Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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लेखक सीडी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए उन्नत इंस्ट्रूमेंटेशन रिसर्च फैसिलिटी, जेएनयू को धन्यवाद देना चाहते हैं। वीजे और एडी को सीएसआईआर की एक फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

1. प्रतिक्रिया घटकों के काम एकाग्रता
<ol><li>सीडी और अन्य प्रतिक्रिया घटकों के लिए बफर की कार्यशील सांद्रता को ताजा तैयार करें ( तालिका 1 देखें) और प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने से पहले उन्हें 4 ?...

इस लेख का उद्देश्य एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन की उपस्थिति में डीएनए में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने और जीन अभिव्यक्ति के लिए इन संरचनात्मक परिवर्तनों को जोड़ने के ?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

परिपत्र डाइक्रोइज़म (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी बायोमोलेक्यूल्स की माध्यमिक संरचना और इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक तरीका है। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी में हाल की प्रगति ने विवो में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की बेहतर समझ के लिए विस्तार से विभिन्न माइक्रोएन्वायरमेंट में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन और डीएनए की संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम किया है। एक संभावित प्रतिलेखन क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र को प्रतिलेखन होने के लिए अनवाउंड होने की आवश्यकता होती है। यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें हिस्टोन संशोधनों के समन्वय की आवश्यकता होती है, डीएनए के लिए प्रतिलेखन कारक का बंधन, और अन्य क्रोमैटिन रीमॉडलिंग गतिविधियों। सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके, प्रतिलेखन को बढ़ावा देने के लिए एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलर जैसे नियामक प्रोटीन के कारण प्रमोटर क्षेत्र में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करना संभव है। प्रोटीन में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों की भी निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, अपने लक्ष्य डीएनए और अनुक्रम विशिष्टता के प्रति प्रोटीन की आत्मीयता के बारे में प्रश्नों को लक्ष्य डीएनए में उत्परिवर्तन को शामिल करके संबोधित किया जा सकता है। संक्षेप में, इस संवेदनशील और सस्ती विधि की अनूठी समझ क्रोमैटिन गतिशीलता में परिवर्तन की भविष्यवाणी कर सकती है, जिससे ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की समझ में सुधार हो सकता है।

ADAAD MYC प्रमोटर पर स्टेम-लूप जैसी संरचना को स्थिर करता है पिछले प्रयोगात्मक साक्ष्य से पता चला है कि SMARCAL1 MYC29 का एक नकारात्मक नियामक है। क्यूजीआरएस मैपर द्वारा एमवाईसी</...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

डीएनए लिगैंड के साथ एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलर की बातचीत को सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके वर्णित किया गया है। उत्पन्न चोटियों द्वारा विश्लेषण किए गए जीन प्रमोटर पर प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के तंत्र को समझने के लिए किया जा सकता है।

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

प्रोटोकॉल हमें एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन द्वारा प्रेरित डीएनए के दूसरे पुनर्गठन में परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति देता है। डीएनए संरचना में परिवर्तन प्रतिलेखन विनियमन से संबंधित हो सकता है। यह एक आसान और अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है जो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड में संरचनात्मक परिवर्तनों को रिकॉर्ड करने के लिए बहुत कम मात्रा में शुद्ध डीएनए का उपयोग करती है।यह विधि एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता प्रतिलेखन विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। शुरू करने के लिए, buffers और अन्य प्रतिक्रिया घटकों के काम सांद्रता को ताजा तैयार करें और प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने से पहले उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर रखें, फिर एक NADH युग्मित ऑक्सीकरण परख का उपयोग करके विभिन्न डीएनए अणुओं की उपस्थिति में प्रोटीन की ATPase गतिविधि को मापें। 0.1 millimolar ADAAD, दो millimolar एटीपी, 10 nanomolar डीएनए, और 1X REG बफर को 96-अच्छी तरह से प्लेट में 250 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में मिलाएं।इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, फिर माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एनएडी + की मात्रा को मापें। 340 नैनोमीटर पर absorbance को मापने के लिए, NADH परख पर क्लिक करें और उपकरण में प्लेट धारक पर 96-अच्छी तरह से प्लेट रखें, फिर absorbance रिकॉर्ड करने के लिए पठन प्लेट बटन पर क्लिक करें। उच्च पारदर्शिता क्वार्ट्ज cuvettes में सीडी स्पेक्ट्रा ले लीजिए.या तो आयताकार या बेलनाकार cuvettes का उपयोग करें। क्यूवेट को साफ करने के लिए, उन्हें कई बार पानी से धोएं, फिर यह जांचने के लिए कि यह साफ है या नहीं, क्यूवेट में पानी या बफर का स्कैन करें। प्रतिक्रियाओं के लिए, पृष्ठ-शुद्ध डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करें।तेजी से ठंडा करने के लिए, हीटिंग ब्लॉक पर तीन मिनट के लिए डीएनए को 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और तुरंत इसे बर्फ पर ठंडा करें। धीमी गति से ठंडा करने के लिए, डीएनए को तीन मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद, इसे प्रति मिनट एक डिग्री सेल्सियस की दर से कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें। बेसलाइन स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक-एक करके कुल पांच नियंत्रण प्रतिक्रियाएं सेट करें।सभी प्रतिक्रियाओं में प्रतिक्रिया की मात्रा को 300 माइक्रोलीटर पर रखें। सीडी स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक-एक करके कुल पांच प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाएं स्थापित करें। स्कैन रिकॉर्ड करने के लिए, गैस को चालू करें और सीडी स्पेक्ट्रोमीटर को चालू करें।10 से 15 मिनट के बाद, दीपक को चालू करें, पानी के स्नान को चालू करें और धारक का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। अगला, सीडी स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर खोलें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, तरंग दैर्ध्य सीमा 180 से 300 नैनोमीटर पर, प्रति बिंदु समय 0.5 सेकंड तक, और स्कैन संख्या पांच तक, फिर प्रो डेटा व्यूअर पर क्लिक करें, एक नई फ़ाइल बनाएं, और प्रयोग और तिथि के विवरण के साथ इसका नाम बदलें। अगला, बेसलाइन और प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाओं को पिपेटिंग द्वारा मिलाएं और ध्यान से प्रतिक्रिया मिश्रणों को एक-एक करके क्यूवेट में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।यदि एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग कर रहा है, तो आवश्यक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, फिर स्कैन लें। एटीपी हाइड्रोलिसिस को रोकने के लिए डीएनए, एटीपी, मैग्नीशियम और प्रोटीन युक्त बफर में ईडीटीए जोड़ें। ATPase गतिविधि को पूरी तरह से बाधित करने के लिए, EDTA एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं।सॉफ़्टवेयर में संबंधित प्रतिक्रियाओं से बेसलाइन को घटाएं और सीडी स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर में या डेटा प्लॉटिंग सॉफ़्टवेयर में डेटा को चिकना करें, फिर माध्य अवशेषों के खिलाफ तरंग दैर्ध्य का एक ग्राफ प्लॉट करें और चोटियों का विश्लेषण करें। एम-सिलवटों से पता चला है कि एमवाईसी डीएनए के दोनों स्ट्रैंड एक स्टेम लूप जैसी संरचना बना सकते हैं। आगे की एम-फोल्ड संरचनाएं और जी क्वाड्रप्लेक्स जीईसीई वाले रिवर्स डीएनए अनुक्रम को यहां दिखाया गया है।एटीपी और एडीएडी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में तेजी से ठंडा जीईसीई के सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि एडीएएडी दो सकारात्मक चोटियों को प्रेरित करता है, एक 258 नैनोमीटर पर और दूसरा 210 नैनोमीटर पर। EDTA के अलावा इस संरचनात्मक परिवर्तन निरस्त करता है। सीडी स्पेक्ट्रा में अब एक नकारात्मक 210 नैनोमीटर शिखर और 230 और 250 नैनोमीटर पर चोटियों के साथ एक व्यापक सकारात्मक बैंड है।QGRS मैपर और एम-फोल्ड विश्लेषण से पता चला है कि DROSHA, DGCR8, और DICER के प्रमोटर क्षेत्रों में G quadruplex और स्टेम जैसी संरचनाओं को बनाने की क्षमता है। DROSHA जोड़ी पांच के सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि ADAAD 210 नैनोमीटर पर एक नकारात्मक चोटी और 260 नैनोमीटर पर एक सकारात्मक चोटी को प्रेरित करता है। यह स्पेक्ट्रम ADNA की एक विशेषता है।DGCR8 जोड़ी एक के सीडी स्पेक्ट्रा ने 210 नैनोमीटर पर एक सकारात्मक चोटी और 260 नैनोमीटर पर एक व्यापक नकारात्मक चोटी दिखाई। यह स्पेक्ट्रम बी से एक्स संक्रमण की विशेषता है। DGCR8 युग्म सात के लिए, 210 और 270 नैनोमीटर पर मजबूत सकारात्मक चोटियों और 250 नैनोमीटर पर एक नकारात्मक चोटी देखी गई थी।यह स्पेक्ट्रम समानांतर जी चतुर्भुज डीएनए संरचनाओं की विशेषता है। अंत में, DICER जोड़ी के लिए एक, 210 नैनोमीटर और दो नकारात्मक चोटियों पर एक सकारात्मक चोटी, एक 230 नैनोमीटर पर और दूसरा 260 नैनोमीटर पर देखा गया था। ये चोटियां ए से एक्स डीएनए संक्रमण की विशेषता हैं।सुनिश्चित करें कि डीएनए और प्रोटीन की शुद्धता 99% या उससे अधिक है। क्यूवेट साफ होना चाहिए और बेसलाइन एक मिलेइडग्री से कम होनी चाहिए। सभी अभिकर्मक शुद्ध होने चाहिए ताकि पृष्ठभूमि एक मिलिडेग्री से कम हो।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

सिंगल-सेल ड्रग तेज, मेटाबोलिज्म और इफेक्ट्स का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफॉर्म

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

अनुवाद विनियमन में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...