, יכולה לשמש כדי לתאר את הקונפורמציה של מקרומולקולים ביולוגיים, כגון חלבונים ו- DNA, שניהם מכילים מרכזי כיראליים1,2.
גלים אלקטרומגנטיים מכילים רכיבים חשמליים ומגנטיים כאחד. הן השדות החשמליים והן השדות המגנטיים מתנדנדים בניצב לכיוון התפשטות הגלים. במקרה של אור לא קוטבי, שדות אלה מתנדנדים בכיוונים רבים. כאשר האור מקוטב מעגלית, שני שדות אלקטרומגנטיים מתקבלים בהפרש פאזה של 90° זה לזה. מולקולות כיראליות מראות סיבוב אופטי מעגלי (birefringence) כך שהן יספגו את האור המקוטב המעגלי הימני ואת האור המקוטב העגול השמאלי בהיקפים שונים3. השדה החשמלי המתקבל יעקוב כאליפסה, פונקציה של אורך הגל. ספקטרום התקליטורים, אם כן, נרשם כאליפטיות (q), והנתונים מוצגים כאליפטיות שאריות ממוצעת כפונקציה של אורך גל.
במקרה של חלבונים, Cα של חומצות אמינו (למעט גליצין) הוא chiral, וזה מנוצל על ידי ספקטרוסקופיה CD כדי לקבוע את המבנה המשני של מאקרומולקול זה4. ספקטרום התקליטור של מולקולות חלבון נרשם בדרך כלל בטווח ה- UV הרחוק. לחלבונים α-הליליים יש שתי רצועות שליליות ב-222 ננומטר ו-208 ננומטר ושיא חיובי אחד ב-193 ננומטר4. חלבונים עם מבנה משני אנטי-מקבילי β יריעות מראים שיא שלילי ב 218 ננומטר ושיא חיובי ב 195 nm4. חלבונים עם מבנים פרועים מראים אליפטיות נמוכה ליד 210 ננומטר ושיא שלילי ב 195 nm4. לכן, שיא מוגדר היטב / רצועות עבור מבנים משניים שונים להפוך CD כלי נוח כדי להבהיר את השינויים הקונפורמציה המתרחשים במבנה המשני של החלבונים במהלך denaturation, כמו גם כריכת ליגנד.
לחומצות גרעין יש שלושה מקורות של כיראליות: מולקולת הסוכר, ההוליות של המבנה המשני, והסדר של שלשה ארוכת טווח של DNA בסביבה5,6. ספקטרום התקליטור של חומצות גרעין נרשם בדרך כלל בטווח של 190 עד 300 ננומטר5,6. כל התאמה של DNA, בדיוק כמו חלבונים, נותן ספקטרום אופייני, אם כי הפסגות / רצועות יכול להשתנות במעלות מסוימות עקב תנאי ממס והבדלים ברצפי DNA7. B-DNA, הצורה הנפוצה ביותר, מאופיין בשיא חיובי סביב 260-280 ננומטר ושיא שלילי סביב 245 nm6. הפסגות/רצועות הדנ"א בצורת B הן בדרך כלל קטנות מכיוון שזוגות הבסיס מאונכים לסליל הכפול, ומעניקים כיראליות חלשה למולקולה. A-DNA נותן שיא חיובי דומיננטי ב 260 ננומטר ושיא שלילי סביב 210 nm6. Z-DNA,סל שמאלי, נותן רצועה שלילית ב 290 ננומטר ושיא חיובי סביב 260 nm6. DNA זה גם נותן שיא שלילי מאוד ב 205 nm6.
בנוסף לקונפורמציות אלה, DNA יכול גם ליצור טריפלקסים, מרובעים וסיכות ראש, שכולם ניתן להבחין על ידי ספקטרוסקופיה CD. G-quadruplex המקביל לתת להקה חיובית דומיננטית ב 260 ננומטר, בעוד G-quadruplex אנטי מקביל נותן רצועה שלילית ב 260 ננומטר ושיא חיובי ב 290 ננומטר, מה שהופך אותו קל להבחין בין שתי צורות של מבנים quadruplex6. טריפלקסים לא נותנים ספקטרום אופייני8. לדוגמה, הספקטרום של DNA באורך 36 נוקלאוטיד עם פוטנציאל ליצור סליל משולש תוך-עיני המכיל זוגות בסיס G.G.C ו- T.A.T בנוכחות Na+ מראה רצועה שלילית חזקה ב 240 ננומטר ושיא חיובי רחב. השיא החיובי הרחב מראה תרומות של 266, 273 ו-286 ננומטר. אותו אוליגונוקלאוטיד בנוכחות Na+ ו- Zn+ מציג ארבע להקות שליליות (213, 238, 266 ו-282 ננומטר) ושיא חיובי של 258 ננומטר. לכן, הספקטרום של DNA טריפלקס יכול להשתנות בהתאם לתנאי מלח8.
בנוסף לקונפורציות אלה, ספקטרום תקליטורים אפשר זיהוי של צורה אחרת של DNA הנקרא X-DNA. X-DNA נוצר כאשר רצף ה- DNA מכיל שאריות אדנין ותימין חלופיות. ספקטרום התקליטור של X-DNA מכיל שתי פסגות שליליות ב 250 ו 280 ננומטר. מעט מאוד מידע זמין על X-DNA, אם כי זה כבר ספקולציות לתפקד כמו כיור עבור supercoiling חיובי6,9. שינויים בספקטרום התקליטורים יכולים גם לחשוף פרטים על אינטראקציות חלבון ליגנד, ולכן, נוספו לארסנל של שיטות מולקולריות לאיתור אינטראקציות בין חלבון תרופתי10,11,12,13,14. ספקטרום תקליטור שימש גם כדי לפקח על השינויים במבנה המשני של חלבונים במהלך תהליך הקיפול15. באופן דומה, ספקטרום תקליטור יכול לשמש גם לבדיקת אינטראקציות ליגנד-DNA16,17.
ספקטרוסקופיה CD, אם כן, היא שיטה קלה וזולה להבחין בין צורות שונות של התאמת DNA, בתנאי שיש גישה לציוד ותוכנה לא כל כך זולים. השיטה רגישה ומהירה ביותר. זה רק דורש כמות קטנה של DNA, נותן לו יתרון על הטכניקה החלופית של ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR). קל גם לבצע טייטציות עם ליגנדים ומצעים. האילוץ העיקרי הוא שהדנ"א צריך להיות טהור מאוד. מומלץ להשתמש ב- DNA מטוהר של ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE).
המידע המתקבל על ידי ספקטרום תקליטור שימש בעיקר כדי להסיק תכונות מבניות חלבון ולזהות קונפורמיות DNA ברורות. במחקר זה, ספקטרום תקליטור שימשו כדי לשלב את התוצאות שהתקבלו מניסוי in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) כדי לתאר אם חלבון של עניין/ גורם שעתוק חזוי יכול להביא לשינוי קונפורמציה באזור האמרגן של הגנים המשפיעים שלה. שיתוף פעולה זה מסייע בהתקדמות של טכניקות ספקטרוסקופיות תקליטור מסורתיות על ידי חיזוי המנגנון של ויסות התמלול על ידי גורם התמלול החזוי באתר התחלת התמלול (TSS) של מקדם.
שיפוץ כרומטין הוא מנגנון מוגדר היטב הידוע לווסת תהליכים מטבוליים DNA על ידי הפיכת הכרומטין ארוז היטב נגיש לגורמים רגולטוריים שונים כגון גורמי שעתוק, רכיבים של שכפול DNA, או נזק חלבונים תיקון. משפצים כרומטין תלויי ATP, הידועים גם בשם משפחת החלבונים SWI/SNF, הם חלבונים מפתח לשיפוץ הנמצאים בתאים אאוקריוטים18,19. קיבוץ פילוגנטי סיווג את משפחת החלבונים SWI/SNF ל-6 תת-קבוצות20: דמוי Snf2, דמוי Swr1, דמוי SSO1653, דמוי Rad54, דמוי Rad5/16 ומרוחק. SMARCAL1, חלבון העניין במחקר זה, שייך לתת-קבוצה רחוקה20. חלבון זה שימש כדי לחקור את אופן הרגולציה שעתוק באמצעות ספקטרוסקופיה CD.
רוב החברים בחלבוני שיפוץ הכרומטין התלויים ב-ATP הוכחו כמי שממקמים מחדש או מפנים נוקלאוזומים או מחליפים וריאנטים של היסטון באופן תלוי ATP21,22. עם זאת, כמה מבני המשפחה לא הוכחו לשפץ נוקלאוזומים, למשל, SMARCAL1. למרות שמחקרים הראו כי SMARCAL1 מקשר עם כרומוזומים פוליטן, ראיות ניסיוניות לגבי יכולתו לשפץ נוקלאוזומים חסר 23. לכן, הו להניח כי SMARCAL1 עשוי לווסת את התמלול על ידי שינוי הקונפורמציה של DNA24. ספקטרוסקופיית תקליטורים סיפקה שיטה קלה ונגישה לאימות השערה זו.
SMARCAL1 הוא חלבון שיפוץ כרומטין תלוי ATP המתפקד בעיקר כהליקאז חישול25,26,27. זה כבר להניח כדי לווסת את התמלול על ידי שיפוץ קונפורמציה DNA24. כדי לבדוק השערה זו, התפקיד של SMARCAL1 בוויסות שעתוק גנים במהלך נזק DNA המושרה doxorubicin נחקר. במחקרים אלה, SMARCAL1 שימש לניתוח ויוו ו ADAAD עבור במבחנה assays28,29. מחקרים קודמים הראו כי ADAAD יכול לזהות DNA באופן תלוי מבנה אך רצף עצמאי30,31. החלבון נקשר בצורה אופטימלית למולקולות דנ"א בעלות גדיל כפול לאזורי מעבר חד-גדיליים, בדומה לדנ"א של לולאת גזע, והידרוליזים ATP 30,31.
ניסויי In vivo הראו כי SMARCAL1 מווסת את הביטוי של MYC, DROSHA, DGCR8 ו- DICER על ידי איגוד לאזורי האמרגן28,29. אזור האינטראקציה זוהה על ידי ניסויי ChIP28,29. טכניקת ChIP משמשת לניתוח האינטראקציה של חלבון עם ה- DNA הקוגניט שלו בתוך התא. מטרתו היא לקבוע אם חלבונים ספציפיים, כגון גורמי שעתוק על מקדמים או אתרי כריכת DNA אחרים, קשורים לאזורים גנומיים ספציפיים. החלבון הקשור לדנ"א מקושר לראשונה באמצעות פורמלדהיד. זה ואחריו בידוד של הכרומטין. הכרומטין המבודד מוצמד לשברים של 500 bp על ידי עיכול סוניקציה או נוקלאז, והחלבון הקשור לדנ"א הוא אימונופרציפיטאט באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון. הקישור הצולב הפוך, והדנ"א מנותח באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או PCR כמותי בזמן אמת.
תוצאות ChIP הובילו להשערה כי SMARCAL1 אולי מתווך רגולציה תמלול על ידי גרימת שינוי קונפורמציה באזורי האמרגן של גנים אלה. ממפה QGRS ותוכנת Mfold שימשו לזיהוי הפוטנציאל של אזורי מקדם אלה ליצור מבנים משניים28,29. ממפה QGRS משמש לחיזוי G-quadruplexes32, בעוד Mfold33 מנתח את היכולת של רצף ליצור מבנים משניים כגון לולאות גזע.
לאחר ניתוח מבנה משני, ניסויי במבחנה נוספים בוצעו עם רקומביננטי 6X ATPase A דומיין פעיל תלוי DNA (ADAAD), ההומולוג בקר של SMARCAL1, מטוהר Escherichia coli34. בדיקות ATPase בוצעו באמצעות ADAAD כדי לקבוע כי רצפי DNA שזוהו יכול לשמש כמשפיעים28,29. לבסוף, ספקטרוסקופיה CD בוצעה כדי לפקח על השינויים הקונפורמציה המושרה במולקולת ה- DNA על ידי ADAAD28,29.
כדי להוכיח שפעילות ה-ATPase של החלבון חיונית לגרימת שינוי קונפורמציה במולקולת הדנ"א, נוספה חומצה אתילנדיאמין טטראאצטית (EDTA) ל-Chelate Mg+2 או ATPase פעיל תלוי DNA A מעכב תחום Neomycin (ADAADiN), מעכב ספציפי של חלבון SWI/SNF, נוספה 35,36 . טכניקה ספקטרוסקופית זו CD ניתן להשתמש עם כל חלבון מטוהר כי הוכח על ידי ChIP או כל מבחנת רלוונטית אחרת להיקשר לאזור גנומי חזוי של מקדם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

ספקטרוסקופיה של דיכרויזם מעגלי (CD) היא שיטה פשוטה ונוחה לחקור את המבנה המשני ואת האינטראקציות של ביומולקולים. ההתקדמות האחרונה בספקטרוסקופיית תקליטורים אפשרה לחקור אינטראקציות בין חלבון DNA ודינמיקה קונפורמציה של DNA במיקרו-סביבה שונה בפירוט להבנה טובה יותר של ויסות התמלול ב- vivo. האזור סביב אזור תמלול פוטנציאלי צריך להיות לא אחיד כדי שתעתיק יתרחש. זהו תהליך מורכב הדורש תיאום של שינויים histone, כריכה של גורם שעתוק ל- DNA, ופעילויות אחרות שיפוץ כרומטין. באמצעות ספקטרוסקופיה CD, ניתן ללמוד שינויים קונפורמציה באזור המקדם הנגרמים על ידי חלבונים רגולטוריים, כגון שיפוץ כרומטין תלוי ATP, כדי לקדם שעתוק. ניתן לעקוב אחר השינויים הקונפורמציה המתרחשים בחלבון. בנוסף, ניתן לטפל בשאילתות לגבי הזיקה של החלבון לדנ"א היעד שלו ולייחודיות הרצף שלו על ידי שילוב מוטציות בדנ"א היעד. בקיצור, ההבנה הייחודית של שיטה רגישה וזולה זו יכולה לחזות שינויים בדינמיקה הכרומטית, ובכך לשפר את ההבנה של רגולציה תמלול.

ADAAD מייצב מבנה דמוי לולאת גזע על מקדם MYC ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי SMARCAL1 הוא רגולטור שלילי של MYC29. ניתוח של אזור המקדם הארוך של 159 bp של הגן MYC על ידי ממפה QGRS הראה כי לגדיל הקדמי יש פוטנציאל ליצור G-quadruplex (טבלה 2). ספל הראה כי ש?...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

הפרוטוקול מאפשר לנו לדמיין את השינויים בארגון מחדש השני של DNA המושרה על ידי חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. השינוי במבנה הדנ"א יכול להיות מתואם לרגולציית התמלול. זוהי טכניקה קלה ורגישה מאוד המשתמשת בכמות קטנה מאוד של DNA טהור כדי לתעד את השינויים המבניים באוליגונוקלאוטיד.שיטה זו יכולה לספק תובנה על ויסות שעתוק בתיווך חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. כדי להתחיל, להכין את ריכוזי העבודה של חוצצים ורכיבי תגובה אחרים טרי ולשמור אותם בארבע מעלות צלזיוס לפני הגדרת התגובות, ולאחר מכן למדוד את פעילות ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות DNA שונות באמצעות NADH מצמיד בדיקת חמצון. מערבבים ADAAD 0.1 מילימולר, ATP שני מילימולרים, 10 ננומולר DNA, ו 1X REG חוצץ בצלחת 96 טוב לנפח סופי של 250 microliters.לאחר מכן, לדגור על התגובה במשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן למדוד את כמות NAD + באמצעות התוכנה המסופקת יחד עם קורא microplate. כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר, לחץ על ת.ד. את naDH assay ומניח את צלחת 96-well על מחזיק הצלחת במכשיר, ולאחר מכן לחץ על כפתור לוח הקריאה כדי להקליט את הספיגה. אסוף את ספקטרום התקליטור בקובטות קוורץ בשקיפות גבוהה.השתמש בקובטים מלבניים או גליליים. כדי לנקות את cuvettes, לשטוף אותם עם מים מספר פעמים, ולאחר מכן לקחת סריקה של המים או חוצץ cuvette כדי לבדוק אם זה נקי. לתגובות, השתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים בדנ"א.לקירור מהיר, מחממים את הדנ"א ב-94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על בלוק החימום ומקררים אותו מיד על קרח. לקירור איטי, לאחר חימום ה- DNA ב 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, אפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה. כדי להקליט את הספקטרום הבסיסי, להגדיר בסך הכל חמש תגובות בקרה אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.שמור את נפח התגובה על 300 מיקרוליטרים בכל התגובות. כדי להקליט את ספקטרום התקליטור, להגדיר בסך הכל חמש תגובות ניסיוניות אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. כדי להקליט את הסריקה, הפעל את הגז והפעל את ספקטרומטר התקליטור.לאחר 10 עד 15 דקות, להפעיל את המנורה, להפעיל את אמבט המים ולהגדיר את טמפרטורת המחזיק על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, את טווח אורך הגל ב-180 עד 300 ננומטר, את הזמן לנקודה ל-0.5 שניות ואת מספר הסריקה לחמש, ואז לחץ על מציג הנתונים המקצועי, צור קובץ חדש ושנה את שמו לפרטי הניסוי והתאריך. לאחר מכן, מערבבים את התגובות הבסיסיות והניסוי על ידי צנרת ומעבירים בזהירות את תערובות התגובה בזה אחר זה לקובט, ומבטיחים שאין בועות אוויר.אם מבצעים ניסוי בקורס זמן, לדגור את התגובות ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הנדרש, ואז לקחת את הסריקה. הוסיפו את EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ה-ATP, המגנזיום והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP. כדי לעכב לחלוטין את פעילות ATPase, להגדיל את ריכוז EDTA וזמן הדגירה.הפחת את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה והחליק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים, ולאחר מכן התווה גרף של אורך גל כנגד אליפטיות שאריות ממוצעת וניתח את הפסגות. קפלי M הראו כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע. המבנים המקפלים M של רצף ה- DNA הקדמי וההפוך המכיל את G quadruplex GECE מוצגים כאן.ספקטרום התקליטור של GECE מקורר במהירות בהיעדר ונוכחות של ATP ו ADAAD הראה כי ADAAD גורמת שתי פסגות חיוביות, אחד ב 258 ננומטר והשני ב 210 ננומטר. התוספת של EDTA שוללת שינוי קונפורמציה זה. ספקטרום התקליטורים יש עכשיו שיא שלילי 210 ננומטר ופס חיובי רחב עם פסגות ב 230 ו 250 ננומטר.ממפה QGRS וניתוח קיפול M הראו כי אזורי האמרגן של DROSHA, DGCR8 ו- DICER הם בעלי פוטנציאל ליצור G מרובע ומבנים דמויי גזע. ספקטרום התקליטורים של זוג DROSHA חמש הראה כי ADAAD גרים שיא שלילי ב 210 ננומטר ושיא חיובי ב 260 ננומטר. ספקטרום זה הוא מאפיין של ADNA.ספקטרום התקליטורים של זוג DGCR8 אחד הראה שיא חיובי ב 210 ננומטר ושיא שלילי רחב ב 260 ננומטר. ספקטרום זה אופייני למעבר B עד X. עבור זוג DGCR8 שבע, שיאים חיוביים חזקים ב 210 ו 270 ננומטר ושיא שלילי ב 250 ננומטרים נראו.ספקטרום זה אופייני למבני דנ"א מקבילים של G מרובע. לבסוף, עבור זוג DICER אחד, שיא חיובי ב 210 ננומטר ושתי פסגות שליליות, אחד ב 230 ננומטר והשני ב 260 ננומטר נצפו. פסגות אלה אופייניות למעבר A עד X DNA.ודא כי טוהר ה- DNA והחלבון הוא 99% או יותר. cuvette צריך להיות נקי ואת הבסיס צריך להיות פחות מ millidegree אחד. כל הריאגנטים צריכים להיות טהורים כך שהרקע הוא פחות ממילימטר אחד.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...