Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, por el espectrofotómetro CD. V.J. y A.D. fueron apoyados por una beca de CSIR.

1. Concentración de trabajo de los componentes de reacción
<ol><li>Preparar las concentraciones de trabajo de tampones para CD y otros componentes de reacción recientemente (ver Tabla 1) y mantenerlas a 4 °C antes de configurar las reacciones. NOTA: Para las reacciones de CD descritas en este trabajo, las concentraciones de trabajo de los componentes son las siguientes: Tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA...

El propósito de este artículo es introducir la técnica de espectroscopia de CD como un enfoque para estudiar los cambios conformacionales que ocurren en el ADN en presencia de proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP y vincular estos cambios conformacionales a la expresión génica. La espectroscopia de CD proporciona un método rápido y de fácil acceso para estudiar los cambios conformacionales en el ADN.

Un punto crucial a considerar para esta técnica es la pur...

El dicroísmo circular (CD) es una técnica espectroscópica que se basa en la quiralidad inherente de las macromoléculas biológicas que conduce a la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente diestra y zurda. Esta absorción diferencial se conoce como dicroísmo circular. La técnica, por lo tanto, se puede utilizar para delinear la conformación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, que contienen centros quirales1,2.
Las ondas electromagnéticas contienen componentes eléctricos y magnéticos. Tanto el campo eléctrico como el magnético oscilan perpendicularmente a la dirección de propagación de la onda. En el caso de la luz no polarizada, estos campos oscilan en muchas direcciones. Cuando la luz está polarizada circularmente, se obtienen dos campos electromagnéticos a 90° de diferencia de fase entre sí. Las moléculas quirales muestran rotación óptica circular (birrefringencia) tal que absorberán la luz polarizada circularmente diestra y la luz polarizada circularmente zurda en diferentes grados3. El campo eléctrico resultante se trazará como una elipse, una función de la longitud de onda. El espectro de CD se registra, por lo tanto, como elipticidad (q), y los datos se presentan como elipticidad de residuo medio en función de la longitud de onda.
En el caso de las proteínas, el Cα de los aminoácidos (excepto la glicina) es quiral, y este es explotado por espectroscopia de CD para determinar la estructura secundaria de esta macromolécula4. Los espectros de CD de las moléculas de proteínas se registran típicamente en el rango UV lejano. α las proteínas helicoidales tienen dos bandas negativas a 222 nm y 208 nm y un pico positivo a 193 nm4. Las proteínas con estructura secundaria antiparalela de lámina β muestran un pico negativo a 218 nm y un pico positivo a 195 nm4. Las proteínas con estructuras desordenadas muestran baja elipticidad cerca de 210 nm y un pico negativo a 195 nm4. Por lo tanto, los picos / bandas bien definidos para diferentes estructuras secundarias hacen que la EC sea una herramienta conveniente para dilucidar los cambios conformacionales que ocurren en la estructura secundaria de las proteínas durante la desnaturalización, así como la unión al ligando.
Los ácidos nucleicos tienen tres fuentes de quiralidad: la molécula de azúcar, la helicidad de la estructura secundaria y el ordenamiento terciario de largo alcance del ADN en el medio ambiente5,6. Los espectros de CD de los ácidos nucleicos se registran típicamente en el rango de 190 a 300 nm5,6. Cada conformación de ADN, al igual que las proteínas, da un espectro característico, aunque los picos/bandas pueden variar en algunos grados debido a las condiciones de los disolventes y las diferencias en las secuencias de ADN7. El ADN-B, la forma más común, se caracteriza por un pico positivo alrededor de 260-280 nm y un pico negativo alrededor de 245 nm6. Los picos/bandas de ADN en forma de B son generalmente pequeños porque los pares de bases son perpendiculares a la doble hélice, lo que confiere una quiralidad débil a la molécula. El ADN-A da un pico positivo dominante a 260 nm y un pico negativo alrededor de 210 nm6. Z-DNA, la hélice zurda, da una banda negativa a 290 nm y un pico positivo alrededor de 260 nm6. Este ADN también da un pico extremadamente negativo a 205 nm6.
Además de estas conformaciones, el ADN también puede formar tríplex, cuadrúplex y horquillas, todos los cuales se pueden distinguir mediante espectroscopia de CD. El G-quadruplex paralelo da una banda positiva dominante a 260 nm, mientras que el G-quadruplex antiparalelo da una banda negativa a 260 nm y un pico positivo a 290 nm, lo que facilita la distinción entre las dos formas de estructuras cuadrúplex6. Los tríplex no dan un espectro característico8. Por ejemplo, los espectros de un ADN de 36 nucleótidos de largo con el potencial de formar una triple hélice intramolecular que contiene pares de bases G.G.C y T.A.T en presencia de Na+ muestran una fuerte banda negativa a 240 nm y un amplio pico positivo. El amplio pico positivo muestra contribuciones en 266, 273 y 286 nm. El mismo oligonucleótido en presencia de Na+ y Zn+ muestra cuatro bandas negativas (213, 238, 266 y 282 nm) y un pico positivo a 258 nm. Por lo tanto, los espectros del ADN triplex pueden variar dependiendo de las condiciones de sal8.
Además de estas conformaciones, los espectros de CD han permitido la identificación de otra forma de ADN llamada X-DNA. El ADN-X se forma cuando la secuencia de ADN contiene residuos alternativos de adenina y timina. Los espectros CD de X-DNA contienen dos picos negativos a 250 y 280 nm. Se dispone de muy poca información sobre el ADN-X, aunque se ha especulado que funciona como un sumidero para el superboling positivo6,9. Los cambios en los espectros de CD también pueden revelar detalles sobre las interacciones ligando-proteína y, por lo tanto, se han agregado al arsenal de métodos moleculares para detectar interacciones fármaco-proteína10,11,12,13,14. Los espectros de CD también se han utilizado para monitorizar los cambios en la estructura secundaria de las proteínas durante el proceso de plegamiento15. Del mismo modo, los espectros de CD también se pueden utilizar para sondear las interacciones ligando-ADN16,17.
La espectroscopia de CD, por lo tanto, es un método fácil y económico para distinguir entre las diferentes formas de conformación del ADN, siempre que haya acceso a equipos y software no tan económicos. El método es extremadamente sensible y rápido. Solo requiere una pequeña cantidad de ADN, lo que le da una ventaja sobre la técnica alternativa de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Las valoraciones con ligandos y sustratos también son fáciles de realizar. La principal limitación es que el ADN debe ser altamente puro. Es aconsejable utilizar ADN purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
La información obtenida por los espectros de CD se ha utilizado principalmente para deducir las características estructurales de las proteínas y para identificar distintos conformadores de ADN. En este estudio, los espectros de CD se han utilizado para integrar los resultados obtenidos de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) in vivo para delinear si la proteína de interés / factor de transcripción predicho puede provocar un cambio conformacional en la región promotora de sus genes efectores. Esta colaboración ayuda en el progreso de las técnicas espectroscópicas tradicionales de CD al predecir el mecanismo de regulación de la transcripción por el factor de transcripción predicho en y alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de un promotor.
La remodelación de la cromatina es un mecanismo bien definido conocido por regular los procesos metabólicos del ADN al hacer que la cromatina estrechamente empaquetada sea accesible a varios factores reguladores, como factores de transcripción, componentes de replicación del ADN o proteínas de reparación de daños. Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, también conocidos como la familia de proteínas SWI/SNF, son proteínas remodeladoras clave presentes en las células eucariotas18,19. La agrupación filogenética ha categorizado la familia de proteínas SWI/SNF en 6 subgrupos20: similar a Snf2, similar a Swr1, similar a SSO1653, similar a Rad54, similar a Rad5/16 y distante. SMARCAL1, la proteína de interés en este estudio, pertenece al subgrupo distante20. Esta proteína se ha utilizado para investigar su modo de regulación transcripcional mediante espectroscopia de CD.
Se ha demostrado que la mayoría de los miembros de las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP reposicionan o desalojan nucleosomas o median el intercambio de variantes de histonas de manera dependiente de ATP21,22. Sin embargo, no se ha demostrado que algunos miembros de esta familia remodelen nucleosomas, por ejemplo, SMARCAL1. A pesar de que los estudios han demostrado que SMARCAL1 se asocia con cromosomas de politeno, falta evidencia experimental sobre su capacidad para remodelar nucleosomas23. Por lo tanto, se postuló que SMARCAL1 puede regular la transcripción alterando la conformación del ADN24. La espectroscopia de CD proporcionó un método fácil y accesible para validar esta hipótesis.
SMARCAL1 es una proteína remodeladora de cromatina dependiente de ATP que funciona principalmente como una helicasa de recocido25,26,27. Se ha postulado modular la transcripción mediante la remodelación de la conformación del ADN24. Para probar esta hipótesis, se estudió el papel de SMARCAL1 en la regulación de la transcripción de genes durante el daño al ADN inducido por doxorrubicina. En estos estudios, se utilizó SMARCAL1 para el análisis in vivo y ADAAD para los ensayos in vitro28,29. Estudios previos han demostrado que ADAAD puede reconocer el ADN de una manera dependiente de la estructura pero independiente de la secuencia30,31. La proteína se une de manera óptima a las moléculas de ADN que poseen regiones de transición de doble cadena a una sola cadena, similar al ADN del asa del tallo, e hidroliza ATP 30,31.
Los experimentos in vivo mostraron que SMARCAL1 regula la expresión de MYC, DROSHA, DGCR8 y DICER al unirse a las regiones promotoras28,29. La región de interacción fue identificada por experimentos ChIP28,29. La técnica ChIP se utiliza para analizar la interacción de una proteína con su ADN cognado dentro de la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas, como los factores de transcripción en los promotores u otros sitios de unión al ADN, están unidas a áreas genómicas específicas. La proteína unida al ADN se reticula primero usando formaldehído. Esto es seguido por el aislamiento de la cromatina. La cromatina aislada se cizalla a fragmentos de 500 pb, ya sea por sonicación o digestión de nucleasas, y la proteína unida al ADN se inmunoprecipita utilizando anticuerpos específicos de la proteína. La reticulación se invierte y el ADN se analiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR cuantitativa en tiempo real.
Los resultados de ChIP llevaron a la hipótesis de que SMARCAL1 posiblemente media la regulación transcripcional al inducir un cambio conformacional en las regiones promotoras de estos genes. Se utilizaron el mapeador QGRS y el software Mfold para identificar el potencial de estas regiones promotoras para formar estructuras secundarias28,29. El mapeador QGRS se utiliza para predecir G-quadruplexes32, mientras que Mfold33 analiza la capacidad de una secuencia para formar estructuras secundarias como los bucles de tallo.
Después del análisis de la estructura secundaria, se realizaron más experimentos in vitro con el dominio ATPasa A dependiente del ADN activo (ADAAD) recombinante 6X His-tagged, el homólogo bovino de SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Los ensayos de ATPasa se realizaron utilizando ADAAD para establecer que las secuencias de ADN identificadas podían actuar como efectores28,29. Finalmente, se realizó espectroscopia de CD para monitorizar los cambios conformacionales inducidos en la molécula de ADN por ADAAD28,29.
Para demostrar que la actividad atpasa de la proteína era esencial para inducir un cambio conformacional en la molécula de ADN, se añadió ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) a quelato Mg+2 o neomicina inhibidor del dominio ATPasa A dependiente activo del ADN (ADAADiN), un inhibidor específico de la proteína SWI/SNF35,36 . Esta técnica espectroscópica de CD se puede utilizar con cualquier proteína purificada que haya sido demostrada por ChIP o cualquier otro ensayo relevante para unirse a una región genómica predicha de un promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es un método simple y conveniente para investigar la estructura secundaria y las interacciones de las biomoléculas. Los avances recientes en espectroscopia de CD han permitido el estudio de las interacciones ADN-proteína y la dinámica conformacional del ADN en diferentes microambientes en detalle para una mejor comprensión de la regulación transcripcional in vivo. El área alrededor de una zona de transcripción potencial necesita ser desenrollada para que ocurra la transcripción. Este es un proceso complejo que requiere la coordinación de modificaciones de histonas, la unión del factor de transcripción al ADN y otras actividades de remodelación de la cromatina. Utilizando la espectroscopia de CD, es posible estudiar los cambios conformacionales en la región promotora causados por proteínas reguladoras, como los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, para promover la transcripción. Los cambios conformacionales que ocurren en la proteína también pueden ser monitoreados. Además, las consultas sobre la afinidad de la proteína hacia su ADN objetivo y la especificidad de la secuencia se pueden abordar mediante la incorporación de mutaciones en el ADN objetivo. En resumen, la comprensión única de este método sensible y económico puede predecir cambios en la dinámica de la cromatina, mejorando así la comprensión de la regulación transcripcional.

ADAAD estabiliza una estructura similar a un bucle de vástago en el promotor MYC La evidencia experimental previa mostró que SMARCAL1 es un regulador negativo de MYC29. El análisis de la región promotora larga de 159 pb del gen MYC por el mapeador QGRS mostró que la hebra delantera tenía el potencial de formar un G-quadruplex (Tabla 2). Mfold mostró que ambas hebras del ADN MYC podrí...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

El protocolo nos permite visualizar los cambios en la segunda reestructuración del ADN inducidos por las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP. El cambio en la estructura del ADN se puede correlacionar con la regulación de la transcripción. Esta es una técnica fácil y altamente sensible que utiliza una cantidad muy pequeña de ADN puro para registrar los cambios estructurales en el oligonucleótido.Este método puede proporcionar información sobre la regulación de la transcripción mediada por proteínas de remodelación de cromatina dependientes de ATP. Para comenzar, prepare las concentraciones de trabajo de tampones y otros componentes de reacción fresco y manténgalas a cuatro grados Celsius antes de configurar las reacciones, luego mida la actividad atpasa de la proteína en presencia de diferentes moléculas de ADN utilizando un ensayo de oxidación acoplado a NADH. Mezcle ADAAD 0.1 milimolares, ATP milimolar, 10 ADN nanomolar y 1X REG buffer en una placa de 96 pocillos a un volumen final de 250 microlitros.A continuación, incube la reacción durante 30 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius, luego mida la cantidad de NAD + utilizando el software proporcionado junto con el lector de microplacas. Para medir la absorbancia a 340 nanómetros, haga clic en el ensayo NADH y coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa en el instrumento, luego haga clic en el botón de lectura de la placa para registrar la absorbancia. Recoge los espectros del CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia.Use cubetas rectangulares o cilíndricas. Para limpiar las cubetas, lávelas con agua varias veces, luego tome un escaneo del agua o tampón en la cubeta para verificar si está limpia. Para las reacciones, use oligonucleótidos de ADN purificados con PAGE.Para un enfriamiento rápido, caliente el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos en el bloque de calentamiento e inmediatamente enfríelo en hielo. Para un enfriamiento lento, después de calentar el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos, deje que se enfríe a temperatura ambiente a una velocidad de un grado Celsius por minuto. Para registrar los espectros de referencia, configure un total de cinco reacciones de control una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros.Mantenga el volumen de reacción en 300 microlitros en todas las reacciones. Para registrar los espectros del CD, configure un total de cinco reacciones experimentales una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Para grabar el escaneo, encienda el gas y encienda el espectrómetro de CD.Después de 10 a 15 minutos, encienda la lámpara, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 grados centígrados. A continuación, abra el software de espectro de CD y configure la temperatura a 37 grados Celsius, el rango de longitud de onda de 180 a 300 nanómetros, el tiempo por punto a 0.5 segundos y el número de escaneo a cinco, luego haga clic en el visor de datos profesional, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con los detalles del experimento y la fecha. A continuación, mezcle las reacciones de referencia y experimentales mediante pipeteo y transfiera cuidadosamente las mezclas de reacción una por una a la cubeta, asegurándose de que no haya burbujas de aire.Si realiza un experimento de curso de tiempo, incube las reacciones a 37 grados Celsius durante el tiempo requerido, luego realice el escaneo. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, magnesio y proteína para detener la hidrólisis de ATP. Para inhibir completamente la actividad de la ATPasa, aumente la concentración de EDTA y el tiempo de incubación.Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software y suavice los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos, luego trace un gráfico de longitud de onda contra la elipticidad media de residuos y analice los picos. Los pliegues M mostraron que ambas hebras del ADN MYC podrían formar una estructura similar a un bucle en el tallo. Las estructuras del pliegue M de la secuencia de ADN hacia adelante y la secuencia de ADN inversa que contiene el G quadruplex GECE se muestran aquí.Los espectros de CD de GECE enfriado rápidamente en ausencia y presencia de ATP y ADAAD mostraron que ADAAD induce dos picos positivos, uno a 258 nanómetros y el otro a 210 nanómetros. La adición de EDTA deroga este cambio conformacional. Los espectros de CD ahora tienen un pico negativo de 210 nanómetros y una amplia banda positiva con picos de 230 y 250 nanómetros.El mapeador QGRS y el análisis del pliegue M mostraron que las regiones promotoras de DROSHA, DGCR8 y DICER poseen el potencial de formar estructuras cuadrúplex G y similares al tallo. Los espectros de CD del par cinco de DROSHA mostraron que ADAAD induce un pico negativo a 210 nanómetros y un pico positivo a 260 nanómetros. Este espectro es una característica de ADNA.Los espectros de CD del par uno de DGCR8 mostraron un pico positivo a 210 nanómetros y un amplio pico negativo a 260 nanómetros. Este espectro es característico de la transición de B a X. Para el par siete dgcr8, se observaron fuertes picos positivos a 210 y 270 nanómetros y un pico negativo a 250 nanómetros.Este espectro es característico de las estructuras paralelas de ADN cuadrúplex G. Por último, para el par DICER uno, se observó un pico positivo a 210 nanómetros y dos picos negativos, uno a 230 nanómetros y el otro a 260 nanómetros. Estos picos son característicos de una transición de ADN de A a X.Asegúrese de que la pureza del ADN y la proteína sea del 99% o más. La cubeta debe estar limpia y la línea de base debe ser inferior a un milímetro. Todos los reactivos deben ser puros para que el fondo sea inferior a un milímetro.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Investigación

Bioquímica

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Uso del traste de una sola molécula a estudiar la correlación de las interacciones proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Una plataforma integrada de espectroscopia y espectrometría de masas de Raman para estudiar la admisión, el metabolismo y los efectos de fármacos de una sola célula

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

En Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para el Estudio de Interacciones Proteicas en Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...