Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pelo espectrômetro do CD. V.J. e A.D. foram apoiados por uma bolsa da CSIR.

1. Concentração de trabalho dos componentes de reação
<ol><li>Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações. NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADi...

O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.

Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da prote?...

O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros quirais1,2.
As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagação de ondas. No caso da luz não polarizada, esses campos oscilam em muitas direções. Quando a luz é polarizada circularmente, dois campos eletromagnéticos são obtidos a 90° diferença de fase um para o outro. As moléculas quirais mostram rotação óptica circular (birefringência) de tal forma que absorverão a luz circularmente polarizada e a luz circularmente polarizada com mão esquerda em diferentes extensões3. O campo elétrico resultante será traçado como uma elipse, uma função do comprimento de onda. O espectro de CD é, portanto, registrado como elíptica (q), e os dados são apresentados como Elipticidade de Resíduo Médio em função do comprimento de onda.
No caso das proteínas, o Cα de aminoácidos (exceto glicina) é quiral, e este é explorado pela espectroscopia de CD para determinar a estrutura secundária desta macromolécula4. Os espectros de CD de moléculas de proteínas são tipicamente registrados na faixa Far UV. α-helical proteínas têm duas bandas negativas a 222 nm e 208 nm e um pico positivo de 193 nm4. Proteínas com estrutura secundária anti-paralela de β folhas mostram um pico negativo de 218 nm e um pico positivo de 195 nm4. Proteínas com estruturas desordenadas apresentam baixa elíptica perto de 210 nm e um pico negativo de 195 nm4. Assim, o pico/bandas bem definidos para diferentes estruturas secundárias fazem do CD uma ferramenta conveniente para elucidar as alterações conformais ocorridas na estrutura secundária das proteínas durante a desnaturação, bem como a ligação de ligantes.
Os ácidos nucleicos têm três fontes de quiralidade: a molécula de açúcar, a helicidade da estrutura secundária e a ordem terciária de longo alcance do DNA no ambiente5,6. Os espectros de CD de ácidos nucleicos são tipicamente registrados na faixa de 190 a 300 nm5,6. Cada conformação do DNA, assim como as proteínas, dá um espectro característico, embora os picos/bandas possam variar em alguns graus devido às condições de solvente e diferenças nas sequências de DNA7. O B-DNA, a forma mais comum, é caracterizado por um pico positivo em torno de 260-280 nm e um pico negativo em torno de 245 nm6. Os picos/bandas de DNA de forma B são geralmente pequenos porque os pares de base são perpendiculares à dupla hélice, conferindo quiralidade fraca à molécula. O DNA A dá um pico positivo dominante de 260 nm e um pico negativo em torno de 210 nm6. Z-DNA, a hélice canhota, dá uma faixa negativa a 290 nm e um pico positivo em torno de 260 nm6. Este DNA também dá um pico extremamente negativo em 205 nm6.
Além dessas conformações, o DNA também pode formar trigêmeos, quadruplos e grampos, todos os quais podem ser distinguidos pela espectroscopia do CD. O G-quadruplex paralelo dá uma faixa positiva dominante a 260 nm, enquanto o G-quadruplex anti-paralelo dá uma banda negativa a 260 nm e um pico positivo de 290 nm, tornando fácil distinguir entre as duas formas de estruturas quádruplas6. Triplexes não dão um espectro característico8. Por exemplo, os espectros de um DNA de 36 nucleotídeos com potencial para formar uma hélice tripla intramolecular contendo pares de base G.G.C e T.A.T na presença de Na+ mostram uma forte faixa negativa a 240 nm e um pico positivo amplo. O amplo pico positivo mostra contribuições em 266, 273 e 286 nm. O mesmo oligonucleotídeo na presença de Na+ e Zn+ mostra quatro bandas negativas (213, 238, 266 e 282 nm) e um pico positivo de 258 nm. Assim, os espectros do DNA triplex podem variar dependendo das condições do sal8.
Além dessas conformações, os espectros de CD permitiram a identificação de outra forma de DNA chamada DNA X. O DNA-X é formado quando a sequência de DNA contém resíduos alternativos de adenina e timina. Os espectros de CD do DNA X contêm dois picos negativos de 250 e 280 nm. Há muito pouca informação disponível sobre O X-DNA, embora tenha sido especulado para funcionar como uma pia para supercoilação positiva6,9. Mudanças nos espectros de CD também podem revelar detalhes sobre interações ligantes-proteínas e, portanto, foram adicionadas ao arsenal de métodos moleculares para detectar interações medicamentosa-proteína10,11,12,13,14. Os espectros de CD também têm sido utilizados para monitorar as mudanças na estrutura secundária de proteínas durante o processo de dobramento15. Da mesma forma, os espectros de CD também podem ser usados para sondar interações ligantes-DNA16,17.
A espectroscopia de CD, portanto, é um método fácil e barato para distinguir entre as diferentes formas de conformação de DNA, desde que haja acesso a equipamentos e softwares não tão baratos. O método é extremamente sensível e rápido. Requer apenas uma pequena quantidade de DNA, dando-lhe uma vantagem sobre a técnica alternativa de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Titulações com ligantes e substratos também são fáceis de executar. A maior restrição é que o DNA deve ser altamente puro. É aconselhável usar eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE)-purificada dna.
As informações obtidas pelos espectros de CD têm sido usadas principalmente para deduzir características estruturais proteicas e identificar conformadores de DNA distintos. Neste estudo, os espectros de CD têm sido utilizados para integrar os resultados obtidos a partir de um experimento in vivo Chromatin Imunoprecipitation (ChIP) para delinear se a proteína de interesse/fator de transcrição predito pode provocar uma mudança conformacional na região promotora de seus genes efeitos. Essa colaboração auxilia no progresso das técnicas espectroscópicas tradicionais do CD, prevendo o mecanismo de regulação da transcrição pelo fator de transcrição previsto sobre e em torno do site de início da transcrição (TSS) de um promotor.
A remodelagem da cromatina é um mecanismo bem definido conhecido para regular os processos metabólicos do DNA, tornando a cromatina bem embalada acessível a vários fatores regulatórios, como fatores de transcrição, componentes da replicação do DNA ou proteínas de reparação de danos. Os remodeladores de cromatina dependentes de ATP, também conhecidos como a família de proteínas SWI/SNF, são proteínas remodeladoras-chave presentes em células eucarióticas18,19. O agrupamento filogenético categorizou a família de proteínas SWI/SNF em 6 subgrupos20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, e distante. O SMARCAL1, proteína de interesse neste estudo, pertence ao subgrudo distante20. Esta proteína tem sido usada para investigar seu modo de regulação transcricional usando espectroscopia de CD.
A maioria dos membros das proteínas de remodelação de cromatina dependentes da ATP tem sido mostrada para reposicionar ou despejar nucleossomos ou mediar a troca de variantes histone de forma dependente de ATP21,22. No entanto, alguns membros desta família não foram mostrados para remodelar nucleosomos, por exemplo, SMARCAL1. Embora estudos tenham demonstrado que o SMARCAL1 associa-se a cromossomos de politenso, faltam evidências experimentais sobre sua capacidade de remodelar nucleossomos. Portanto, foi postulado que o SMARCAL1 pode regular a transcrição alterando a conformação do DNA24. A espectroscopia de CD forneceu um método fácil e acessível para validar essa hipótese.
SMARCAL1 é uma proteína de remodelação de cromatina dependente de ATP que funciona principalmente como uma helicase de ressaramento25,26,27. Foi postulado para modular a transcrição remodelando a conformação de DNA24. Para testar essa hipótese, foi estudado o papel do SMARCAL1 na regulação da transcrição genética durante o dano de DNA induzido pela doxibicina. Nesses estudos, foi utilizado SMARCAL1 para análise in vivo e ADAAD para ensaios in vitro28,29. Estudos anteriores mostraram que a ADAAD pode reconhecer o DNA de forma dependente da estrutura, mas independente de sequência30,31. A proteína se liga idealmente a moléculas de DNA que possuem dois fios em regiões de transição de fios únicos, semelhantes ao DNA de laço-tronco, e hidrolisa ATP 30,31.
Experimentos in vivo mostraram que o SMARCAL1 regula a expressão de MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER por vinculação às regiões promotoras28,29. A região de interação foi identificada pelos experimentos chip28,29. A técnica ChIP é usada para analisar a interação de uma proteína com seu DNA cognato dentro da célula. Seu objetivo é determinar se proteínas específicas, como fatores de transcrição em promotores ou outros locais de ligação de DNA, estão vinculadas a áreas genômicas específicas. A proteína ligada ao DNA é a primeira ligada cruzada usando formaldeído. Isso é seguido pelo isolamento da cromatina. A cromatina isolada é desarquivada a fragmentos de 500 bps, seja por sônica ou digestão nuclease, e a proteína ligada ao DNA é imunoprecipitada usando anticorpos específicos da proteína. A ligação cruzada é invertida, e o DNA é analisado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou a PCR quantitativa em tempo real.
Os resultados do ChIP levaram à hipótese de que o SMARCAL1 possivelmente media a regulação transcricional, induzindo uma mudança conformacional nas regiões promotoras desses genes. O mapeador QGRS e o software Mfold foram utilizados para identificar o potencial dessas regiões promotoras para formar estruturas secundárias28,29. O mapeador QGRS é usado para prever G-quadruplexes32, enquanto o Mfold33 analisa a capacidade de uma sequência de formar estruturas secundárias, como alças-tronco.
Após análise de estrutura secundária, outros experimentos in vitro foram realizados com ATPase A Domain (ADAAD) dependente de DNA ativo recombinante 6X, o homólogo bovino do SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Os ensaios atpase foram realizados utilizando-se a ADAAD para estabelecer que as sequências de DNA identificadas poderiam atuar como efeitos28,29. Finalmente, foi realizada a espectroscopia de CD para monitorar as alterações conformais induzidas na molécula de DNA por ADAAD28,29.
Para provar que a atividade ATPase da proteína foi essencial para induzir uma alteração conformacional na molécula de DNA, ou o ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) foi adicionado ao chelate Mg+2 ou ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), um inibidor específico da proteína SWI/SNF, foi adicionado 35,36 . Esta técnica espectroscópica do CD pode ser utilizada com qualquer proteína purificada que tenha sido demonstrada pelo ChIP ou qualquer outro ensaio relevante para se ligar a uma região genômica prevista de um promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.

ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYC Evidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar u...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

O protocolo nos permite visualizar as mudanças na segunda reestruturação do DNA induzida pelas proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. A mudança na estrutura do DNA pode estar correlacionada com a regulação da transcrição. Esta é uma técnica fácil e altamente sensível que usa uma quantidade muito pequena de DNA puro para registrar as mudanças estruturais no oligonucleotídeo.Este método pode fornecer informações sobre a regulação da transcrição mediada por proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. Para começar, prepare as concentrações de trabalho dos buffers e outros componentes de reação recentemente e mantenha-os a quatro graus Celsius antes de configurar as reações, em seguida, meça a atividade ATPase da proteína na presença de diferentes moléculas de DNA usando um ensaio de oxidação acoplado naDH. Misture 0,1 milimola ADAAD, dois ATP mililitros, 10 DNA nanomolar e 1X tampão REG em uma placa de 96 poços para um volume final de 250 microliters.Em seguida, incubar a reação por 30 minutos em uma incubadora Celsius de 37 graus e, em seguida, medir a quantidade de NAD+usando o software fornecido junto com o leitor de microplaca. Para medir a absorvância em 340 nanômetros, clique no ensaio NADH e coloque a placa de 96 poços no porta-placas do instrumento e clique no botão de placa de leitura para registrar a absorvência. Colete o espectro de CD em cuvetas de quartzo de alta transparência.Use cuvetas retangulares ou cilíndricas. Para limpar as cuvetas, lave-as com água várias vezes, depois faça uma varredura da água ou tampão na cuvette para verificar se ela está limpa. Para as reações, use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE.Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 graus Celsius por três minutos no bloco de aquecimento e esfrie-o imediatamente no gelo. Para um resfriamento lento, depois de aquecer o DNA a 94 graus Celsius por três minutos, deixe esfriar à temperatura ambiente a uma taxa de um grau Celsius por minuto. Para gravar o espectro da linha de base, configure um total de cinco reações de controle uma a uma em tubos de centrífugas mililitros.Mantenha o volume de reação em 300 microliters em todas as reações. Para gravar o espectro do CD, configure um total de cinco reações experimentais uma a uma em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Para gravar a varredura, ligue o gás e ligue o espectrômetro do CD.Após 10 a 15 minutos, ligue a lâmpada, ligue o banho de água e coloque a temperatura do suporte em 37 graus Celsius. Em seguida, abra o software de espectro de CD e defina a temperatura para 37 graus Celsius, o comprimento de onda varia em 180 a 300 nanômetros, o tempo por ponto para 0,5 segundos, e o número de varredura para cinco, em seguida, clique no visualizador de dados pro, faça um novo arquivo e renomeie-o com os detalhes do experimento e da data. Em seguida, misture as reações de base e experimentais por pipetação e transfira cuidadosamente as misturas de reação uma a uma para a cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar.Se realizar um experimento de curso de tempo, incubar as reações a 37 graus Celsius pelo tempo necessário, então faça a varredura. Adicione EDTA ao tampão contendo o DNA, ATP, magnésio e proteína para parar a hidrólise ATP. Para inibir completamente a atividade atpase, aumente o tempo de concentração e incubação de EDTA.Subtrair as linhas de base das reações correspondentes no software e suavizar os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados, em seguida, traçar um gráfico de comprimento de onda contra elipticidade de resíduos médios e analisar os picos. As dobras M mostraram que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma estrutura semelhante a um laço de haste. As estruturas de dobra M da frente e a sequência de DNA reverso contendo o GECE G quádruplo são mostradas aqui.O espectrômetro de CD de GECE resfriado rápido na ausência e presença de ATP e ADAAD mostrou que a ADAAD induz dois picos positivos, um a 258 nanômetros e outro a 210 nanômetros. A adição de EDTA revoga essa mudança conformacional. O espectro de CD agora tem um pico negativo de 210 nanômetros e uma ampla faixa positiva com picos de 230 e 250 nanômetros.A análise de mapeador QGRS e M-fold mostrou que as regiões promotoras de DROSHA, DGCR8 e DICER possuem o potencial de formar estruturas quádruplas G e semelhantes a troncos. O espectro de CD do par DROSHA cinco mostrou que a ADAAD induz um pico negativo em 210 nanômetros e um pico positivo de 260 nanômetros. Este espectro é uma característica do ADNA.Os espectros de CD do par DGCR8 um mostrou um pico positivo de 210 nanômetros e um amplo pico negativo de 260 nanômetros. Este espectro é característico da transição B para X. Para o par DGCR8 sete, foram observados fortes picos positivos de 210 e 270 nanômetros e um pico negativo de 250 nanômetros.Este espectro é característico de estruturas de DNA quádruplo G paralelo. Por fim, para o par DICER um, um pico positivo de 210 nanômetros e dois picos negativos, um a 230 nanômetros e o outro a 260 nanômetros foram observados. Esses picos são característicos de uma transição de DNA de A a X.Certifique-se de que a pureza do DNA e da proteína é de 99% ou mais. O cuvette deve estar limpo e a linha de base deve ser inferior a um milídeo. Todos os reagentes devem ser puros para que o fundo seja inferior a um milídeo.

Research

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