Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

Forfatterne vil takke Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, for CD-spektrofotometeret. V.J. og A.D. ble støttet av et fellesskap fra CSIR.

1. Arbeidskonsentrasjon av reaksjonskomponentene
<ol><li>Forbered arbeidskonsentrasjonene av buffere for CD og andre reaksjonskomponenter ferskt (se tabell 1) og hold dem ved 4 °C før du setter opp reaksjonene. MERK: For CD-reaksjonene som er beskrevet i dette dokumentet, er arbeidskonsentrasjonene av komponenter som følger: Natriumfosfatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol><s...

Hensikten med denne artikkelen er å introdusere CD-spektroskopiteknikken som en tilnærming for å studere konformasjonsendringene som forekommer i DNA i nærvær av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner og å koble disse konformasjonsendringene til genuttrykk. CD-spektroskopi gir en rask og lett tilgjengelig metode for å studere konformasjonsendringene i DNA.

Et avgjørende poeng å vurdere for denne teknikken er renheten til DNA og protein. Det anbefales å sikre at både DNA o...

Sirkulær dikroisme (CD) er en spektroskopisk teknikk som er avhengig av den iboende chiraliteten til biologiske makromolekyler som fører til differensialabsorpsjon av høyrehendt og venstrehendt sirkulært polarisert lys. Denne differensialabsorpsjonen er kjent som sirkulær dikroisme. Teknikken kan derfor brukes til å avgrense konformasjonen av biologiske makromolekyler, som proteiner og DNA, som begge inneholder kirale sentre1,2.
Elektromagnetiske bølger inneholder både elektriske og magnetiske komponenter. Både de elektriske og magnetfeltene svinger vinkelrett på bølgeforplantningsretningen. Når det gjelder uppolarisert lys, svinger disse feltene i mange retninger. Når lyset polariseres sirkulært, oppnås to elektromagnetiske felt ved 90° faseforskjell til hverandre. Kirale molekyler viser sirkulær optisk rotasjon (birefringence) slik at de vil absorbere høyrehendt sirkulært polarisert lys og venstrehånds sirkulært polarisert lys i forskjellige omfang3. Det resulterende elektriske feltet vil bli sporet som en ellipse, en funksjon av bølgelengden. CD-spekteret er dermed registrert som elliptikk (q), og dataene presenteres som Mean Residue Ellipticity som en funksjon av bølgelengde.
Når det gjelder proteiner, er Cα av aminosyrer (unntatt glycin) chiral, og dette utnyttes av CD-spektroskopi for å bestemme den sekundære strukturen til denne makromolekylen4. CD-spektraet av proteinmolekyler registreres vanligvis i Fjern UV-serien. α-spiralformede proteiner har to negative bånd på 222 nm og 208 nm og en positiv topp på 193 NM4. Proteiner med anti-parallell β-arks sekundær struktur viser en negativ topp på 218 nm og en positiv topp på 195 nm4. Proteiner med uordnede strukturer viser lav elliptikk nær 210 nm og en negativ topp på 195 nm4. Dermed gjør den veldefinerte toppen / båndene for forskjellige sekundære strukturer CD til et praktisk verktøy for å belyse konformasjonsendringene som forekommer i proteinens sekundære struktur under denaturering samt ligandbinding.
Nukleinsyrer har tre kilder til chiralitet: sukkermolekylet, mykheten til sekundærstrukturen og den langtrekkende tertiære bestillingen av DNA i miljøet5,6. CD-spektra av nukleinsyrer registreres vanligvis i området 190 til 300 nm, 5,6. Hver konformasjon av DNA, akkurat som proteiner, gir et karakteristisk spektrum, selv om toppene / båndene kan variere i noen grader på grunn av løsningsmiddelforhold og forskjeller i DNA-sekvenser7. B-DNA, den vanligste formen, er preget av en positiv topp rundt 260-280 nm og en negativ topp rundt 245 nm6. Toppene/båndene til B-form DNA er generelt små fordi baseparene er vinkelrett på den doble helixen, og gir svak chiralitet til molekylet. A-DNA gir en dominerende positiv topp på 260 nm og en negativ topp rundt 210 nm6. Z-DNA, den venstrehendte helixen, gir et negativt bånd på 290 nm og en positiv topp rundt 260 nm6. Dette DNA-et gir også en ekstremt negativ topp på 205 nm6.
I tillegg til disse konformasjonene kan DNA også danne triplexer, quadruplexes og hårnåler, som alle kan preges av CD-spektroskopi. Den parallelle G-quadruplex gir et dominerende positivt bånd på 260 nm, mens den anti-parallelle G-quadruplex gir et negativt bånd på 260 nm og en positiv topp på 290 nm, noe som gjør det enkelt å skille mellom de to former for quadruplex strukturer6. Triplexes gir ikke et karakteristisk spektrum8. For eksempel viser spektraet til et 36 nukleotidlangt DNA med potensial til å danne en intramolekylær trippelhelix som inneholder G.G.C og T.A.T basepar i nærvær av Na + et sterkt negativt bånd på 240 nm og en bred positiv topp. Den brede positive toppen viser bidrag på 266, 273 og 286 nm. Det samme oligonukleotidet i nærvær av Na+ og Zn+ viser fire negative bånd (213, 238, 266 og 282 nm) og en positiv topp på 258 nm. Dermed kan spektra av triplex DNA variere avhengig av saltforhold8.
I tillegg til disse konformasjonene har CD-spektra gjort det mulig å identifisere en annen form for DNA kalt X-DNA. X-DNA dannes når DNA-sekvensen inneholder alternative adenin- og tyminrester. CD-spektraet til X-DNA inneholder to negative topper på 250 og 280 nm. Svært lite informasjon er tilgjengelig om X-DNA, selv om det har blitt spekulert i å fungere som en vask for positiv supercoiling6,9. Endringer i CD-spektra kan også avsløre detaljer om ligandproteininteraksjoner og har derfor blitt lagt til arsenalet av molekylære metoder for å oppdage legemiddelproteininteraksjoner10,11,12,13,14. CD-spektra har også blitt brukt til å overvåke endringene i den sekundære strukturen av proteiner under foldeprosessen15. På samme måte kan CD-spektra også brukes til å undersøke ligand-DNA-interaksjoner16,17.
CD-spektroskopi er derfor en enkel, billig metode for å skille mellom de forskjellige formene for DNA-konformasjon, forutsatt at det er tilgang til ikke-så billig utstyr og programvare. Metoden er svært følsom og rask. Det krever bare en liten mengde DNA, noe som gir det en fordel over den alternative teknikken for kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titrasjoner med ligander og substrater er også enkle å utføre. Den største begrensningen er at DNA-et skal være svært rent. Det anbefales å bruke polyakrylamid gel elektroforese (PAGE)-renset DNA.
Informasjonen innhentet av CD-spektra har hovedsakelig blitt brukt til å utlede proteinstrukturelle egenskaper og for å identifisere distinkte DNA-konforme. I denne studien har CD-spektra blitt brukt til å integrere resultatene oppnådd fra et in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) eksperiment for å avgrense om proteinet av interesse / anslått transkripsjonsfaktor kan føre til en konformasjonsendring i promotorområdet av effektorgenene. Dette samarbeidet bidrar til å utvikle tradisjonelle CD-spektroskopiske teknikker ved å forutsi mekanismen for transkripsjonsregulering ved den anslåtte transkripsjonsfaktoren på og rundt transkripsjonsstartstedet (TSS) til en promotør.
Kromatin ombygging er en veldefinert mekanisme som er kjent for å regulere DNA-metabolske prosesser ved å gjøre det tettpakkede kromatin tilgjengelig for ulike regulatoriske faktorer som transkripsjonsfaktorer, komponenter av DNA-replikasjon eller skadereparasjonsproteiner. De ATP-avhengige kromatinremodelerne, også kjent som SWI/SNF-familien av proteiner, er viktige remodelerproteiner tilstede i eukaryote celler18,19. Fylogenetisk klynging har kategorisert SWI/SNF-familien av proteiner i 6 undergrupper20: Snf2-lignende, Swr1-lignende, SSO1653-lignende, Rad54-lignende, Rad5/16-lignende og fjern. SMARCAL1, proteinet av interesse i denne studien, tilhører den fjerne undergruppen20. Dette proteinet har blitt brukt til å undersøke sin modus for transkripsjonsregulering ved hjelp av CD-spektroskopi.
De fleste medlemmene av de ATP-avhengige kromatinoppussingsproteinene har vist seg å enten omplassere eller kaste ut nukleosomer eller formidle histonevariantutveksling på en ATP-avhengig måte21,22. Noen medlemmer av denne familien har imidlertid ikke vist seg å ombygge nukleosomer, for eksempel SMARCAL1. Selv om studier har vist at SMARCAL1 forbinder med polytene kromosomer, mangler eksperimentelle bevis angående dens evne til å ombygge nukleosomer23. Derfor ble det postulert at SMARCAL1 kan regulere transkripsjon ved å endre samsvaret med DNA24. CD-spektroskopi ga en enkel og tilgjengelig metode for å validere denne hypotesen.
SMARCAL1 er et ATP-avhengig kromatinoppussingsprotein som primært fungerer som en glødende helicase25,26,27. Det har blitt postulert for å modulere transkripsjon ved å ombygge DNA-konformasjonen24. For å teste denne hypotesen ble SMARCAL1s rolle i regulering av gentranskripsjon under doksorubicinindusert DNA-skade studert. I disse studiene ble SMARCAL1 brukt til in vivo-analyse og ADAAD for in vitro-analyser28,29. Tidligere studier har vist at ADAAD kan gjenkjenne DNA på en strukturavhengig, men sekvensuavhengig måte30,31. Proteinet binder seg optimalt til DNA-molekyler som har dobbelstreng til overgangsregioner med én tråd, i likhet med stammesløyfe-DNA, og hydrolyserer ATP 30,31.
In vivo-eksperimenter viste at SMARCAL1 regulerer uttrykket av MYC, DROSHA, DGCR8 og DICER ved å binde seg til promotorregionene28,29. Samhandlingsområdet ble identifisert av ChIP-eksperimenter28,29. ChIP-teknikken brukes til å analysere samspillet mellom et protein og dets cognate DNA i cellen. Målet er å avgjøre om spesifikke proteiner, for eksempel transkripsjonsfaktorer på promotører eller andre DNA-bindende nettsteder, er bundet til spesifikke genomiske områder. Proteinet bundet til DNA er først kryssbundet ved hjelp av formaldehyd. Dette etterfølges av isolasjon av kromatin. Det isolerte kromatinet skjæres til 500 bp fragmenter enten ved sonikering eller nuklease fordøyelse, og proteinet bundet til DNA er immunoprecipitated ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for proteinet. Krysskoblingen reverseres, og DNA-et analyseres enten ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) eller kvantitativ sanntids-PCR.
ChIP-resultatene førte til hypotesen om at SMARCAL1 muligens formidler transkripsjonsregulering ved å indusere en konformasjonsendring i promotorregionene til disse genene. QGRS-tilordning og Mfold-programvare ble brukt til å identifisere potensialet i disse promotorområdene for å danne sekundære strukturer28,29. QGRS-tilordning brukes til å forutsi G-quadruplexes32, mens Mfold33 analyserer en sekvenss evne til å danne sekundære strukturer som stamceller.
Etter sekundær strukturanalyse ble ytterligere in vitro-eksperimenter utført med rekombinant 6X Hans-taggede Aktive DNA-avhengige ATPase A Domain (ADAAD), den bovine homologen til SMARCAL1, renset fra Escherichia coli34. ATPase-analyser ble utført ved hjelp av ADAAD for å fastslå at de identifiserte DNA-sekvensene kunne fungere som effektorer28,29. Til slutt ble CD-spektroskopi utført for å overvåke konformasjonsendringene som ble indusert i DNA-molekylet av ADAAD28,29.
For å bevise at ATPase-aktiviteten til proteinet var avgjørende for å indusere en konformasjonsendring i DNA-molekylet, ble enten etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) tilsatt til chelate Mg+2 eller Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en spesifikk hemmer av SWI/SNF-proteinet, ble tilsatt35,36 . Denne CD-spektroskopiske teknikken kan brukes med ethvert renset protein som har blitt demonstrert av ChIP eller en annen relevant analyse for å binde seg til en predikert genomisk region av en promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Sirkulær dikroisme (CD) spektroskopi er en enkel og praktisk metode for å undersøke sekundærstrukturen og interaksjonene til biomolekyler. Nylige fremskritt innen CD-spektroskopi har gjort det mulig å studere DNA-proteininteraksjoner og konformasjonsdynamikk av DNA i ulike mikromiljø i detalj for en bedre forståelse av transkripsjonsregulering in vivo. Området rundt en potensiell transkripsjonssone må vikles ut for at transkripsjon skal skje. Dette er en kompleks prosess som krever koordinering av histone modifikasjoner, binding av transkripsjonsfaktoren til DNA, og andre kromatin ombyggingsaktiviteter. Ved hjelp av CD-spektroskopi er det mulig å studere konformasjonsendringer i promotorregionen forårsaket av regulatoriske proteiner, for eksempel ATP-avhengige kromatinremodelere, for å fremme transkripsjon. Konformasjonsendringene som forekommer i proteinet kan også overvåkes. I tillegg kan spørsmål om proteinets affinitet mot målets DNA og sekvensspesifikkhet løses ved å inkorporere mutasjoner i mål-DNA-et. Kort sagt, den unike forståelsen av denne sensitive og rimelige metoden kan forutsi endringer i kromatindynamikk, og dermed forbedre forståelsen av transkripsjonsregulering.

ADAAD stabiliserer en stamme-loop som struktur på MYC-promotoren Tidligere eksperimentelle bevis viste at SMARCAL1 er en negativ regulator av MYC29. Analyse av den 159 bp lange promotorregionen av MYC-genet av QGRS-tilordning viste at fremoverstrengen hadde potensial til å danne en G-quadruplex (tabell 2). Mfold viste at begge trådene i MYC DNA kunne danne en stamme-loop-lignende struktur...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Samspillet mellom en ATP-avhengig kromatinremodeler med en DNA-ligand er beskrevet ved hjelp av CD-spektroskopi. De induserte konformasjonsendringene på en genpromotor analysert av toppene som genereres, kan brukes til å forstå mekanismen for transkripsjonsregulering.

CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protokollen gjør det mulig for oss å visualisere endringene i den andre omstruktureringen av DNA indusert av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner. Endringen i DNA-strukturen kan korreleres med transkripsjonsregulering. Dette er en enkel og svært følsom teknikk som bruker en svært liten mengde rent DNA for å registrere de strukturelle endringene i oligonukleotidet.Denne metoden kan gi innsikt i transkripsjonsregulering formidlet av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner. For å begynne med, forberede arbeidskonsentrasjonene av buffere og andre reaksjonskomponenter friskt og holde dem på fire grader Celsius før du setter opp reaksjonene, og mål deretter ATPase-aktiviteten til proteinet i nærvær av forskjellige DNA-molekyler ved hjelp av en NADH-koblet oksidasjonsanalyse. Bland 0,1 millimolar ADAAD, to millimolar ATP, 10 nanomolar DNA og 1X REG buffer i en 96-brønns plate til et endelig volum på 250 mikroliter.Deretter inkuberer du reaksjonen i 30 minutter i en 37 graders Celsius-inkubator, og måler deretter mengden NAD + ved hjelp av programvaren som følger med mikroplateleseren. For å måle absorbansen ved 340 nanometer, klikk på NADH-analysen og plasser 96-brønnsplaten på plateholderen i instrumentet, og klikk deretter på leseplateknappen for å registrere absorbansen. Samle CD-spektra i kvarts cuvettes med høy gjennomsiktighet.Bruk enten rektangulære eller sylindriske cuvettes. For å rengjøre cuvettes, vask dem med vann flere ganger, og ta deretter en skanning av vannet eller bufferen i cuvette for å sjekke om det er rent. For reaksjonene, bruk SIDE-renset DNA oligonukleotider.For rask kjøling, varm opp DNA-et ved 94 grader Celsius i tre minutter på varmeblokken og avkjøl det umiddelbart på is. For en langsom kjøling, etter oppvarming av DNA ved 94 grader Celsius i tre minutter, la det avkjøles til romtemperatur med en hastighet på en grad Celsius per minutt. For å registrere baseline spektra, sette opp totalt fem kontrollreaksjoner en etter en i 1,5 milliliter sentrifuge rør.Hold reaksjonsvolumet på 300 mikroliter i alle reaksjonene. For å spille inn CD-spektraet, sett opp totalt fem eksperimentelle reaksjoner en etter en i 1,5 milliliter sentrifugerør. For å ta opp skanningen, slå på gassen og slå på CD-spektrometeret.Etter 10 til 15 minutter, slå på lampen, slå på vannbadet og sett holdertemperaturen på 37 grader Celsius. Deretter åpner du CD-spektrumprogramvaren og setter temperaturen til 37 grader Celsius, bølgelengdeområdet på 180 til 300 nanometer, tiden per punkt til 0,5 sekunder, og skannenummeret til fem, klikk deretter på pro-dataviseren, lag en ny fil og gi den nytt navn med detaljene for eksperimentet og datoen. Bland deretter baseline og eksperimentelle reaksjoner ved pipettering og overfør forsiktig reaksjonsblandingene en etter en til cuvette, og sørg for at det ikke er luftbobler.Hvis du utfører et tidskurseksperiment, inkuberer du reaksjonene ved 37 grader Celsius i ønsket tid, og deretter tar du skanningen. Tilsett EDTA i bufferen som inneholder DNA, ATP, magnesium og protein for å stoppe ATP hydrolyse. For å hemme ATPase-aktiviteten fullstendig, øk EDTA-konsentrasjonen og inkubasjonstiden.Trekk basislinjene fra de tilsvarende reaksjonene i programvaren og glatt dataene enten i CD-spektrumprogramvaren eller i dataplottingsprogramvaren, og plott deretter en graf over bølgelengde mot gjennomsnittlig rest elliptikk og analyser toppene. M-folds viste at begge trådene av MYC DNA kunne danne en stamme loop-lignende struktur. M-fold strukturer av fremover og omvendt DNA-sekvens som inneholder G quadruplex GECE er vist her.CD-spektra av raskt avkjølt GECE i fravær og tilstedeværelse av ATP og ADAAD viste at ADAAD induserer to positive topper, en på 258 nanometer og den andre ved 210 nanometer. Tilsetningen av EDTA avvikler denne konformasjonsendringen. CD-spektraet har nå en negativ 210 nanometertopp og et bredt positivt bånd med topper på 230 og 250 nanometer.QGRS-tilordning og M-fold-analyse viste at promotorregionene DROSHA, DGCR8 og DICER har potensial til å danne G-quadruplex og stammelignende strukturer. CD-spektraet til DROSHA-par fem viste at ADAAD induserer en negativ topp på 210 nanometer og en positiv topp på 260 nanometer. Dette spekteret er karakteristisk for ADNA.CD-spektraet til DGCR8-paret viste en positiv topp på 210 nanometer og en bred negativ topp på 260 nanometer. Dette spekteret er karakteristisk for B til X-overgang. For DGCR8-paret syv ble det sett sterke positive topper på 210 og 270 nanometer og en negativ topp på 250 nanometer.Dette spekteret er karakteristisk for parallelle G quadruplex DNA-strukturer. Til slutt, for DICER-paret en, ble det observert en positiv topp på 210 nanometer og to negative topper, en på 230 nanometer og den andre ved 260 nanometer. Disse toppene er karakteristiske for en A til X DNA-overgang.Forsikre deg om at renheten av DNA og protein er 99% eller mer. Cuvette skal være ren og grunnlinjen skal være mindre enn en millidegree. Alle reagensene skal være rene slik at bakgrunnen er mindre enn en millidegree.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

En integrert Raman spektroskopi og Mass massespektrometri Platform å studere single-Cell Drug opptak, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...