Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, per lo spettrofotometro CD. V.J. e A.D. sono stati sostenuti da una borsa di studio del CSIR.

1. Concentrazione di lavoro dei componenti di reazione
<ol><li>Preparare nuovamente le concentrazioni di lavoro dei tamponi per CD e altri componenti di reazione (vedere Tabella 1) e mantenerle a 4 °C prima di impostare le reazioni. NOTA: Per le reazioni CD descritte in questo articolo, le concentrazioni di lavoro dei componenti sono le seguenti: tampone fosfato di sodio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, proteina 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</o...

Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica di spettroscopia CD come approccio per studiare i cambiamenti conformazionali che si verificano nel DNA in presenza di proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti e per collegare questi cambiamenti conformazionali all'espressione genica. La spettroscopia CD fornisce un metodo veloce e facilmente accessibile per studiare i cambiamenti conformazionali nel DNA.

Un punto cruciale da considerare per questa tecnica è la...

Il dicroismo circolare (CD) è una tecnica spettroscopica che si basa sulla chiralità intrinseca delle macromolecole biologiche che porta all'assorbimento differenziale della luce polarizzata circolarmente destrorsa e mancina. Questo assorbimento differenziale è noto come dicroismo circolare. La tecnica, quindi, può essere utilizzata per delineare la conformazione di macromolecole biologiche, come proteine e DNA, che contengono entrambi centri chirali1,2.
Le onde elettromagnetiche contengono componenti sia elettrici che magnetici. Sia il campo elettrico che quello magnetico oscillano perpendicolarmente alla direzione di propagazione dell'onda. Nel caso della luce non polarizzata, questi campi oscillano in molte direzioni. Quando la luce è polarizzata circolarmente, si ottengono due campi elettromagnetici a 90° di differenza di fase l'uno dall'altro. Le molecole chirali mostrano una rotazione ottica circolare (birifrangenza) tale da assorbire la luce polarizzata circolarmente destrorsa e la luce polarizzata circolarmente mancina in misura diversa3. Il campo elettrico risultante sarà tracciato come un'ellisse, una funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro CD è, quindi, registrato come ellitticità (q), e i dati sono presentati come Ellitticità media residuo in funzione della lunghezza d'onda.
Nel caso delle proteine, la Cα degli amminoacidi (eccetto la glicina) è chirale, e questo viene sfruttato dalla spettroscopia CD per determinare la struttura secondaria di questa macromolecola4. Gli spettri CD delle molecole proteiche sono tipicamente registrati nell'intervallo Far UV. α-elicoidali hanno due bande negative a 222 nm e 208 nm e un picco positivo a 193 nm4. Le proteine con struttura secondaria anti-parallelo β-foglio mostrano un picco negativo a 218 nm e un picco positivo a 195 nm4. Le proteine con strutture disordinate mostrano una bassa ellitticità vicino a 210 nm e un picco negativo a 195 nm4. Pertanto, i picchi / bande ben definiti per diverse strutture secondarie rendono il CD uno strumento conveniente per chiarire i cambiamenti conformazionali che si verificano nella struttura secondaria delle proteine durante la denaturazione e il legame del ligando.
Gli acidi nucleici hanno tre fonti di chiralità: la molecola di zucchero, l'elicità della struttura secondaria e l'ordinamento terziario a lungo raggio del DNA nell'ambiente5,6. Gli spettri CD degli acidi nucleici sono tipicamente registrati nell'intervallo da 190 a 300 nm5,6. Ogni conformazione del DNA, proprio come le proteine, fornisce uno spettro caratteristico, anche se i picchi/bande possono variare di alcuni gradi a causa delle condizioni del solvente e delle differenze nelle sequenze di DNA7. Il B-DNA, la forma più comune, è caratterizzato da un picco positivo intorno a 260-280 nm e un picco negativo intorno a 245 nm6. I picchi/bande del DNA di forma B sono generalmente piccoli perché le coppie di basi sono perpendicolari alla doppia elica, conferendo debole chiralità alla molecola. A-DNA dà un picco positivo dominante a 260 nm e un picco negativo intorno a 210 nm6. Z-DNA, l'elica mancina, dà una banda negativa a 290 nm e un picco positivo intorno a 260 nm6. Questo DNA dà anche un picco estremamente negativo a 205 nm6.
Oltre a queste conformazioni, il DNA può anche formare triplex, quadruplex e forcine, che possono essere distinte dalla spettroscopia CD. Il parallelo G-quadruplex dà una banda positiva dominante a 260 nm, mentre l'anti-parallelo G-quadruplex dà una banda negativa a 260 nm e un picco positivo a 290 nm, rendendo facile distinguere tra le due forme di strutture quadruplex6. I triplex non danno uno spettro caratteristico8. Ad esempio, gli spettri di un DNA lungo 36 nucleotidi con il potenziale di formare una tripla elica intramolecolare contenente coppie di basi G.G.C e T.A.T in presenza di Na+ mostrano una forte banda negativa a 240 nm e un ampio picco positivo. L'ampio picco positivo mostra contributi a 266, 273 e 286 nm. Lo stesso oligonucleotide in presenza di Na+ e Zn+ mostra quattro bande negative (213, 238, 266 e 282 nm) e un picco positivo a 258 nm. Pertanto, gli spettri del DNA triplex possono variare a seconda delle condizioni del sale8.
Oltre a queste conformazioni, gli spettri CD hanno permesso l'identificazione di un'altra forma di DNA chiamata X-DNA. X-DNA si forma quando la sequenza di DNA contiene residui alternativi di adenina e timina. Gli spettri CD di X-DNA contengono due picchi negativi a 250 e 280 nm. Sono disponibili pochissime informazioni su X-DNA, anche se è stato ipotizzato che funzioni come un pozzo per il supercoiling positivo6,9. I cambiamenti negli spettri CD possono anche rivelare dettagli sulle interazioni ligando-proteina e, quindi, sono stati aggiunti all'arsenale di metodi molecolari per rilevare le interazioni farmaco-proteina10,11,12,13,14. Gli spettri CD sono stati utilizzati anche per monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria delle proteine durante il processo di ripiegamento15. Allo stesso modo, gli spettri CD possono essere utilizzati anche per sondare le interazioni ligando-DNA16,17.
La spettroscopia CD, quindi, è un metodo facile ed economico per distinguere tra le diverse forme di conformazione del DNA, a condizione che vi sia accesso ad apparecchiature e software non così economici. Il metodo è estremamente sensibile e veloce. Richiede solo una piccola quantità di DNA, dandogli un vantaggio rispetto alla tecnica alternativa della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Anche le titolazioni con ligandi e substrati sono facili da eseguire. Il vincolo principale è che il DNA dovrebbe essere altamente puro. Si consiglia di utilizzare DNA purificato con elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE).
Le informazioni ottenute dagli spettri CD sono state utilizzate principalmente per dedurre le caratteristiche strutturali delle proteine e per identificare distinti conformisti del DNA. In questo studio, gli spettri CD sono stati utilizzati per integrare i risultati ottenuti da un esperimento in vivo di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per delineare se la proteina di interesse / fattore di trascrizione previsto può determinare un cambiamento conformazionale nella regione promotore dei suoi geni effettori. Questa collaborazione aiuta nel progresso delle tradizionali tecniche spettroscopiche CD prevedendo il meccanismo di regolazione della trascrizione da parte del fattore di trascrizione previsto su e intorno al sito di inizio della trascrizione (TSS) di un promotore.
Il rimodellamento della cromatina è un meccanismo ben definito noto per regolare i processi metabolici del DNA rendendo la cromatina strettamente imballata accessibile a vari fattori regolatori come fattori di trascrizione, componenti della replicazione del DNA o proteine di riparazione del danno. I rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, noti anche come famiglia di proteine SWI/SNF, sono proteine rimodellanti chiave presenti nelle cellule eucariotiche18,19. Il clustering filogenetico ha classificato la famiglia di proteine SWI/SNF in 6 sottogruppi20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like e distant. SMARCAL1, la proteina di interesse in questo studio, appartiene al sottogruppo distante20. Questa proteina è stata utilizzata per studiare la sua modalità di regolazione trascrizionale utilizzando la spettroscopia CD.
La maggior parte dei membri delle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti hanno dimostrato di riposizionare o sfrattare i nucleosomi o mediare lo scambio di varianti istoniche in modo ATP-dipendente21,22. Tuttavia, alcuni membri di questa famiglia non hanno dimostrato di rimodellare i nucleosomi, ad esempio SMARCAL1. Anche se gli studi hanno dimostrato che SMARCAL1 si associa ai cromosomi politenici, mancano prove sperimentali riguardanti la sua capacità di rimodellare i nucleosomi23. Pertanto, è stato postulato che SMARCAL1 può regolare la trascrizione alterando la conformazione del DNA24. La spettroscopia CD ha fornito un metodo facile e accessibile per convalidare questa ipotesi.
SMARCAL1 è una proteina rimodellante della cromatina ATP-dipendente che funziona principalmente come elicasi ricottura25,26,27. È stato postulato per modulare la trascrizione rimodellando la conformazione del DNA24. Per verificare questa ipotesi, è stato studiato il ruolo di SMARCAL1 nella regolazione della trascrizione genica durante il danno al DNA indotto dalla doxorubicina. In questi studi, SMARCAL1 è stato utilizzato per l'analisi in vivo e ADAAD per i saggi in vitro28,29. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ADAAD è in grado di riconoscere il DNA in modo struttura-dipendente ma indipendente dalla sequenza30,31. La proteina si lega in modo ottimale alle molecole di DNA che possiedono regioni di transizione a doppio filamento a singolo filamento, simili al DNA ad anello dello stelo, e idrolizza ATP 30,31.
Esperimenti in vivo hanno dimostrato che SMARCAL1 regola l'espressione di MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER legandosi alle regioni del promotore28,29. La regione di interazione è stata identificata dagli esperimenti ChIP28,29. La tecnica ChIP viene utilizzata per analizzare l'interazione di una proteina con il suo DNA affine all'interno della cellula. Il suo obiettivo è determinare se proteine specifiche, come i fattori di trascrizione sui promotori o altri siti di legame del DNA, sono legate a specifiche aree genomiche. La proteina legata al DNA viene prima reticolata usando la formaldeide. Questo è seguito dall'isolamento della cromatina. La cromatina isolata viene tranciata a frammenti di 500 bp mediante sonicazione o digestione della nucleasi e la proteina legata al DNA viene immunoprecipita utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Il cross-linking viene invertito e il DNA viene analizzato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la PCR quantitativa in tempo reale.
I risultati di ChIP hanno portato all'ipotesi che SMARCAL1 possa mediare la regolazione trascrizionale inducendo un cambiamento conformazionale nelle regioni promotrici di questi geni. Il mappatore QGRS e il software Mfold sono stati utilizzati per identificare il potenziale di queste regioni promotrici per formare strutture secondarie28,29. Il mappatore QGRS viene utilizzato per prevedere G-quadruplexes32, mentre Mfold33 analizza la capacità di una sequenza di formare strutture secondarie come gli stem-loop.
Dopo l'analisi della struttura secondaria, sono stati eseguiti ulteriori esperimenti in vitro con il recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), l'omologo bovino di SMARCAL1, purificato da Escherichia coli34. I saggi ATPasi sono stati eseguiti utilizzando ADAAD per stabilire che le sequenze di DNA identificate potrebbero agire come effettori28,29. Infine, è stata eseguita la spettroscopia CD per monitorare i cambiamenti conformazionali indotti nella molecola di DNA da ADAAD28,29.
Per dimostrare che l'attività ATPasi della proteina era essenziale per indurre un cambiamento conformazionale nella molecola del DNA, è stato aggiunto acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) al chelato Mg+2 o ATPasi attiva DNA-dipendente A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), un inibitore specifico della proteina SWI/SNF35,36 . Questa tecnica spettroscopica CD può essere utilizzata con qualsiasi proteina purificata che è stata dimostrata da ChIP o qualsiasi altro test pertinente per legarsi a una regione genomica prevista di un promotore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

La spettroscopia del dicroismo circolare (CD) è un metodo semplice e conveniente per studiare la struttura secondaria e le interazioni delle biomolecole. I recenti progressi nella spettroscopia CD hanno permesso lo studio delle interazioni DNA-proteina e delle dinamiche conformazionali del DNA in diversi microambienti in dettaglio per una migliore comprensione della regolazione trascrizionale in vivo. L'area intorno a una potenziale zona di trascrizione deve essere srotolata affinché si verifichi la trascrizione. Questo è un processo complesso che richiede il coordinamento delle modificazioni istoniche, il legame del fattore di trascrizione al DNA e altre attività di rimodellamento della cromatina. Utilizzando la spettroscopia CD, è possibile studiare i cambiamenti conformazionali nella regione del promotore causati da proteine regolatrici, come i rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, per promuovere la trascrizione. Anche i cambiamenti conformazionali che si verificano nella proteina possono essere monitorati. Inoltre, le domande riguardanti l'affinità della proteina verso il suo DNA bersaglio e la specificità della sequenza possono essere affrontate incorporando mutazioni nel DNA bersaglio. In breve, la comprensione unica di questo metodo sensibile e poco costoso può prevedere i cambiamenti nella dinamica della cromatina, migliorando così la comprensione della regolazione trascrizionale.

ADAAD stabilizza una struttura simile a un anello di stelo sul promotore MYC Precedenti prove sperimentali hanno dimostrato che SMARCAL1 è un regolatore negativo di MYC29. L'analisi della regione del promotore lungo 159 bp del gene MYC da parte del mappatore QGRS ha mostrato che il filamento in avanti aveva il potenziale per formare un G-quadruplex (Tabella 2). Mfold ha mostrato che entrambi i filam...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Il protocollo ci permette di visualizzare i cambiamenti nella seconda ristrutturazione del DNA indotti dalle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti. Il cambiamento nella struttura del DNA può essere correlato alla regolazione della trascrizione. Questa è una tecnica facile e altamente sensibile che utilizza una quantità molto piccola di DNA puro per registrare i cambiamenti strutturali nell'oligonucleotide.Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione della trascrizione mediata dalle proteine di rimodellamento della cromatina dipendenti dall'ATP. Per iniziare, preparare le concentrazioni di lavoro dei tamponi e di altri componenti di reazione freschi e mantenerli a quattro gradi Celsius prima di impostare le reazioni, quindi misurare l'attività ATPasi della proteina in presenza di diverse molecole di DNA utilizzando un test di ossidazione accoppiato NADH. Mescolare ADAAD 0,1 millimolari, ATP due millimolari, DNA nanomolare 10 e tampone REG 1X in una piastra da 96 pozzetti per un volume finale di 250 microlitri.Quindi, incubare la reazione per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius, quindi misurare la quantità di NAD + utilizzando il software fornito insieme al lettore di micropiastre. Per misurare l'assorbanza a 340 nanometri, fare clic sul test NADH e posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra nello strumento, quindi fare clic sul pulsante della piastra di lettura per registrare l'assorbanza. Raccogli gli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza.Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche. Per pulire le cuvette, lavarle con acqua più volte, quindi eseguire una scansione dell'acqua o tamponare nella cuvetta per verificare se è pulita. Per le reazioni, utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati da PAGE.Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio. Per un raffreddamento lento, dopo aver riscaldato il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti, lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente ad una velocità di un grado Celsius al minuto. Per registrare gli spettri basali, impostare un totale di cinque reazioni di controllo una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.Mantenere il volume di reazione a 300 microlitri in tutte le reazioni. Per registrare gli spettri cd, impostare un totale di cinque reazioni sperimentali una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri. Per registrare la scansione, accendere il gas e accendere lo spettrometro CD.Dopo 10-15 minuti, accendere la lampada, accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del supporto a 37 gradi Celsius. Quindi, apri il software dello spettro CD e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius, l'intervallo di lunghezze d'onda da 180 a 300 nanometri, il tempo per punto a 0,5 secondi e il numero di scansione a cinque, quindi fai clic sul visualizzatore di dati pro, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli dell'esperimento e la data. Quindi, mescolare la linea di base e le reazioni sperimentali mediante pipettaggio e trasferire con cura le miscele di reazione una per una alla cuvetta, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.Se si esegue un esperimento di corso temporale, incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per il tempo richiesto, quindi eseguire la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, magnesio e proteine per fermare l'idrolisi dell'ATP. Per inibire completamente l'attività dell'ATPasi, aumentare la concentrazione di EDTA e il tempo di incubazione.Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software e levigare i dati nel software dello spettro CD o nel software di tracciamento dei dati, quindi tracciare un grafico di lunghezza d'onda contro l'ellitticità media dei residui e analizzare i picchi. Le pieghe M hanno mostrato che entrambi i filamenti del DNA MYC potrebbero formare una struttura simile a un anello dello stelo. Le strutture M-fold della sequenza di DNA anteriore e inversa contenente il G quadruplex GECE sono mostrate qui.Gli spettri CD di GECE raffreddato velocemente in assenza e presenza di ATP e ADAAD hanno dimostrato che ADAAD induce due picchi positivi, uno a 258 nanometri e l'altro a 210 nanometri. L'aggiunta dell'EDTA abroga questo cambiamento conformazionale. Gli spettri CD hanno ora un picco negativo di 210 nanometri e un'ampia banda positiva con picchi a 230 e 250 nanometri.L'analisi del mappatore QGRS e dell'M-fold ha mostrato che le regioni promotori di DROSHA, DGCR8 e DICER possiedono il potenziale per formare strutture G quadruplex e stem-like. Gli spettri CD della coppia DROSHA cinque hanno mostrato che ADAAD induce un picco negativo a 210 nanometri e un picco positivo a 260 nanometri. Questo spettro è una caratteristica dell'ADNA.Gli spettri CD della coppia DGCR8 uno hanno mostrato un picco positivo a 210 nanometri e un ampio picco negativo a 260 nanometri. Questo spettro è caratteristico della transizione da B a X. Per la coppia DGCR8 sette, sono stati osservati forti picchi positivi a 210 e 270 nanometri e un picco negativo a 250 nanometri.Questo spettro è caratteristico delle strutture parallele G quadruplex DNA. Infine, per la coppia DICER uno, sono stati osservati un picco positivo a 210 nanometri e due picchi negativi, uno a 230 nanometri e l'altro a 260 nanometri. Questi picchi sono caratteristici di una transizione del DNA da A a X.Assicurarsi che la purezza del DNA e delle proteine sia pari o superiore al 99%. La cuvetta deve essere pulita e la linea di base deve essere inferiore a un millidegree. Tutti i reagenti devono essere puri in modo che lo sfondo sia inferiore a un millidegree.

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