Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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CD分光度計に対して、JNUの先端計測研究施設に感謝したいと考えています。V.J.とA.D.はCSIRのフェローシップによって支えられました。

1. 反応成分の働き濃度
<ol><li>CDやその他の反応成分のバッファーの作業濃度を新たに準備し( 表1参照)、4°Cに保ってから反応を設定します。 注:この論文に記載されているCD反応の場合、成分の働く濃度は次のとおりです: リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, プロテイン 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol>2. ATPa...

本稿の目的は、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質の存在下でDNAに生じる立体構造変化を研究し、これらの構造変化を遺伝子発現に結びつける手法としてCD分光法を紹介することにある。CD分光法は、DNAの立体構造変化を研究するための迅速かつ容易にアクセス可能な方法を提供します。

この技術に考慮されるべき重要なポイントは、DNAとタンパク質の純度?...

円二色性(CD)は、右利きと左利きの円偏光の差動吸収につながる生体高分子の固有のキラリティに依存する分光技術です。この差動吸収は、円形のジクロリズムとして知られています。したがって、この技術は、キラルセンター1,2を含むタンパク質およびDNAなどの生物学的高分子の立体構造を表現するために使用することができる。
電磁波には、電気と磁気の両方のコンポーネントが含まれています。電気と磁界は、波の伝播方向に対して垂直に振動します。偏光のない光の場合、これらのフィールドは多くの方向に振動します。光が円偏光すると、互いに90°位相差で2つの電磁場が得られます。キラル分子は、右利きの円偏光と左利きの円偏光を異なる範囲に吸収するような円状の光学回転(複屈折)を示す3。得られた電界は、波長の関数である楕円としてトレースされます。このCDスペクトルは、このように、楕円度(q)として記録され、データは波長の関数として平均残基楕円度として提示される。
タンパク質の場合、アミノ酸のCα(グリシンを除く)はキラルであり、これはCD分光法によって利用され、この高分子4の二次構造を決定する。タンパク質分子のCDスペクトルは、通常、遠紫外線範囲で記録されます。αヘリカルタンパク質は、222 nmおよび208 nmで2つの陰性バンドを有し、193 nm4で1つの正のピークを有する。抗平行βシート二次構造を有するタンパク質は、218 nmで負のピークを示し、195 nm4で正のピークを示す。無秩序な構造を有するタンパク質は、210 nm付近の低い楕円性と195 nm4で負のピークを示す。したがって、異なる二次構造の明確なピーク/バンドは、CDを作る変性とリガンド結合の間にタンパク質の二次構造に起こる構造変化を解明するための便利なツールです。
核酸には、糖分子、二次構造のヘリシティ、および環境中のDNAの長期三次配列の3つの源があります5,6。核酸のCDスペクトルは、典型的には190〜300 nm範囲5,6で記録される。DNAの各立体構造は、タンパク質と同様に特徴的なスペクトルを与えますが、ピーク/バンドは溶媒条件とDNA配列の違いのためにある程度変化する可能性があります7。最も一般的な形態であるB-DNAは、260〜280 nm前後の陽性ピークと245 nm6の周りの陰性ピークによって特徴付けられる。B型DNAのピーク/バンドは、塩基対が二重らせんに垂直であるため、一般的に小さく、分子に弱いキラリティを与える。A-DNAは260 nmで優勢な陽性ピークを与え、210 nm6の周りに陰性のピークを与える。左利きのらせんであるZ-DNAは、290nmで陰性バンドを与え、260 nm6の周りに正のピークを与える。このDNAはまた、205 nm6で非常に陰性のピークを与える。
これらの立体構造に加えて、DNAはトリプレックス、四重プレックス、ヘアピンを形成することができ、そのすべてがCD分光法によって区別することができる。並列G-quadruplexは260nmで優勢な正のバンドを与え、反平行G-quadruplexは260 nmで負のバンドを与え、290 nmで正のピークを与え、2つの形態の四重プレックス構造6を区別することを容易にする。トリプレックスは特徴的なスペクトル8を与えない。例えば、Na+ 存在下でG.G.CとT.A.T塩基対を含む分子内三重らせんを形成する可能性のある36ヌクレオチド長DNAのスペクトルは、240nmで強い陰性バンドを示し、広い陽性ピークを示す。広い正のピークは266、273、および286 nmの貢献を示す。Na+ およびZn+ の存在下での同じオリゴヌクレオチドは、4つの陰性バンド(213、238、266、および282 nm)および258nmで陽性のピークを示す。したがって、トリプレックスDNAのスペクトルは、塩条件に応じて変化する可能性がある8。
これらの立体構造に加えて、CDスペクトルはX-DNAと呼ばれる別の形態のDNAの同定を可能にした。X-DNAは、DNA配列に代替アデニンおよびチミン残基が含まれるときに形成される。X-DNAのCDスペクトルは250および280 nmの2つの陰性ピークを含んでいる。X-DNAに関する情報はほとんどないが、陽性スーパーコイル6,9のシンクとして機能すると推測されている。CDスペクトルの変化はまた、リガンドとタンパク質相互作用に関する詳細を明らかにすることができ、したがって、薬物タンパク質相互作用を検出するための分子方法の武器庫に追加された10、11、12、13、14。CDスペクトルは、折り畳みプロセス15中のタンパク質の二次構造の変化を監視するためにも使用されてきた。同様に、CDスペクトルは、リガンドとDNA相互作用の調査にも使用できる16,17。
CD分光法は、このように、DNAの構造の異なる形態を区別する容易で安価な方法であり、それほど安価ではない機器およびソフトウェアへのアクセスがある場合である。この方法は非常に敏感で迅速です。少量のDNAしか必要としないため、核磁気共鳴(NMR)分光法の代替技術に優位性を与えます。リガンドや基質を用いた滴定も容易に行えます。主な制約は、DNAが非常に純粋でなければならないということです。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製DNAを使用することをお勧めします。
CDスペクトルによって得られた情報は、主にタンパク質の構造特徴を推測し、明確なDNA適合体を同定するために使用されてきました。本研究では、イン ビボ クロマチン免疫沈降(ChIP)実験から得られた結果を統合し、目的のタンパク質/予測転写因子がそのエフェクター遺伝子のプロモーター領域に立体構造変化をもたらすかどうかを示すために使用されています。このコラボレーションは、プロモーターの転写開始部位(TSS)とその周辺で予測された転写因子による転写調節機構を予測することにより、従来のCD分光技術の進行を助ける。
クロマチンリモデリングは、密に詰まったクロマチンを転写因子、DNA複製の構成要素、損傷修復タンパク質などの様々な調節因子にアクセスできるようにすることで、DNA代謝プロセスを調節することが知られている明確なメカニズムです。ATP依存クロマチンリモデル剤は、SWI/SNFファミリーのタンパク質とも呼ばれ、真核細胞に存在する主要なリモデルタンパク質である18,19です。系統的クラスタリングは、SWI/SNFファミリーのタンパク質を6つのサブグループ20に分類しました:Snf2のような、Swr1のような、SSO1653のような、Rad54のような、Rad5/16のような、そして遠く離れています。本研究で関心のあるタンパク質であるSMARCAL1は、遠方のサブグループ20に属する。このタンパク質は、CD分光法を用いた転写調節の様式を調べるのに用いられている。
ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質のメンバーのほとんどは、核酸を再位置または除去するか、またはATP依存的な様式でヒストン変異体交換を媒介することが示されている21,22。しかし、このファミリーの一部のメンバーは、例えばSMARCAL1のヌクレオソームを改造することが示されていない。SMARCAL1がポリテネ染色体と関連することが研究で示されているにもかかわらず、ヌクレオソームを改造する能力に関する実験的証拠は欠けている23。そこで、SMARCAL1はDNA24の立体構造を変化させることによって転写を調節する可能性があると仮定した。CD分光法は、この仮説を検証するための簡単でアクセス可能な方法を提供した。
SMARCAL1は、主にアニーリングヘリカーゼ25,26,27として機能するATP依存クロマチンリモデリングタンパク質です。DNAコンフォメーション24を改造して転写を変調するように仮定されている。この仮説を検証するために、ドキソルビシン誘発DNA損傷時の遺伝子転写を調節するSMARCAL1の役割を検討した。これらの研究では、SMARCAL1はインビボ分析とADAADのインビトロアッセイ28,29に使用されました。これまでの研究では、ADAADは構造に依存するが配列に依存しない方法でDNAを認識できることが示されています30,31。このタンパク質は、ステムループDNAと同様に、二本鎖を有するDNA分子と一本鎖転移領域に最適に結合し、ATP 30,31を加水分解する。
インビボ実験は、SMARCAL1がプロモーター領域28,29に結合することによってMYC、DROSHA、DGCR8およびDICERの発現を調節することを示した。相互作用の領域は、ChIP実験28,29によって同定された。ChIP技術は、細胞内の同一DNAとタンパク質の相互作用を分析するために使用されます。その目標は、プロモーターまたは他のDNA結合部位上の転写因子などの特定のタンパク質が特定のゲノム領域に結合しているかどうかを判断することです。DNAに結合したタンパク質は、ホルムアルデヒドを用いて最初に架橋される。その後、クロマチンの単離が続きます。分離されたクロマチンは、超音波処理またはヌクレアーゼ消化のいずれかによって500bp断片に切断され、DNAに結合したタンパク質は、タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降する。架橋は逆転し、DNAはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量的リアルタイムPCRを用いて分析されます。
ChIPの結果は、SMARCAL1がこれらの遺伝子のプロモーター領域の立体構造変化を誘導することによって転写調節を媒介する可能性があるという仮説につながった。QGRSマッパーおよびMfoldソフトウェアは、これらのプロモーター領域が二次構造を形成する可能性を同定するために使用された28,29。QGRSマッパーはG-quadruplexes32の予測に使用され、Mfold33はステムループなどの二次構造を形成するシーケンスの能力を分析します。
二次構造解析の後、さらにインビトロ実験を組換え6X Hisタグ付き活性DNA依存ATPase Aドメイン(ADAAD)、SMARCAL1のウシホモログ、大腸菌から精製したATPaseアッセイは、同定されたDNA配列がエフェクター28,29として作用し得ることを確立するためにADAADを用いて行った。最後に、ADAAD28,29によってDNA分子に誘導された立体構造変化をモニターするためにCD分光法を行った。
タンパク質のATPase活性がDNA分子の立体構造変化を誘導するために不可欠であることを証明するために、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)をキレートMg+2または活性DNA依存ATPase Aドメイン阻害剤ネオマイシン(ADAADiN)に添加した。.このCD分光技術は、プロモーターの予測ゲノム領域に結合するために、ChIPまたは他の任意の関連アッセイによって実証された任意の精製タンパク質と利用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

循環二色性(CD)分光法は、生体分子の二次構造と相互作用を調べるのに簡単で便利な方法です。CD分光法の最近の進歩により、さまざまな微小環境におけるDNA-タンパク質相互作用と立体構造ダイナミクスの研究が可能になり 、インビボにおける転写調節の理解が深くなっています。転写が起こるためには、転写領域の周囲の領域を巻き戻す必要があります。これは、ヒストン修飾の調整、DNAへの転写因子の結合、および他のクロマチンリモデリング活動を必要とする複雑なプロセスである。CD分光法を用いて、ATP依存クロマチンリモデル剤などの調節タンパク質によって引き起こされるプロモーター領域における立体構造変化を研究し、転写を促進することができる。タンパク質に生じる立体構造変化もモニターできる。また、標的DNAに対するタンパク質の親和性や配列特異性に関する問い合わせは、標的DNAに変異を組み込むことによって対処することができる。要するに、この敏感で安価な方法のユニークな理解は、クロマチンダイナミクスの変化を予測することができ、それによって転写調節の理解を改善する。

ADAADは、MYCプロモーター上の構造のようなステムループを安定化させる これまでの実験的証拠は、SMARCAL1がMYC29の陰性調節因子であることを示した。QGRSマッパーによるMYC遺伝子の159bp長いプロモーター領域の分析は、前方鎖がG-quadruplexを形成する可能性を有することを示した(表2)。Mfoldは、MYC DNA...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

このプロトコルにより、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって誘導されるDNAの再構成の変化を可視化することができます。DNA構造の変化は、転写調節と相関させることができる。これは、少量の純粋なDNAを使用してオリゴヌクレオチドの構造変化を記録する、簡単で高感度な技術です。この方法は、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって媒介される転写調節に関する洞察を提供することができる。まず、バッファーおよび他の反応成分の働く濃度を新たに調製し、反応を設定する前に摂氏4度に保ち、NADH結合酸化アッセイを用いて異なるDNA分子の存在下でタンパク質のATPase活性を測定する。0.1ミリモルADAAD、2ミリモルATP、10ナノモルDNA、1X REGバッファーを96ウェルプレートに250マイクロリットルの最終体積に混合します。次に、37°Cインキュベーターで30分間反応をインキュベートし、次にマイクロプレートリーダーと一緒に提供されるソフトウェアを使用してNAD+の量を測定する。340ナノメートルで吸光度を測定するには、NADHアッセイをクリックし、機器のプレートホルダーに96ウェルプレートを置き、読み取りプレートボタンをクリックして吸光度を記録します。高透明性のクオーツキュベットでCDスペクトルを収集します。長方形または円筒状のキュベットを使用します。キュベットをきれいにするには、水で数回洗浄してから、キュベット内の水またはバッファーのスキャンを行い、清潔かどうかを確認します。反応に対しては、PAGE精製DNAオリゴヌクレオチドを使用する。速い冷却のために、熱ブロックで3分間摂氏94度でDNAを加熱し、すぐに氷の上で冷却します。ゆっくり冷却する場合は、DNAを摂氏94度で3分間加熱した後、1分間に1度の速度で室温まで冷却します。ベースラインスペクトルを記録するには、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの制御反応を設定します。すべての反応で300マイクロリットルで反応量を保ちます。CDスペクトルを記録するために、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの実験反応を設定する。スキャンを記録するには、ガスの電源を入れ、CD分光器のスイッチを入れます。10~15分後、ランプのスイッチを入れ、水浴のスイッチを入れ、ホルダーの温度を摂氏37度に設定します。次に、CDスペクトルソフトウェアを開き、温度を摂氏37度、波長範囲を180~300ナノメートル、ポイント当たりの時間を0.5秒、スキャン数を5に設定し、プロデータビューアをクリックして新しいファイルを作成し、実験の詳細と日付に変更します。次に、ピペット処理によりベースライン反応と実験反応を混合し、反応ミックスを1つずつキュベットに慎重に移し、気泡がないことを確認します。タイムコース実験を行う場合は、必要な時間に摂氏37度で反応をインキュベートし、スキャンを行います。DNA、ATP、マグネシウム、およびタンパク質を含むバッファーにEDTAを加え、ATP加水分解を停止します。ATPase活性を完全に阻害するには、EDTA濃度およびインキュベーション時間を増加させる。ソフトウェアの対応する反応からベースラインを引き、CDスペクトルソフトウェアまたはデータプロットソフトウェアのいずれかでデータを平滑化し、平均残基楕円度に対して波長のグラフをプロットし、ピークを分析します。M折り畳みは、MYC DNAの両方の鎖が茎ループ状の構造を形成できることを示した。G四重体GECEを含む前進および逆DNA配列のM折り構造をここに示す。ATPとADAADの不在時に急速に冷却されたGECEのCDスペクトルは、ADAADが258ナノメートルで1つと210ナノメートルで他の2つの正のピークを誘発することを示した。EDTAの追加は、この立体構造変化を和らげる。CDスペクトルは現在、負の210ナノメートルのピークと230と250ナノメートルでピークを持つ広い正のバンドを持っています。QGRSマッパーおよびM折り解析は、DROSHA、DGCR8およびDICERのプロモーター領域が、G四重体およびステム様構造を形成する可能性を有することを示した。DROSHAペア5のCDスペクトルは、ADAADが210ナノメートルで負のピークを誘導し、260ナノメートルで正のピークを誘発することを示した。このスペクトルはADNAの特徴です。DGCR8ペア1のCDスペクトルは、210ナノメートルで正のピークを示し、260ナノメートルで広い負のピークを示した。このスペクトルはBからXへの遷移の特徴である。DGCR8ペア7では、210ナノメートルと270ナノメートルで強い正のピークと250ナノメートルでの負のピークが見られました。このスペクトルは、並列G四重体DNA構造の特徴である。最後に、DICERペア1では、210ナノメートルで正のピークと2つの負のピーク、1つは230ナノメートル、もう1つは260ナノメートルで観察された。これらのピークは、AからXへのDNA転移の特徴である。DNAとタンパク質の純度が99%以上であることを確認してください。キュベットは清潔で、ベースラインは1ミリ程度未満でなければなりません。すべての試薬は、背景が1ミリ度未満になるように純粋でなければなりません。

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