Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, за CD-спектрофотометр. V.J. и A.D. были поддержаны стипендией от CSIR.

1. Рабочая концентрация реакционных компонентов
<ol><li>Подготовьте рабочие концентрации буферов для CD и других реакционных компонентов в свежем виде (см. Таблицу 1) и сохраните их при 4 °C перед началом реакций. ПРИМЕЧАНИЕ: Для РЕАКЦИЙ CD, описанных в настоящей статье, ра?...

Целью данной статьи является внедрение метода CD-спектроскопии как подхода к изучению конформационных изменений, происходящих в ДНК в присутствии АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих белков, и связывание этих конформационных изменений с экспрессией генов. CD-спектроскопия обеспечив?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Круговая дихроизмная (CD) спектроскопия является простым и удобным методом исследования вторичной структуры и взаимодействий биомолекул. Последние достижения в области CD-спектроскопии позволили детально изучить днк-белковые взаимодействия и конформационную динамику ДНК в различных микросредах для лучшего понимания транскрипционной регуляции in vivo. Область вокруг потенциальной зоны транскрипции должна быть размотана для того, чтобы произошла транскрипция. Это сложный процесс, требующий координации модификаций гистонов, связывания транскрипционного фактора с ДНК и других действий по ремоделированию хроматина. Используя CD-спектроскопию, можно изучать конформационные изменения в промоторной области, вызванные регуляторными белками, такими как АТФ-зависимые ремоделирующие хроматины, для стимулирования транскрипции. Конформационные изменения, происходящие в белке, также можно контролировать. Кроме того, вопросы, касающиеся сродства белка к его целевой ДНК и специфичности последовательности, могут быть решены путем включения мутаций в целевую ДНК. Короче говоря, уникальное понимание этого чувствительного и недорогого метода может предсказать изменения в динамике хроматина, тем самым улучшая понимание транскрипционной регуляции.

ADAAD стабилизирует структуру, похожую на стволовую петлю, на промоутере MYC Предыдущие экспериментальные данные показали, что SMARCAL1 является отрицательным регулятором MYC29. Анализ промоторной области гена MYC длиной 159 bp показал, что п...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Взаимодействие АТФ-зависимого ремоделятора хроматина с лигандом ДНК описано с помощью CD-спектроскопии. Индуцированные конформационные изменения на промоторе гена, проанализированные генерируемыми пиками, могут быть использованы для понимания механизма транскрипционной регуляции.

CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Протокол позволяет визуализировать изменения во второй реструктуре ДНК, индуцированной АТФ-зависимыми белками ремоделирования хроматина. Изменение структуры ДНК может быть коррелировано с регуляцией транскрипции. Это простой и высокочувствительный метод, который использует очень небольшое количество чистой ДНК для регистрации структурных изменений в олигонуклеотиде.Этот метод может дать представление о регуляции транскрипции, опосредованной АТФ-зависимыми белками ремоделирования хроматина. Для начала подготовьте рабочие концентрации буферов и других компонентов реакции свежими и держите их на уровне четырех градусов Цельсия перед настройкой реакций, затем измерьте АТФазную активность белка в присутствии различных молекул ДНК с помощью анализа окисления, связанного с NADH. Смешайте 0,1 миллимоляра ADAAD, два миллимоляра АТФ, 10 наномолярных ДНК и 1X буфер REG в 96-луночной пластине с конечным объемом 250 микролитров.Затем инкубируйте реакцию в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, затем измерьте количество NAD+ с помощью программного обеспечения, поставляемого вместе со считывателем микропластин. Чтобы измерить поглощение на 340 нанометрах, нажмите на анализ NADH и поместите 96-луночную пластину на держатель пластины в инструменте, затем нажмите кнопку считывания пластины, чтобы записать поглощение. Соберите спектры CD в высокопрозрачные кварцевые кюветы.Используйте либо прямоугольные, либо цилиндрические кюветы. Чтобы очистить кюветы, вымойте их водой несколько раз, затем сделайте сканирование воды или буфера в кювете, чтобы проверить, чиста ли она. Для реакций используют очищенные PAGE олигонуклеотиды ДНК.Для быстрого охлаждения нагрейте ДНК при 94 градусах Цельсия в течение трех минут на нагревательном блоке и сразу же охладите ее на льду. Для медленного охлаждения, после нагрева ДНК при 94 градусах Цельсия в течение трех минут, дайте ей остыть до комнатной температуры со скоростью один градус Цельсия в минуту. Чтобы записать базовые спектры, настройте в общей сложности пять контрольных реакций одна за другой в 1,5-миллилитровых центрифужных трубках.Держите реакционный объем на уровне 300 микролитров во всех реакциях. Чтобы записать спектры CD, наладите в общей сложности пять экспериментальных реакций одна за другой в 1,5-миллилитровых центрифужных трубках. Чтобы записать сканирование, включите газ и включите CD-спектрометр.Через 10-15 минут включите лампу, включите водяную баню и установите температуру держателя на уровне 37 градусов цельсия. Затем откройте программное обеспечение спектра компакт-дисков и установите температуру на 37 градусов цельсия, диапазон длин волн от 180 до 300 нанометров, время на точку до 0,5 секунды и номер сканирования на пять, затем нажмите на просмотрщик данных pro, создайте новый файл и переименуйте его с деталями эксперимента и датой. Затем смешайте исходные и экспериментальные реакции путем пипетирования и осторожно перенесите реакционные смеси одну за другой на кювету, убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.Если вы проводите эксперимент с временным курсом, инкубируйте реакции при 37 градусах Цельсия в течение необходимого времени, затем пройдите сканирование. Добавьте ЭДТА в буфер, содержащий ДНК, АТФ, магний и белок, чтобы остановить гидролиз АТФ. Чтобы полностью ингибировать активность АТФазы, увеличивают концентрацию ЭДТА и время инкубации.Вычтите исходные линии из соответствующих реакций в программном обеспечении и сгладьте данные либо в программном обеспечении спектра компакт-дисков, либо в программном обеспечении для построения данных, затем постройте график длины волны против средней эллиптичности остатка и проанализируйте пики. М-складки показали, что обе нити ДНК MYC могут образовывать стволовую петлообразную структуру. Здесь показаны М-складные структуры прямой и обратной последовательности ДНК, содержащей G-квадруплекс GECE.CD-спектры быстро охлаждаемого GECE в отсутствие и присутствии ATP и ADAAD показали, что ADAAD индуцирует два положительных пика, один на 258 нанометров, а другой на 210 нанометров. Добавление ЭДТА отменяет это конформационное изменение. Спектры CD теперь имеют отрицательный 210-нанометровый пик и широкий положительный диапазон с пиками в 230 и 250 нанометров.QGRS mapper и M-fold анализ показали, что промоторные области DROSHA, DGCR8 и DICER обладают потенциалом для формирования G-квадруплексных и стволовых структур. Спектры CD пятой пары DROSHA показали, что ADAAD индуцирует отрицательный пик в 210 нанометров и положительный пик в 260 нанометров. Этот спектр является характеристикой ADNA.Спектры CD DGCR8 первой пары показали положительный пик в 210 нанометров и широкий отрицательный пик в 260 нанометров. Этот спектр характерен для перехода от B к X. Для пары DGCR8 семь были замечены сильные положительные пики на 210 и 270 нанометрах и отрицательный пик на 250 нанометрах.Этот спектр характерен для параллельных структур G-квадруплексной ДНК. Наконец, для пары DICER один наблюдал положительный пик на 210 нанометров и два отрицательных пика, один на 230 нанометров, а другой на 260 нанометров. Эти пики характерны для перехода ДНК от А к X.Убедитесь, что чистота ДНК и белка составляет 99% и более. Кюветка должна быть чистой, а базовая линия должна быть меньше одной миллидегри. Все реагенты должны быть чистыми, чтобы фон составлял менее одной миллидегри.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...