Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, per lo spettrofotometro CD. V.J. e A.D. sono stati sostenuti da una borsa di studio del CSIR.

1. Concentrazione di lavoro dei componenti di reazione
<ol><li>Preparare nuovamente le concentrazioni di lavoro dei tamponi per CD e altri componenti di reazione (vedere Tabella 1) e mantenerle a 4 °C prima di impostare le reazioni. NOTA: Per le reazioni CD descritte in questo articolo, le concentrazioni di lavoro dei componenti sono le seguenti: tampone fosfato di sodio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, proteina 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</o...

Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica di spettroscopia CD come approccio per studiare i cambiamenti conformazionali che si verificano nel DNA in presenza di proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti e per collegare questi cambiamenti conformazionali all'espressione genica. La spettroscopia CD fornisce un metodo veloce e facilmente accessibile per studiare i cambiamenti conformazionali nel DNA.

Un punto cruciale da considerare per questa tecnica è la...

Il dicroismo circolare (CD) è una tecnica spettroscopica che si basa sulla chiralità intrinseca delle macromolecole biologiche che porta all'assorbimento differenziale della luce polarizzata circolarmente destrorsa e mancina. Questo assorbimento differenziale è noto come dicroismo circolare. La tecnica, quindi, può essere utilizzata per delineare la conformazione di macromolecole biologiche, come proteine e DNA, che contengono entrambi centri chirali1,2.
Le onde elettromagnetiche contengono componenti sia elettrici che magnetici. Sia il campo elettrico che quello magnetico oscillano perpendicolarmente alla direzione di propagazione dell'onda. Nel caso della luce non polarizzata, questi campi oscillano in molte direzioni. Quando la luce è polarizzata circolarmente, si ottengono due campi elettromagnetici a 90° di differenza di fase l'uno dall'altro. Le molecole chirali mostrano una rotazione ottica circolare (birifrangenza) tale da assorbire la luce polarizzata circolarmente destrorsa e la luce polarizzata circolarmente mancina in misura diversa3. Il campo elettrico risultante sarà tracciato come un'ellisse, una funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro CD è, quindi, registrato come ellitticità (q), e i dati sono presentati come Ellitticità media residuo in funzione della lunghezza d'onda.
Nel caso delle proteine, la Cα degli amminoacidi (eccetto la glicina) è chirale, e questo viene sfruttato dalla spettroscopia CD per determinare la struttura secondaria di questa macromolecola4. Gli spettri CD delle molecole proteiche sono tipicamente registrati nell'intervallo Far UV. α-elicoidali hanno due bande negative a 222 nm e 208 nm e un picco positivo a 193 nm4. Le proteine con struttura secondaria anti-parallelo β-foglio mostrano un picco negativo a 218 nm e un picco positivo a 195 nm4. Le proteine con strutture disordinate mostrano una bassa ellitticità vicino a 210 nm e un picco negativo a 195 nm4. Pertanto, i picchi / bande ben definiti per diverse strutture secondarie rendono il CD uno strumento conveniente per chiarire i cambiamenti conformazionali che si verificano nella struttura secondaria delle proteine durante la denaturazione e il legame del ligando.
Gli acidi nucleici hanno tre fonti di chiralità: la molecola di zucchero, l'elicità della struttura secondaria e l'ordinamento terziario a lungo raggio del DNA nell'ambiente5,6. Gli spettri CD degli acidi nucleici sono tipicamente registrati nell'intervallo da 190 a 300 nm5,6. Ogni conformazione del DNA, proprio come le proteine, fornisce uno spettro caratteristico, anche se i picchi/bande possono variare di alcuni gradi a causa delle condizioni del solvente e delle differenze nelle sequenze di DNA7. Il B-DNA, la forma più comune, è caratterizzato da un picco positivo intorno a 260-280 nm e un picco negativo intorno a 245 nm6. I picchi/bande del DNA di forma B sono generalmente piccoli perché le coppie di basi sono perpendicolari alla doppia elica, conferendo debole chiralità alla molecola. A-DNA dà un picco positivo dominante a 260 nm e un picco negativo intorno a 210 nm6. Z-DNA, l'elica mancina, dà una banda negativa a 290 nm e un picco positivo intorno a 260 nm6. Questo DNA dà anche un picco estremamente negativo a 205 nm6.
Oltre a queste conformazioni, il DNA può anche formare triplex, quadruplex e forcine, che possono essere distinte dalla spettroscopia CD. Il parallelo G-quadruplex dà una banda positiva dominante a 260 nm, mentre l'anti-parallelo G-quadruplex dà una banda negativa a 260 nm e un picco positivo a 290 nm, rendendo facile distinguere tra le due forme di strutture quadruplex6. I triplex non danno uno spettro caratteristico8. Ad esempio, gli spettri di un DNA lungo 36 nucleotidi con il potenziale di formare una tripla elica intramolecolare contenente coppie di basi G.G.C e T.A.T in presenza di Na+ mostrano una forte banda negativa a 240 nm e un ampio picco positivo. L'ampio picco positivo mostra contributi a 266, 273 e 286 nm. Lo stesso oligonucleotide in presenza di Na+ e Zn+ mostra quattro bande negative (213, 238, 266 e 282 nm) e un picco positivo a 258 nm. Pertanto, gli spettri del DNA triplex possono variare a seconda delle condizioni del sale8.
Oltre a queste conformazioni, gli spettri CD hanno permesso l'identificazione di un'altra forma di DNA chiamata X-DNA. X-DNA si forma quando la sequenza di DNA contiene residui alternativi di adenina e timina. Gli spettri CD di X-DNA contengono due picchi negativi a 250 e 280 nm. Sono disponibili pochissime informazioni su X-DNA, anche se è stato ipotizzato che funzioni come un pozzo per il supercoiling positivo6,9. I cambiamenti negli spettri CD possono anche rivelare dettagli sulle interazioni ligando-proteina e, quindi, sono stati aggiunti all'arsenale di metodi molecolari per rilevare le interazioni farmaco-proteina10,11,12,13,14. Gli spettri CD sono stati utilizzati anche per monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria delle proteine durante il processo di ripiegamento15. Allo stesso modo, gli spettri CD possono essere utilizzati anche per sondare le interazioni ligando-DNA16,17.
La spettroscopia CD, quindi, è un metodo facile ed economico per distinguere tra le diverse forme di conformazione del DNA, a condizione che vi sia accesso ad apparecchiature e software non così economici. Il metodo è estremamente sensibile e veloce. Richiede solo una piccola quantità di DNA, dandogli un vantaggio rispetto alla tecnica alternativa della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Anche le titolazioni con ligandi e substrati sono facili da eseguire. Il vincolo principale è che il DNA dovrebbe essere altamente puro. Si consiglia di utilizzare DNA purificato con elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE).
Le informazioni ottenute dagli spettri CD sono state utilizzate principalmente per dedurre le caratteristiche strutturali delle proteine e per identificare distinti conformisti del DNA. In questo studio, gli spettri CD sono stati utilizzati per integrare i risultati ottenuti da un esperimento in vivo di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per delineare se la proteina di interesse / fattore di trascrizione previsto può determinare un cambiamento conformazionale nella regione promotore dei suoi geni effettori. Questa collaborazione aiuta nel progresso delle tradizionali tecniche spettroscopiche CD prevedendo il meccanismo di regolazione della trascrizione da parte del fattore di trascrizione previsto su e intorno al sito di inizio della trascrizione (TSS) di un promotore.
Il rimodellamento della cromatina è un meccanismo ben definito noto per regolare i processi metabolici del DNA rendendo la cromatina strettamente imballata accessibile a vari fattori regolatori come fattori di trascrizione, componenti della replicazione del DNA o proteine di riparazione del danno. I rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, noti anche come famiglia di proteine SWI/SNF, sono proteine rimodellanti chiave presenti nelle cellule eucariotiche18,19. Il clustering filogenetico ha classificato la famiglia di proteine SWI/SNF in 6 sottogruppi20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like e distant. SMARCAL1, la proteina di interesse in questo studio, appartiene al sottogruppo distante20. Questa proteina è stata utilizzata per studiare la sua modalità di regolazione trascrizionale utilizzando la spettroscopia CD.
La maggior parte dei membri delle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti hanno dimostrato di riposizionare o sfrattare i nucleosomi o mediare lo scambio di varianti istoniche in modo ATP-dipendente21,22. Tuttavia, alcuni membri di questa famiglia non hanno dimostrato di rimodellare i nucleosomi, ad esempio SMARCAL1. Anche se gli studi hanno dimostrato che SMARCAL1 si associa ai cromosomi politenici, mancano prove sperimentali riguardanti la sua capacità di rimodellare i nucleosomi23. Pertanto, è stato postulato che SMARCAL1 può regolare la trascrizione alterando la conformazione del DNA24. La spettroscopia CD ha fornito un metodo facile e accessibile per convalidare questa ipotesi.
SMARCAL1 è una proteina rimodellante della cromatina ATP-dipendente che funziona principalmente come elicasi ricottura25,26,27. È stato postulato per modulare la trascrizione rimodellando la conformazione del DNA24. Per verificare questa ipotesi, è stato studiato il ruolo di SMARCAL1 nella regolazione della trascrizione genica durante il danno al DNA indotto dalla doxorubicina. In questi studi, SMARCAL1 è stato utilizzato per l'analisi in vivo e ADAAD per i saggi in vitro28,29. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ADAAD è in grado di riconoscere il DNA in modo struttura-dipendente ma indipendente dalla sequenza30,31. La proteina si lega in modo ottimale alle molecole di DNA che possiedono regioni di transizione a doppio filamento a singolo filamento, simili al DNA ad anello dello stelo, e idrolizza ATP 30,31.
Esperimenti in vivo hanno dimostrato che SMARCAL1 regola l'espressione di MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER legandosi alle regioni del promotore28,29. La regione di interazione è stata identificata dagli esperimenti ChIP28,29. La tecnica ChIP viene utilizzata per analizzare l'interazione di una proteina con il suo DNA affine all'interno della cellula. Il suo obiettivo è determinare se proteine specifiche, come i fattori di trascrizione sui promotori o altri siti di legame del DNA, sono legate a specifiche aree genomiche. La proteina legata al DNA viene prima reticolata usando la formaldeide. Questo è seguito dall'isolamento della cromatina. La cromatina isolata viene tranciata a frammenti di 500 bp mediante sonicazione o digestione della nucleasi e la proteina legata al DNA viene immunoprecipita utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Il cross-linking viene invertito e il DNA viene analizzato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la PCR quantitativa in tempo reale.
I risultati di ChIP hanno portato all'ipotesi che SMARCAL1 possa mediare la regolazione trascrizionale inducendo un cambiamento conformazionale nelle regioni promotrici di questi geni. Il mappatore QGRS e il software Mfold sono stati utilizzati per identificare il potenziale di queste regioni promotrici per formare strutture secondarie28,29. Il mappatore QGRS viene utilizzato per prevedere G-quadruplexes32, mentre Mfold33 analizza la capacità di una sequenza di formare strutture secondarie come gli stem-loop.
Dopo l'analisi della struttura secondaria, sono stati eseguiti ulteriori esperimenti in vitro con il recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), l'omologo bovino di SMARCAL1, purificato da Escherichia coli34. I saggi ATPasi sono stati eseguiti utilizzando ADAAD per stabilire che le sequenze di DNA identificate potrebbero agire come effettori28,29. Infine, è stata eseguita la spettroscopia CD per monitorare i cambiamenti conformazionali indotti nella molecola di DNA da ADAAD28,29.
Per dimostrare che l'attività ATPasi della proteina era essenziale per indurre un cambiamento conformazionale nella molecola del DNA, è stato aggiunto acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) al chelato Mg+2 o ATPasi attiva DNA-dipendente A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), un inibitore specifico della proteina SWI/SNF35,36 . Questa tecnica spettroscopica CD può essere utilizzata con qualsiasi proteina purificata che è stata dimostrata da ChIP o qualsiasi altro test pertinente per legarsi a una regione genomica prevista di un promotore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

La spettroscopia del dicroismo circolare (CD) è un metodo semplice e conveniente per studiare la struttura secondaria e le interazioni delle biomolecole. I recenti progressi nella spettroscopia CD hanno permesso lo studio delle interazioni DNA-proteina e delle dinamiche conformazionali del DNA in diversi microambienti in dettaglio per una migliore comprensione della regolazione trascrizionale in vivo. L'area intorno a una potenziale zona di trascrizione deve essere srotolata affinché si verifichi la trascrizione. Questo è un processo complesso che richiede il coordinamento delle modificazioni istoniche, il legame del fattore di trascrizione al DNA e altre attività di rimodellamento della cromatina. Utilizzando la spettroscopia CD, è possibile studiare i cambiamenti conformazionali nella regione del promotore causati da proteine regolatrici, come i rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, per promuovere la trascrizione. Anche i cambiamenti conformazionali che si verificano nella proteina possono essere monitorati. Inoltre, le domande riguardanti l'affinità della proteina verso il suo DNA bersaglio e la specificità della sequenza possono essere affrontate incorporando mutazioni nel DNA bersaglio. In breve, la comprensione unica di questo metodo sensibile e poco costoso può prevedere i cambiamenti nella dinamica della cromatina, migliorando così la comprensione della regolazione trascrizionale.

ADAAD stabilizza una struttura simile a un anello di stelo sul promotore MYC Precedenti prove sperimentali hanno dimostrato che SMARCAL1 è un regolatore negativo di MYC29. L'analisi della regione del promotore lungo 159 bp del gene MYC da parte del mappatore QGRS ha mostrato che il filamento in avanti aveva il potenziale per formare un G-quadruplex (Tabella 2). Mfold ha mostrato che entrambi i filam...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Il protocollo ci permette di visualizzare i cambiamenti nella seconda ristrutturazione del DNA indotti dalle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti. Il cambiamento nella struttura del DNA può essere correlato alla regolazione della trascrizione. Questa è una tecnica facile e altamente sensibile che utilizza una quantità molto piccola di DNA puro per registrare i cambiamenti strutturali nell'oligonucleotide.Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione della trascrizione mediata dalle proteine di rimodellamento della cromatina dipendenti dall'ATP. Per iniziare, preparare le concentrazioni di lavoro dei tamponi e di altri componenti di reazione freschi e mantenerli a quattro gradi Celsius prima di impostare le reazioni, quindi misurare l'attività ATPasi della proteina in presenza di diverse molecole di DNA utilizzando un test di ossidazione accoppiato NADH. Mescolare ADAAD 0,1 millimolari, ATP due millimolari, DNA nanomolare 10 e tampone REG 1X in una piastra da 96 pozzetti per un volume finale di 250 microlitri.Quindi, incubare la reazione per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius, quindi misurare la quantità di NAD + utilizzando il software fornito insieme al lettore di micropiastre. Per misurare l'assorbanza a 340 nanometri, fare clic sul test NADH e posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra nello strumento, quindi fare clic sul pulsante della piastra di lettura per registrare l'assorbanza. Raccogli gli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza.Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche. Per pulire le cuvette, lavarle con acqua più volte, quindi eseguire una scansione dell'acqua o tamponare nella cuvetta per verificare se è pulita. Per le reazioni, utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati da PAGE.Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio. Per un raffreddamento lento, dopo aver riscaldato il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti, lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente ad una velocità di un grado Celsius al minuto. Per registrare gli spettri basali, impostare un totale di cinque reazioni di controllo una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.Mantenere il volume di reazione a 300 microlitri in tutte le reazioni. Per registrare gli spettri cd, impostare un totale di cinque reazioni sperimentali una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri. Per registrare la scansione, accendere il gas e accendere lo spettrometro CD.Dopo 10-15 minuti, accendere la lampada, accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del supporto a 37 gradi Celsius. Quindi, apri il software dello spettro CD e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius, l'intervallo di lunghezze d'onda da 180 a 300 nanometri, il tempo per punto a 0,5 secondi e il numero di scansione a cinque, quindi fai clic sul visualizzatore di dati pro, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli dell'esperimento e la data. Quindi, mescolare la linea di base e le reazioni sperimentali mediante pipettaggio e trasferire con cura le miscele di reazione una per una alla cuvetta, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.Se si esegue un esperimento di corso temporale, incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per il tempo richiesto, quindi eseguire la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, magnesio e proteine per fermare l'idrolisi dell'ATP. Per inibire completamente l'attività dell'ATPasi, aumentare la concentrazione di EDTA e il tempo di incubazione.Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software e levigare i dati nel software dello spettro CD o nel software di tracciamento dei dati, quindi tracciare un grafico di lunghezza d'onda contro l'ellitticità media dei residui e analizzare i picchi. Le pieghe M hanno mostrato che entrambi i filamenti del DNA MYC potrebbero formare una struttura simile a un anello dello stelo. Le strutture M-fold della sequenza di DNA anteriore e inversa contenente il G quadruplex GECE sono mostrate qui.Gli spettri CD di GECE raffreddato velocemente in assenza e presenza di ATP e ADAAD hanno dimostrato che ADAAD induce due picchi positivi, uno a 258 nanometri e l'altro a 210 nanometri. L'aggiunta dell'EDTA abroga questo cambiamento conformazionale. Gli spettri CD hanno ora un picco negativo di 210 nanometri e un'ampia banda positiva con picchi a 230 e 250 nanometri.L'analisi del mappatore QGRS e dell'M-fold ha mostrato che le regioni promotori di DROSHA, DGCR8 e DICER possiedono il potenziale per formare strutture G quadruplex e stem-like. Gli spettri CD della coppia DROSHA cinque hanno mostrato che ADAAD induce un picco negativo a 210 nanometri e un picco positivo a 260 nanometri. Questo spettro è una caratteristica dell'ADNA.Gli spettri CD della coppia DGCR8 uno hanno mostrato un picco positivo a 210 nanometri e un ampio picco negativo a 260 nanometri. Questo spettro è caratteristico della transizione da B a X. Per la coppia DGCR8 sette, sono stati osservati forti picchi positivi a 210 e 270 nanometri e un picco negativo a 250 nanometri.Questo spettro è caratteristico delle strutture parallele G quadruplex DNA. Infine, per la coppia DICER uno, sono stati osservati un picco positivo a 210 nanometri e due picchi negativi, uno a 230 nanometri e l'altro a 260 nanometri. Questi picchi sono caratteristici di una transizione del DNA da A a X.Assicurarsi che la purezza del DNA e delle proteine sia pari o superiore al 99%. La cuvetta deve essere pulita e la linea di base deve essere inferiore a un millidegree. Tutti i reagenti devono essere puri in modo che lo sfondo sia inferiore a un millidegree.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ricerca

Biochimica

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...