Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pelo espectrômetro do CD. V.J. e A.D. foram apoiados por uma bolsa da CSIR.

1. Concentração de trabalho dos componentes de reação
<ol><li>Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações. NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADi...

O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.

Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da prote?...

O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros quirais1,2.
As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagação de ondas. No caso da luz não polarizada, esses campos oscilam em muitas direções. Quando a luz é polarizada circularmente, dois campos eletromagnéticos são obtidos a 90° diferença de fase um para o outro. As moléculas quirais mostram rotação óptica circular (birefringência) de tal forma que absorverão a luz circularmente polarizada e a luz circularmente polarizada com mão esquerda em diferentes extensões3. O campo elétrico resultante será traçado como uma elipse, uma função do comprimento de onda. O espectro de CD é, portanto, registrado como elíptica (q), e os dados são apresentados como Elipticidade de Resíduo Médio em função do comprimento de onda.
No caso das proteínas, o Cα de aminoácidos (exceto glicina) é quiral, e este é explorado pela espectroscopia de CD para determinar a estrutura secundária desta macromolécula4. Os espectros de CD de moléculas de proteínas são tipicamente registrados na faixa Far UV. α-helical proteínas têm duas bandas negativas a 222 nm e 208 nm e um pico positivo de 193 nm4. Proteínas com estrutura secundária anti-paralela de β folhas mostram um pico negativo de 218 nm e um pico positivo de 195 nm4. Proteínas com estruturas desordenadas apresentam baixa elíptica perto de 210 nm e um pico negativo de 195 nm4. Assim, o pico/bandas bem definidos para diferentes estruturas secundárias fazem do CD uma ferramenta conveniente para elucidar as alterações conformais ocorridas na estrutura secundária das proteínas durante a desnaturação, bem como a ligação de ligantes.
Os ácidos nucleicos têm três fontes de quiralidade: a molécula de açúcar, a helicidade da estrutura secundária e a ordem terciária de longo alcance do DNA no ambiente5,6. Os espectros de CD de ácidos nucleicos são tipicamente registrados na faixa de 190 a 300 nm5,6. Cada conformação do DNA, assim como as proteínas, dá um espectro característico, embora os picos/bandas possam variar em alguns graus devido às condições de solvente e diferenças nas sequências de DNA7. O B-DNA, a forma mais comum, é caracterizado por um pico positivo em torno de 260-280 nm e um pico negativo em torno de 245 nm6. Os picos/bandas de DNA de forma B são geralmente pequenos porque os pares de base são perpendiculares à dupla hélice, conferindo quiralidade fraca à molécula. O DNA A dá um pico positivo dominante de 260 nm e um pico negativo em torno de 210 nm6. Z-DNA, a hélice canhota, dá uma faixa negativa a 290 nm e um pico positivo em torno de 260 nm6. Este DNA também dá um pico extremamente negativo em 205 nm6.
Além dessas conformações, o DNA também pode formar trigêmeos, quadruplos e grampos, todos os quais podem ser distinguidos pela espectroscopia do CD. O G-quadruplex paralelo dá uma faixa positiva dominante a 260 nm, enquanto o G-quadruplex anti-paralelo dá uma banda negativa a 260 nm e um pico positivo de 290 nm, tornando fácil distinguir entre as duas formas de estruturas quádruplas6. Triplexes não dão um espectro característico8. Por exemplo, os espectros de um DNA de 36 nucleotídeos com potencial para formar uma hélice tripla intramolecular contendo pares de base G.G.C e T.A.T na presença de Na+ mostram uma forte faixa negativa a 240 nm e um pico positivo amplo. O amplo pico positivo mostra contribuições em 266, 273 e 286 nm. O mesmo oligonucleotídeo na presença de Na+ e Zn+ mostra quatro bandas negativas (213, 238, 266 e 282 nm) e um pico positivo de 258 nm. Assim, os espectros do DNA triplex podem variar dependendo das condições do sal8.
Além dessas conformações, os espectros de CD permitiram a identificação de outra forma de DNA chamada DNA X. O DNA-X é formado quando a sequência de DNA contém resíduos alternativos de adenina e timina. Os espectros de CD do DNA X contêm dois picos negativos de 250 e 280 nm. Há muito pouca informação disponível sobre O X-DNA, embora tenha sido especulado para funcionar como uma pia para supercoilação positiva6,9. Mudanças nos espectros de CD também podem revelar detalhes sobre interações ligantes-proteínas e, portanto, foram adicionadas ao arsenal de métodos moleculares para detectar interações medicamentosa-proteína10,11,12,13,14. Os espectros de CD também têm sido utilizados para monitorar as mudanças na estrutura secundária de proteínas durante o processo de dobramento15. Da mesma forma, os espectros de CD também podem ser usados para sondar interações ligantes-DNA16,17.
A espectroscopia de CD, portanto, é um método fácil e barato para distinguir entre as diferentes formas de conformação de DNA, desde que haja acesso a equipamentos e softwares não tão baratos. O método é extremamente sensível e rápido. Requer apenas uma pequena quantidade de DNA, dando-lhe uma vantagem sobre a técnica alternativa de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Titulações com ligantes e substratos também são fáceis de executar. A maior restrição é que o DNA deve ser altamente puro. É aconselhável usar eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE)-purificada dna.
As informações obtidas pelos espectros de CD têm sido usadas principalmente para deduzir características estruturais proteicas e identificar conformadores de DNA distintos. Neste estudo, os espectros de CD têm sido utilizados para integrar os resultados obtidos a partir de um experimento in vivo Chromatin Imunoprecipitation (ChIP) para delinear se a proteína de interesse/fator de transcrição predito pode provocar uma mudança conformacional na região promotora de seus genes efeitos. Essa colaboração auxilia no progresso das técnicas espectroscópicas tradicionais do CD, prevendo o mecanismo de regulação da transcrição pelo fator de transcrição previsto sobre e em torno do site de início da transcrição (TSS) de um promotor.
A remodelagem da cromatina é um mecanismo bem definido conhecido para regular os processos metabólicos do DNA, tornando a cromatina bem embalada acessível a vários fatores regulatórios, como fatores de transcrição, componentes da replicação do DNA ou proteínas de reparação de danos. Os remodeladores de cromatina dependentes de ATP, também conhecidos como a família de proteínas SWI/SNF, são proteínas remodeladoras-chave presentes em células eucarióticas18,19. O agrupamento filogenético categorizou a família de proteínas SWI/SNF em 6 subgrupos20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, e distante. O SMARCAL1, proteína de interesse neste estudo, pertence ao subgrudo distante20. Esta proteína tem sido usada para investigar seu modo de regulação transcricional usando espectroscopia de CD.
A maioria dos membros das proteínas de remodelação de cromatina dependentes da ATP tem sido mostrada para reposicionar ou despejar nucleossomos ou mediar a troca de variantes histone de forma dependente de ATP21,22. No entanto, alguns membros desta família não foram mostrados para remodelar nucleosomos, por exemplo, SMARCAL1. Embora estudos tenham demonstrado que o SMARCAL1 associa-se a cromossomos de politenso, faltam evidências experimentais sobre sua capacidade de remodelar nucleossomos. Portanto, foi postulado que o SMARCAL1 pode regular a transcrição alterando a conformação do DNA24. A espectroscopia de CD forneceu um método fácil e acessível para validar essa hipótese.
SMARCAL1 é uma proteína de remodelação de cromatina dependente de ATP que funciona principalmente como uma helicase de ressaramento25,26,27. Foi postulado para modular a transcrição remodelando a conformação de DNA24. Para testar essa hipótese, foi estudado o papel do SMARCAL1 na regulação da transcrição genética durante o dano de DNA induzido pela doxibicina. Nesses estudos, foi utilizado SMARCAL1 para análise in vivo e ADAAD para ensaios in vitro28,29. Estudos anteriores mostraram que a ADAAD pode reconhecer o DNA de forma dependente da estrutura, mas independente de sequência30,31. A proteína se liga idealmente a moléculas de DNA que possuem dois fios em regiões de transição de fios únicos, semelhantes ao DNA de laço-tronco, e hidrolisa ATP 30,31.
Experimentos in vivo mostraram que o SMARCAL1 regula a expressão de MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER por vinculação às regiões promotoras28,29. A região de interação foi identificada pelos experimentos chip28,29. A técnica ChIP é usada para analisar a interação de uma proteína com seu DNA cognato dentro da célula. Seu objetivo é determinar se proteínas específicas, como fatores de transcrição em promotores ou outros locais de ligação de DNA, estão vinculadas a áreas genômicas específicas. A proteína ligada ao DNA é a primeira ligada cruzada usando formaldeído. Isso é seguido pelo isolamento da cromatina. A cromatina isolada é desarquivada a fragmentos de 500 bps, seja por sônica ou digestão nuclease, e a proteína ligada ao DNA é imunoprecipitada usando anticorpos específicos da proteína. A ligação cruzada é invertida, e o DNA é analisado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou a PCR quantitativa em tempo real.
Os resultados do ChIP levaram à hipótese de que o SMARCAL1 possivelmente media a regulação transcricional, induzindo uma mudança conformacional nas regiões promotoras desses genes. O mapeador QGRS e o software Mfold foram utilizados para identificar o potencial dessas regiões promotoras para formar estruturas secundárias28,29. O mapeador QGRS é usado para prever G-quadruplexes32, enquanto o Mfold33 analisa a capacidade de uma sequência de formar estruturas secundárias, como alças-tronco.
Após análise de estrutura secundária, outros experimentos in vitro foram realizados com ATPase A Domain (ADAAD) dependente de DNA ativo recombinante 6X, o homólogo bovino do SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Os ensaios atpase foram realizados utilizando-se a ADAAD para estabelecer que as sequências de DNA identificadas poderiam atuar como efeitos28,29. Finalmente, foi realizada a espectroscopia de CD para monitorar as alterações conformais induzidas na molécula de DNA por ADAAD28,29.
Para provar que a atividade ATPase da proteína foi essencial para induzir uma alteração conformacional na molécula de DNA, ou o ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) foi adicionado ao chelate Mg+2 ou ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), um inibidor específico da proteína SWI/SNF, foi adicionado 35,36 . Esta técnica espectroscópica do CD pode ser utilizada com qualquer proteína purificada que tenha sido demonstrada pelo ChIP ou qualquer outro ensaio relevante para se ligar a uma região genômica prevista de um promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.

ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYC Evidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar u...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

O protocolo nos permite visualizar as mudanças na segunda reestruturação do DNA induzida pelas proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. A mudança na estrutura do DNA pode estar correlacionada com a regulação da transcrição. Esta é uma técnica fácil e altamente sensível que usa uma quantidade muito pequena de DNA puro para registrar as mudanças estruturais no oligonucleotídeo.Este método pode fornecer informações sobre a regulação da transcrição mediada por proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. Para começar, prepare as concentrações de trabalho dos buffers e outros componentes de reação recentemente e mantenha-os a quatro graus Celsius antes de configurar as reações, em seguida, meça a atividade ATPase da proteína na presença de diferentes moléculas de DNA usando um ensaio de oxidação acoplado naDH. Misture 0,1 milimola ADAAD, dois ATP mililitros, 10 DNA nanomolar e 1X tampão REG em uma placa de 96 poços para um volume final de 250 microliters.Em seguida, incubar a reação por 30 minutos em uma incubadora Celsius de 37 graus e, em seguida, medir a quantidade de NAD+usando o software fornecido junto com o leitor de microplaca. Para medir a absorvância em 340 nanômetros, clique no ensaio NADH e coloque a placa de 96 poços no porta-placas do instrumento e clique no botão de placa de leitura para registrar a absorvência. Colete o espectro de CD em cuvetas de quartzo de alta transparência.Use cuvetas retangulares ou cilíndricas. Para limpar as cuvetas, lave-as com água várias vezes, depois faça uma varredura da água ou tampão na cuvette para verificar se ela está limpa. Para as reações, use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE.Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 graus Celsius por três minutos no bloco de aquecimento e esfrie-o imediatamente no gelo. Para um resfriamento lento, depois de aquecer o DNA a 94 graus Celsius por três minutos, deixe esfriar à temperatura ambiente a uma taxa de um grau Celsius por minuto. Para gravar o espectro da linha de base, configure um total de cinco reações de controle uma a uma em tubos de centrífugas mililitros.Mantenha o volume de reação em 300 microliters em todas as reações. Para gravar o espectro do CD, configure um total de cinco reações experimentais uma a uma em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Para gravar a varredura, ligue o gás e ligue o espectrômetro do CD.Após 10 a 15 minutos, ligue a lâmpada, ligue o banho de água e coloque a temperatura do suporte em 37 graus Celsius. Em seguida, abra o software de espectro de CD e defina a temperatura para 37 graus Celsius, o comprimento de onda varia em 180 a 300 nanômetros, o tempo por ponto para 0,5 segundos, e o número de varredura para cinco, em seguida, clique no visualizador de dados pro, faça um novo arquivo e renomeie-o com os detalhes do experimento e da data. Em seguida, misture as reações de base e experimentais por pipetação e transfira cuidadosamente as misturas de reação uma a uma para a cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar.Se realizar um experimento de curso de tempo, incubar as reações a 37 graus Celsius pelo tempo necessário, então faça a varredura. Adicione EDTA ao tampão contendo o DNA, ATP, magnésio e proteína para parar a hidrólise ATP. Para inibir completamente a atividade atpase, aumente o tempo de concentração e incubação de EDTA.Subtrair as linhas de base das reações correspondentes no software e suavizar os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados, em seguida, traçar um gráfico de comprimento de onda contra elipticidade de resíduos médios e analisar os picos. As dobras M mostraram que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma estrutura semelhante a um laço de haste. As estruturas de dobra M da frente e a sequência de DNA reverso contendo o GECE G quádruplo são mostradas aqui.O espectrômetro de CD de GECE resfriado rápido na ausência e presença de ATP e ADAAD mostrou que a ADAAD induz dois picos positivos, um a 258 nanômetros e outro a 210 nanômetros. A adição de EDTA revoga essa mudança conformacional. O espectro de CD agora tem um pico negativo de 210 nanômetros e uma ampla faixa positiva com picos de 230 e 250 nanômetros.A análise de mapeador QGRS e M-fold mostrou que as regiões promotoras de DROSHA, DGCR8 e DICER possuem o potencial de formar estruturas quádruplas G e semelhantes a troncos. O espectro de CD do par DROSHA cinco mostrou que a ADAAD induz um pico negativo em 210 nanômetros e um pico positivo de 260 nanômetros. Este espectro é uma característica do ADNA.Os espectros de CD do par DGCR8 um mostrou um pico positivo de 210 nanômetros e um amplo pico negativo de 260 nanômetros. Este espectro é característico da transição B para X. Para o par DGCR8 sete, foram observados fortes picos positivos de 210 e 270 nanômetros e um pico negativo de 250 nanômetros.Este espectro é característico de estruturas de DNA quádruplo G paralelo. Por fim, para o par DICER um, um pico positivo de 210 nanômetros e dois picos negativos, um a 230 nanômetros e o outro a 260 nanômetros foram observados. Esses picos são característicos de uma transição de DNA de A a X.Certifique-se de que a pureza do DNA e da proteína é de 99% ou mais. O cuvette deve estar limpo e a linha de base deve ser inferior a um milídeo. Todos os reagentes devem ser puros para que o fundo seja inferior a um milídeo.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...