Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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저자는 CD 분광계에 대한 고급 계측 연구 시설, JNU에 감사드립니다. V.J.와 A.D.는 CSIR의 펠로우십에 의해 지원되었습니다.

1. 반응 성분의 작동 농도
<ol><li>CD 및 기타 반응 구성 요소에 대한 버퍼의 작업 농도를 신선하게 준비( 표 1 참조)하고 반응을 설정하기 전에 4°C에서 유지합니다. 참고: 본 논문에 기재된 CD 반응의 경우, 성분의 작동 농도는 다음과 같습니다: 나트륨 인산염 버퍼(pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, 단백질 1 μM, MgCl2 10mMM, EDTA 50mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol>...

이 문서의 목적은 ATP 의존 염색질 리모델링 단백질의 존재에 DNA에서 발생하는 형성 변화를 연구하고 유전자 발현에 이러한 형태 변화를 연결하는 접근법으로 CD 분광법을 도입하는 것입니다. CD 분광법은 DNA의 형성 변화를 연구하는 빠르고 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제공합니다.

이 기술에 대 한 고려 될 중요 한 포인트는 DNA와 단백질의 순도. DNA와 단백질이 모두 >95% ?...

원형 이색성(CD)은 오른손잡이와 왼손잡이 원형 편광광의 차동 흡수로 이어지는 생물학적 거대 분자의 고유치랄성에 의존하는 분광 기술입니다. 이 차동 흡수는 원형 이분해증으로 알려져 있습니다. 따라서 이 기술은 단백질 및 DNA와 같은 생물학적 거대 분자의 형성을 묘사하는 데 사용될 수 있으며, 둘 다 키랄 센터를 포함1,2.
전자파에는 전기 및 자기 구성 요소가 모두 포함되어 있습니다. 전기및 자기장은 모두 파도 전파 방향에 수직으로 진동합니다. 편광되지 않은 빛의 경우, 이 필드는 여러 방향으로 진동합니다. 빛이 원형으로 편광되면 두 개의 전자기장이 서로 90° 위상 차이로 얻어집니다. 키랄 분자는 원형 광학 회전(birefringence)을 보여 주어 오른손잡이 원형 편광광과 왼손잡이 원형 편광광을 다른 범위3로 흡수합니다. 결과 전기장은 파장의 함수인 타원으로 추적됩니다. 따라서 CD 스펙트럼은 타원형(q)으로 기록되며, 데이터는 파장의 함수로서 평균 잔류물 타원형으로 제시된다.
단백질의 경우, 아미노산의 Cα(글리신 제외)는 치랄이며, 이는 이러한 거대 분자4의 이차 구조를 결정하기 위해 CD 분광법에 의해 이용된다. 단백질 분자의 CD 스펙트럼은 전형적으로 극UV 범위에서 기록됩니다. α-헬리칼 단백질은 222nm와 208nm에서 2개의 네거티브 밴드와 193 nm4에서 1개의 긍정적인 피크를 가지고 있습니다. 항병렬 β 시트 이차 구조를 가진 단백질은 218 nm에서 음수 피크와 195 nm4에서 양수 피크를 보여줍니다. 무질서한 구조물을 가진 단백질은 210 nm 의 가까운 낮은 타원형및 195 nm4에서 음성 피크를 보여줍니다. 따라서, 상이한 이차 구조물을 위한 잘 정의된 피크/대역은 CD를 데만리간 결합뿐만 아니라 데칭 하는 동안 단백질의 이차 구조에서 발생하는 형태 변화를 해명하는 편리한 도구이다.
핵산에는 설탕 분자, 이차 구조의 헬리콥터, 환경에서 DNA의 장거리 삼차 순서의 세 가지 소스가 있습니다5,6. 핵산의 CD 스펙트럼은 전형적으로 190 nm 범위에서 기록된다5,6. 단백질과 마찬가지로 DNA의 각 형태는 특징적인 스펙트럼을 제공하지만 피크/밴드는 용매 조건 및 DNA 서열의 차이로 인해 다소 다양할 수 있습니다7. B-DNA, 가장 일반적인 형태, 주위 긍정적인 피크 주위 260-280 nm와 주위 부정적인 피크 245 nm6 특징. B형 DNA의 피크/밴드는 일반적으로 작기 때문에 기본 쌍은 이중 나선에 수직이되어 분자에 약한 키랄성을 부여합니다. A-DNA는 260 nm에서 지배적 인 긍정적 인 피크와 210 nm6 주위에 음수 피크를 제공합니다. 왼손잡이 나선 인 Z-DNA는 290 nm에서 음수 밴드와 260 nm6 정도의 긍정적 인 피크를 제공합니다. 이 DNA는 또한 205 nm6에서 극단적으로 부정적인 피크를 줍니다.
이러한 적합성 외에도 DNA는 트리플엑스, 쿼드러플렉스 및 헤어핀을 형성할 수 있으며, 이 모든 것은 CD 분광학으로 구별될 수 있습니다. 평행 G 쿼드러플렉스는 260nm에서 지배적인 포지티브 밴드를 제공하며, 반병렬 G-쿼드루플렉스는 260nm에서 음수 대역과 290nm의 양수 피크를 제공하므로 두 형태의 쿼드러플렉스 구조를 쉽게 구별할 수 있습니다6. 트리플렉스는 특징적인 스펙트럼을 제공하지 않습니다8. 예를 들어, Na+ 의 존재에서 G.G.C 및 T.A.T 염기 쌍을 포함하는 분자 내 삼중 나선을 형성할 수 있는 잠재력을 가진 36개의 뉴클레오티드 길이 DNA의 스펙트럼은 240 nm및 넓은 양성 피크에서 강한 음수 대역을 나타낸다. 광범위한 긍정적 인 피크는 266, 273 및 286 nm의 기여를 보여줍니다. Na+ 및 Zn+ 의 존재에 동일한 올리고뉴클레오티드는 네 개의 네 개의 네거티브 밴드 (213, 238, 266 및 282 nm)와 258 nm에서 긍정적 인 피크를 보여줍니다. 따라서, 트리플렉스 DNA의 스펙트럼은 염조건에 따라 달라질 수 있다8.
이러한 적합성 외에도 CD 스펙트럼은 X-DNA라는 또 다른 형태의 DNA를 식별할 수 있게 되었습니다. X-DNA는 DNA 서열에 대체 아데닌 및 티민 잔류물이 포함될 때 형성됩니다. X-DNA의 CD 스펙트럼은 250 및 280 nm에서 두 개의 네거티브 피크를 포함합니다. 아주 작은 정보는 X-DNA에 관하여 유효합니다, 긍정적인 supercoiling6,9를 위한 싱크로 작동하기 위하여 추측되고 있더라도. CD 스펙트럼의 변화는 또한 리간드 단백질 상호 작용에 대한 세부 사항을 밝힐 수 있고, 그러므로, 약물 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분자 방법의 무기고에 추가되었습니다10,11,12,13,14. CD 스펙트럼은 또한 접이식 과정 동안 단백질의 이차 구조의 변화를 모니터링하는 데 사용되어 왔다15. 유사하게, CD 스펙트럼은 또한 리간드 DNA 상호 작용을 탐구하기 위해 사용될 수 있습니다16,17.
따라서 CD 분광학은 저렴하지 않은 장비 및 소프트웨어에 대한 액세스가 제공되므로 다양한 형태의 DNA 형태를 구별하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 이 방법은 매우 민감하고 빠를 수 있습니다. 소량의 DNA만 필요하므로 핵 자기 공명(NMR) 분광법의 대체 기술에 우위를 부여합니다. 리간드 및 기판의 적정도 쉽게 수행할 수 있습니다. 주요 제약 조건은 DNA가 매우 순수해야한다는 것입니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(PAGE)-정제 DNA를 사용하는 것이 좋습니다.
CD 스펙트럼에 의해 얻은 정보는 주로 단백질 구조적 특징을 추론하고 뚜렷한 DNA 순응자를 식별하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서, CD 스펙트럼은 관심/예측 전사 인자의 단백질이 그 이펙터 유전자의 프로모터 영역에서 형성 변화를 가져올 수 있는지 여부를 규명하기 위해 생체 내 크로마티면역 침전(ChIP) 실험에서 얻은 결과를 통합하는 데 사용되어 왔다. 이러한 협업은 프로모터의 전사 시작 부위(TSS) 전후에 예측된 전사 계수에 의한 전사 조절 메커니즘을 예측함으로써 전통적인 CD 분광 기술의 진행을 지원합니다.
크로마티닌 리모델링은 전사 인자, DNA 복제 성분 또는 손상 수리 단백질과 같은 다양한 조절 요인에 단단히 포장된 크로마틴을 가능하게 함으로써 DNA 대사 과정을 조절하는 것으로 알려진 잘 정의된 메커니즘이다. 또한 단백질의 SWI/SNF 가족으로 알려진 ATP 의존적인 크로마틴 리모델링제는 진핵 세포에 존재하는 주요 리모델링 단백질18,19입니다. 필로유전 적 클러스터링은 SWI/SNF 단백질 제품군을 6하위 그룹으로 분류했습니다: Snf2 유사, Swr1 유사, SSO1653 유사, Rad54 유사, Rad5/16 유사, 먼. SMARCAL1, 이 연구에 관심있는 단백질, 먼 하위 그룹에 속한다20. 이 단백질은 CD 분광법을 사용하여 전사 조절의 그것의 모드를 조사하기 위하여 이용되었습니다.
ATP 의존형 크로마틴 리모델링 단백질의 대부분의 구성원은 ATP 의존식 방식으로 뉴클레오좀을 재배치하거나 퇴거시키거나 히스톤 변이체 교환을 중재하는 것으로 나타났다21,22. 그러나, 이 가족의 몇몇 일원은 뉴클레오좀, 예를 들면, SMARCAL1를 리모델링하기 위하여 나타나지 않았습니다. 비록 연구 SMARCAL1 폴리텐 염색체와 연결, 뉴 클레 오 좀 을 리모델링 하는 능력에 관한 실험적인 증거는 부족 23. 따라서, SMARCAL1은 DNA24의 변형을 변경하여 전사를 조절할 수 있다고 가정하였다. CD 분광법은 이 가설을 검증하는 쉽고 접근 가능한 방법을 제공했습니다.
SMARCAL1은 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질로, 주로 아닐링 헬리케이스25,26,27로 기능합니다. DNA 형성을 리모델링하여 전사를 조절하도록 가정하였다24. 이러한 가설을 시험하기 위해 독소루비신 유발 DNA 손상 중 유전자 전사 조절에서 SMARCAL1의 역할이 연구되었다. 이러한 연구에서, SMARCAL1 생체 내 분석 및 ADAAD에서 체외 분석에 대 한 사용 되었다28,29. 이전 연구는 ADAAD구조 의존적이지만 서열 독립적 인 방식으로 DNA를 인식 할 수 있음을 보여 주었다30,31. 단백질은 줄기 루프 DNA와 유사한 단일 가닥 전이 지구에 이중 가닥을 소유한 DNA 분자에 최적으로 결합하고, ATP 30,31을 가수분해합니다.
생체 내 실험에서 SMARCAL1은 프로모터 영역에 결합하여 MYC, DROSHA, DGCR8 및 DICER의 발현을 조절하는 것으로 나타났다28,29. 상호 작용영역은 ChIP 실험28,29에 의해 확인되었다. ChIP 기술은 세포 내의 cognate DNA를 가진 단백질의 상호 작용을 분석하기 위하여 이용됩니다. 그것의 목표는 프로모터 또는 그밖 DNA 결합 사이트에 전사 요인과 같은 특정 단백질이 특정 게놈 지역에 묶는지 결정하는 것입니다. DNA에 결합된 단백질은 포름알데히드를 사용하여 처음으로 교차 연결됩니다. 그 다음에는 크로마틴의 격리가 뒤따릅니다. 분리된 크로마틴은 초음파 처리 또는 핵소화에 의해 500bp 단편으로 전염되고, DNA에 결합된 단백질은 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 면역침전화된다. 교차 연결은 반전되고, DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 정량적 실시간 PCR을 사용하여 분석된다.
ChIP 결과는 SMARCAL1이 이 유전자의 발기인 지구에 있는 형성 변경을 유도해서 전사 적 규정을 중화할 가능성이 있다는 가설로 이끌어 냈습니다. QGRS 매퍼 및 Mfold 소프트웨어는 이러한 프로모터 영역의 잠재력을 식별하여 이차 구조를 형성하는 데 사용되었습니다28,29. QGRS 매퍼는 G-쿼드러플렉스32를 예측하는 데 사용되며 Mfold33은 서열의 능력을 분석하여 줄기 루프와 같은 보조 구조를 형성합니다.
이차 구조 분석 후, 추가 체외 실험은 재조합 6X 그의 태그활성 DNA 의존ATPase A 도메인(ADAAD), SMARCAL1의 소 호모로, 에스케리치아 대장균34로부터 정제하였다. ATPase assays는 확인된 DNA 순서가 effectors28,29로 작동할 수 있다는 것을 확립하기 위하여 ADAAD를 사용하여 수행되었습니다. 마지막으로, CD 분광법은 ADAAD28,29에 의해 DNA 분자에서 유도된 형성적 변화를 모니터링하기 위해 수행되었다.
단백질의 ATPase 활성이 DNA 분자의 형태 변화를 유도하는 데 필수적이었다는 것을 증명하기 위해, 에틸렌디아민 테트라아세아세트산(EDTA)을 Mg+2 또는 활성 DNA 의존성 ATPase 도메인 억제제 네오마이신(ADAADiN)에 첨가하였으며, SWI/SNF 단백질의 특정 억제제, 3655추가되었다. . 이러한 CD 분광 기술은 ChIP 또는 다른 관련 분석체가 프로모터의 예측된 게놈 영역에 결합하기 위해 입증된 정제된 단백질과 함께 활용할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

원형 이색성 (CD) 분광법은 생체 분자의 이차 구조 및 상호 작용을 조사하는 간단하고 편리한 방법입니다. CD 분광기의 최근 발전은 생체 내 전사 조절에 대한 이해를 위해 다양한 미세 환경에서 DNA 단백질 상호 작용 및 변형 역학에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 잠재적인 전사 영역 주위 영역이 전사가 발생하기 위해 풀려나야 합니다. 이것은 히스톤 수정, DNA에 전사 인자의 결합 및 기타 크로마틴 리모델링 활동의 조정을 요구하는 복잡한 과정입니다. CD 분광학을 사용하여 ATP 의존 성 크로마틴 리모델링기와 같은 규제 단백질에 의한 프로모터 영역의 형성 적 변화를 연구하여 전사를 촉진할 수 있습니다. 단백질에서 발생하는 형성 적 변화는 또한 모니터링 될 수있다. 또한, 표적 DNA를 향한 단백질의 친화성 및 서열 특이성에 관한 질의는 표적 DNA에 돌연변이를 통합하여 해결할 수 있다. 요컨대, 이 민감하고 저렴한 방법의 고유 한 이해는 크로마틴 역학의 변화를 예측하여 전사 조절의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

ADAAD는 MYC 프로모터의 구조와 같은 줄기 루프를 안정화시합니다. 이전 실험 증거는 SMARCAL1MYC29의 부정적인 레귤레이터는 것으로 나타났습니다. QGRS 매퍼에 의한 MYC 유전자의 159bp 장기 프로모터 영역을 분석한 결과, 전방 가닥이 G-쿼드러플렉스(표 2)를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었다. Mfo...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

이 프로토콜을 통해 ATP 의존성 크로마틴 리모델링 단백질에 의해 유도된 DNA의 두 번째 재구성의 변화를 시각화할 수 있습니다. DNA 구조의 변화는 전사 조절과 상관관계가 있을 수 있다. 이것은 올리고뉴클레오티드의 구조적 변화를 기록하기 위해 매우 적은 양의 순수 DNA를 사용하는 쉽고 매우 민감한 기술입니다.이 방법은 ATP 의존크롬질 단백질에 의해 중재된 전사 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 시작하려면, 완충및 기타 반응 성분의 작업 농도를 신선하게 준비하고 반응을 설정하기 전에 섭씨 4도에서 보관한 다음 NADH 결합 산화 분석기를 사용하여 다른 DNA 분자의 존재시 단백질의 ATPase 활성을 측정합니다. 0.1 밀리몰러 ADAAD, 2개의 밀리몰러 ATP, 10 나노몰러 DNA 및 1X REG 버퍼를 96웰 플레이트에 혼합하여 250 마이크로리터의 최종 부피로 혼합합니다.다음으로, 37도 인큐베이터에서 30분 동안 반응을 배양한 다음 마이크로플레이트 판독기와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 NAD+의 양을 측정합니다. 340 나노미터에서 흡광도를 측정하려면 NADH 분석기를 클릭하고 96웰 플레이트를 기기의 플레이트 홀더에 놓고 판독 플레이트 버튼을 클릭하여 흡광도를 기록합니다. 투명도가 높은 쿼츠 큐벳에서 CD 스펙트럼을 수집합니다.직사각형 또는 원통형 큐벳을 사용합니다. 큐벳을 청소하려면 물로 여러 번 씻은 다음 큐벳의 물 이나 버퍼스캔을 통해 깨끗한지 확인하십시오. 반응을 위해, PAGE 정제 된 DNA 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다.빠른 냉각을 위해 가열 블록에서 3 분 동안 94섭씨에서 DNA를 가열하고 얼음위에서 즉시 식힙니다. 느린 냉각을 위해, 3 분 동안 섭씨 94도에서 DNA를 가열 한 후 분당 섭씨 1도의 속도로 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 기준선 스펙트럼을 기록하려면 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 하나씩 총 5개의 대조군 반응을 설정합니다.모든 반응에서 300 마이크로 리터의 반응 볼륨을 유지합니다. CD 스펙트럼을 기록하려면 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 하나씩 총 5개의 실험 반응을 설정합니다. 스캔을 기록하려면 가스를 켜고 CD 분광기를 켭니다.10~15분 후 램프를 켜고 수조를 켜고 홀더 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 다음으로, CD 스펙트럼 소프트웨어를 열고 온도를 섭씨 37도로 설정하고, 파장 범위는 180~300나노미터로 설정하고, 포인트당 시간내지 0.5초로, 스캔 번호를 5로 설정한 다음, 프로 데이터 뷰어를 클릭하고, 새 파일을 만들고, 실험 및 날짜의 세부 정보로 이름을 바꿉니다. 다음으로, 배관하여 기준선과 실험 반응을 혼합하고 조심스럽게 반응을 큐벳에 하나씩 혼합하여 기포가 없도록 합니다.시간 과정 실험을 수행하는 경우, 필요한 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양한 다음 스캔을 수행하십시오. ATP 가수분해를 중지하기 위해 DNA, ATP, 마그네슘 및 단백질을 포함하는 완충제에 EDTA를 추가합니다. ATPase 활성을 완전히 억제하려면 EDTA 농도 및 인큐베이션 시간을 증가시면 됩니다.소프트웨어의 해당 반응에서 기준선을 빼고 CD 스펙트럼 소프트웨어 또는 데이터 플로팅 소프트웨어에서 데이터를 부드럽게 한 다음 평균 잔류성 타원형에 대한 파장 그래프를 플롯하고 피크를 분석합니다. M-folds는 MYC DNA의 두 가닥이 줄기 루프와 같은 구조를 형성할 수 있음을 보여주었습니다. G 쿼드러플렉스 GECE를 포함하는 전방 및 역DNA 서열의 M 접이식 구조는 여기에 도시된다.ATP와 ADAAD의 부재 와 존재에서 빠른 냉각 GECE의 CD 스펙트럼은 ADAAD가 258 나노미터에서 하나, 다른 하나는 210 나노미터에서 두 개의 긍정적 인 피크를 유도하는 것으로 나타났다. EDTA의 추가는 이 형태 변화를 무효화합니다. CD 스펙트럼은 이제 음수 210 나노미터 피크와 230 및 250 나노미터의 피크를 가진 광범위한 양성 대역을 가지고 있습니다.QGRS 매퍼 및 M-fold 분석은 DROSHA, DGCR8 및 DICER의 프로모터 영역이 G 쿼드러플렉스 및 줄기와 같은 구조를 형성할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. DROSHA 쌍 5의 CD 스펙트럼은 ADAAD가 210 나노미터에서 음수 피크를 유도하고 260 나노미터에서 양성 피크를 유도한다는 것을 보여주었습니다. 이 스펙트럼은 ADNA의 특징입니다.DGCR8 쌍의 CD 스펙트럼은 210 나노미터에서 양성 피크와 260 나노미터에서 넓은 음수 피크를 보였다. 이 스펙트럼은 B에서 X 로의 전환의 특징입니다. DGCR8 쌍 7의 경우 210 및 270 나노미터에서 강한 양성 피크와 250 나노미터의 음수 피크가 보였습니다.이 스펙트럼은 병렬 G 쿼드러플렉스 DNA 구조의 특징입니다. 마지막으로, DICER 쌍 1의 경우 210 나노미터및 2개의 음수 피크에서 양성 피크가 230나노미터이고 다른 하나는 260 나노미터에서 관찰되었다. 이 봉우리들은 A에서 X DNA 전환의 특징입니다.DNA와 단백질의 순도가 99% 이상인지 확인합니다. 큐벳은 깨끗해야 하며 기준선은 1밀리도 미만이어야 합니다. 배경이 1밀리도 미만이되도록 모든 시약은 순수해야 합니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...