Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, por el espectrofotómetro CD. V.J. y A.D. fueron apoyados por una beca de CSIR.

1. Concentración de trabajo de los componentes de reacción
<ol><li>Preparar las concentraciones de trabajo de tampones para CD y otros componentes de reacción recientemente (ver Tabla 1) y mantenerlas a 4 °C antes de configurar las reacciones. NOTA: Para las reacciones de CD descritas en este trabajo, las concentraciones de trabajo de los componentes son las siguientes: Tampón de fosfato de sodio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA...

El propósito de este artículo es introducir la técnica de espectroscopia de CD como un enfoque para estudiar los cambios conformacionales que ocurren en el ADN en presencia de proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP y vincular estos cambios conformacionales a la expresión génica. La espectroscopia de CD proporciona un método rápido y de fácil acceso para estudiar los cambios conformacionales en el ADN.

Un punto crucial a considerar para esta técnica es la pur...

El dicroísmo circular (CD) es una técnica espectroscópica que se basa en la quiralidad inherente de las macromoléculas biológicas que conduce a la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente diestra y zurda. Esta absorción diferencial se conoce como dicroísmo circular. La técnica, por lo tanto, se puede utilizar para delinear la conformación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ADN, que contienen centros quirales1,2.
Las ondas electromagnéticas contienen componentes eléctricos y magnéticos. Tanto el campo eléctrico como el magnético oscilan perpendicularmente a la dirección de propagación de la onda. En el caso de la luz no polarizada, estos campos oscilan en muchas direcciones. Cuando la luz está polarizada circularmente, se obtienen dos campos electromagnéticos a 90° de diferencia de fase entre sí. Las moléculas quirales muestran rotación óptica circular (birrefringencia) tal que absorberán la luz polarizada circularmente diestra y la luz polarizada circularmente zurda en diferentes grados3. El campo eléctrico resultante se trazará como una elipse, una función de la longitud de onda. El espectro de CD se registra, por lo tanto, como elipticidad (q), y los datos se presentan como elipticidad de residuo medio en función de la longitud de onda.
En el caso de las proteínas, el Cα de los aminoácidos (excepto la glicina) es quiral, y este es explotado por espectroscopia de CD para determinar la estructura secundaria de esta macromolécula4. Los espectros de CD de las moléculas de proteínas se registran típicamente en el rango UV lejano. α las proteínas helicoidales tienen dos bandas negativas a 222 nm y 208 nm y un pico positivo a 193 nm4. Las proteínas con estructura secundaria antiparalela de lámina β muestran un pico negativo a 218 nm y un pico positivo a 195 nm4. Las proteínas con estructuras desordenadas muestran baja elipticidad cerca de 210 nm y un pico negativo a 195 nm4. Por lo tanto, los picos / bandas bien definidos para diferentes estructuras secundarias hacen que la EC sea una herramienta conveniente para dilucidar los cambios conformacionales que ocurren en la estructura secundaria de las proteínas durante la desnaturalización, así como la unión al ligando.
Los ácidos nucleicos tienen tres fuentes de quiralidad: la molécula de azúcar, la helicidad de la estructura secundaria y el ordenamiento terciario de largo alcance del ADN en el medio ambiente5,6. Los espectros de CD de los ácidos nucleicos se registran típicamente en el rango de 190 a 300 nm5,6. Cada conformación de ADN, al igual que las proteínas, da un espectro característico, aunque los picos/bandas pueden variar en algunos grados debido a las condiciones de los disolventes y las diferencias en las secuencias de ADN7. El ADN-B, la forma más común, se caracteriza por un pico positivo alrededor de 260-280 nm y un pico negativo alrededor de 245 nm6. Los picos/bandas de ADN en forma de B son generalmente pequeños porque los pares de bases son perpendiculares a la doble hélice, lo que confiere una quiralidad débil a la molécula. El ADN-A da un pico positivo dominante a 260 nm y un pico negativo alrededor de 210 nm6. Z-DNA, la hélice zurda, da una banda negativa a 290 nm y un pico positivo alrededor de 260 nm6. Este ADN también da un pico extremadamente negativo a 205 nm6.
Además de estas conformaciones, el ADN también puede formar tríplex, cuadrúplex y horquillas, todos los cuales se pueden distinguir mediante espectroscopia de CD. El G-quadruplex paralelo da una banda positiva dominante a 260 nm, mientras que el G-quadruplex antiparalelo da una banda negativa a 260 nm y un pico positivo a 290 nm, lo que facilita la distinción entre las dos formas de estructuras cuadrúplex6. Los tríplex no dan un espectro característico8. Por ejemplo, los espectros de un ADN de 36 nucleótidos de largo con el potencial de formar una triple hélice intramolecular que contiene pares de bases G.G.C y T.A.T en presencia de Na+ muestran una fuerte banda negativa a 240 nm y un amplio pico positivo. El amplio pico positivo muestra contribuciones en 266, 273 y 286 nm. El mismo oligonucleótido en presencia de Na+ y Zn+ muestra cuatro bandas negativas (213, 238, 266 y 282 nm) y un pico positivo a 258 nm. Por lo tanto, los espectros del ADN triplex pueden variar dependiendo de las condiciones de sal8.
Además de estas conformaciones, los espectros de CD han permitido la identificación de otra forma de ADN llamada X-DNA. El ADN-X se forma cuando la secuencia de ADN contiene residuos alternativos de adenina y timina. Los espectros CD de X-DNA contienen dos picos negativos a 250 y 280 nm. Se dispone de muy poca información sobre el ADN-X, aunque se ha especulado que funciona como un sumidero para el superboling positivo6,9. Los cambios en los espectros de CD también pueden revelar detalles sobre las interacciones ligando-proteína y, por lo tanto, se han agregado al arsenal de métodos moleculares para detectar interacciones fármaco-proteína10,11,12,13,14. Los espectros de CD también se han utilizado para monitorizar los cambios en la estructura secundaria de las proteínas durante el proceso de plegamiento15. Del mismo modo, los espectros de CD también se pueden utilizar para sondear las interacciones ligando-ADN16,17.
La espectroscopia de CD, por lo tanto, es un método fácil y económico para distinguir entre las diferentes formas de conformación del ADN, siempre que haya acceso a equipos y software no tan económicos. El método es extremadamente sensible y rápido. Solo requiere una pequeña cantidad de ADN, lo que le da una ventaja sobre la técnica alternativa de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Las valoraciones con ligandos y sustratos también son fáciles de realizar. La principal limitación es que el ADN debe ser altamente puro. Es aconsejable utilizar ADN purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).
La información obtenida por los espectros de CD se ha utilizado principalmente para deducir las características estructurales de las proteínas y para identificar distintos conformadores de ADN. En este estudio, los espectros de CD se han utilizado para integrar los resultados obtenidos de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) in vivo para delinear si la proteína de interés / factor de transcripción predicho puede provocar un cambio conformacional en la región promotora de sus genes efectores. Esta colaboración ayuda en el progreso de las técnicas espectroscópicas tradicionales de CD al predecir el mecanismo de regulación de la transcripción por el factor de transcripción predicho en y alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de un promotor.
La remodelación de la cromatina es un mecanismo bien definido conocido por regular los procesos metabólicos del ADN al hacer que la cromatina estrechamente empaquetada sea accesible a varios factores reguladores, como factores de transcripción, componentes de replicación del ADN o proteínas de reparación de daños. Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, también conocidos como la familia de proteínas SWI/SNF, son proteínas remodeladoras clave presentes en las células eucariotas18,19. La agrupación filogenética ha categorizado la familia de proteínas SWI/SNF en 6 subgrupos20: similar a Snf2, similar a Swr1, similar a SSO1653, similar a Rad54, similar a Rad5/16 y distante. SMARCAL1, la proteína de interés en este estudio, pertenece al subgrupo distante20. Esta proteína se ha utilizado para investigar su modo de regulación transcripcional mediante espectroscopia de CD.
Se ha demostrado que la mayoría de los miembros de las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP reposicionan o desalojan nucleosomas o median el intercambio de variantes de histonas de manera dependiente de ATP21,22. Sin embargo, no se ha demostrado que algunos miembros de esta familia remodelen nucleosomas, por ejemplo, SMARCAL1. A pesar de que los estudios han demostrado que SMARCAL1 se asocia con cromosomas de politeno, falta evidencia experimental sobre su capacidad para remodelar nucleosomas23. Por lo tanto, se postuló que SMARCAL1 puede regular la transcripción alterando la conformación del ADN24. La espectroscopia de CD proporcionó un método fácil y accesible para validar esta hipótesis.
SMARCAL1 es una proteína remodeladora de cromatina dependiente de ATP que funciona principalmente como una helicasa de recocido25,26,27. Se ha postulado modular la transcripción mediante la remodelación de la conformación del ADN24. Para probar esta hipótesis, se estudió el papel de SMARCAL1 en la regulación de la transcripción de genes durante el daño al ADN inducido por doxorrubicina. En estos estudios, se utilizó SMARCAL1 para el análisis in vivo y ADAAD para los ensayos in vitro28,29. Estudios previos han demostrado que ADAAD puede reconocer el ADN de una manera dependiente de la estructura pero independiente de la secuencia30,31. La proteína se une de manera óptima a las moléculas de ADN que poseen regiones de transición de doble cadena a una sola cadena, similar al ADN del asa del tallo, e hidroliza ATP 30,31.
Los experimentos in vivo mostraron que SMARCAL1 regula la expresión de MYC, DROSHA, DGCR8 y DICER al unirse a las regiones promotoras28,29. La región de interacción fue identificada por experimentos ChIP28,29. La técnica ChIP se utiliza para analizar la interacción de una proteína con su ADN cognado dentro de la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas, como los factores de transcripción en los promotores u otros sitios de unión al ADN, están unidas a áreas genómicas específicas. La proteína unida al ADN se reticula primero usando formaldehído. Esto es seguido por el aislamiento de la cromatina. La cromatina aislada se cizalla a fragmentos de 500 pb, ya sea por sonicación o digestión de nucleasas, y la proteína unida al ADN se inmunoprecipita utilizando anticuerpos específicos de la proteína. La reticulación se invierte y el ADN se analiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la PCR cuantitativa en tiempo real.
Los resultados de ChIP llevaron a la hipótesis de que SMARCAL1 posiblemente media la regulación transcripcional al inducir un cambio conformacional en las regiones promotoras de estos genes. Se utilizaron el mapeador QGRS y el software Mfold para identificar el potencial de estas regiones promotoras para formar estructuras secundarias28,29. El mapeador QGRS se utiliza para predecir G-quadruplexes32, mientras que Mfold33 analiza la capacidad de una secuencia para formar estructuras secundarias como los bucles de tallo.
Después del análisis de la estructura secundaria, se realizaron más experimentos in vitro con el dominio ATPasa A dependiente del ADN activo (ADAAD) recombinante 6X His-tagged, el homólogo bovino de SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Los ensayos de ATPasa se realizaron utilizando ADAAD para establecer que las secuencias de ADN identificadas podían actuar como efectores28,29. Finalmente, se realizó espectroscopia de CD para monitorizar los cambios conformacionales inducidos en la molécula de ADN por ADAAD28,29.
Para demostrar que la actividad atpasa de la proteína era esencial para inducir un cambio conformacional en la molécula de ADN, se añadió ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) a quelato Mg+2 o neomicina inhibidor del dominio ATPasa A dependiente activo del ADN (ADAADiN), un inhibidor específico de la proteína SWI/SNF35,36 . Esta técnica espectroscópica de CD se puede utilizar con cualquier proteína purificada que haya sido demostrada por ChIP o cualquier otro ensayo relevante para unirse a una región genómica predicha de un promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) es un método simple y conveniente para investigar la estructura secundaria y las interacciones de las biomoléculas. Los avances recientes en espectroscopia de CD han permitido el estudio de las interacciones ADN-proteína y la dinámica conformacional del ADN en diferentes microambientes en detalle para una mejor comprensión de la regulación transcripcional in vivo. El área alrededor de una zona de transcripción potencial necesita ser desenrollada para que ocurra la transcripción. Este es un proceso complejo que requiere la coordinación de modificaciones de histonas, la unión del factor de transcripción al ADN y otras actividades de remodelación de la cromatina. Utilizando la espectroscopia de CD, es posible estudiar los cambios conformacionales en la región promotora causados por proteínas reguladoras, como los remodeladores de cromatina dependientes de ATP, para promover la transcripción. Los cambios conformacionales que ocurren en la proteína también pueden ser monitoreados. Además, las consultas sobre la afinidad de la proteína hacia su ADN objetivo y la especificidad de la secuencia se pueden abordar mediante la incorporación de mutaciones en el ADN objetivo. En resumen, la comprensión única de este método sensible y económico puede predecir cambios en la dinámica de la cromatina, mejorando así la comprensión de la regulación transcripcional.

ADAAD estabiliza una estructura similar a un bucle de vástago en el promotor MYC La evidencia experimental previa mostró que SMARCAL1 es un regulador negativo de MYC29. El análisis de la región promotora larga de 159 pb del gen MYC por el mapeador QGRS mostró que la hebra delantera tenía el potencial de formar un G-quadruplex (Tabla 2). Mfold mostró que ambas hebras del ADN MYC podrí...

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CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

El protocolo nos permite visualizar los cambios en la segunda reestructuración del ADN inducidos por las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP. El cambio en la estructura del ADN se puede correlacionar con la regulación de la transcripción. Esta es una técnica fácil y altamente sensible que utiliza una cantidad muy pequeña de ADN puro para registrar los cambios estructurales en el oligonucleótido.Este método puede proporcionar información sobre la regulación de la transcripción mediada por proteínas de remodelación de cromatina dependientes de ATP. Para comenzar, prepare las concentraciones de trabajo de tampones y otros componentes de reacción fresco y manténgalas a cuatro grados Celsius antes de configurar las reacciones, luego mida la actividad atpasa de la proteína en presencia de diferentes moléculas de ADN utilizando un ensayo de oxidación acoplado a NADH. Mezcle ADAAD 0.1 milimolares, ATP milimolar, 10 ADN nanomolar y 1X REG buffer en una placa de 96 pocillos a un volumen final de 250 microlitros.A continuación, incube la reacción durante 30 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius, luego mida la cantidad de NAD + utilizando el software proporcionado junto con el lector de microplacas. Para medir la absorbancia a 340 nanómetros, haga clic en el ensayo NADH y coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa en el instrumento, luego haga clic en el botón de lectura de la placa para registrar la absorbancia. Recoge los espectros del CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia.Use cubetas rectangulares o cilíndricas. Para limpiar las cubetas, lávelas con agua varias veces, luego tome un escaneo del agua o tampón en la cubeta para verificar si está limpia. Para las reacciones, use oligonucleótidos de ADN purificados con PAGE.Para un enfriamiento rápido, caliente el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos en el bloque de calentamiento e inmediatamente enfríelo en hielo. Para un enfriamiento lento, después de calentar el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos, deje que se enfríe a temperatura ambiente a una velocidad de un grado Celsius por minuto. Para registrar los espectros de referencia, configure un total de cinco reacciones de control una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros.Mantenga el volumen de reacción en 300 microlitros en todas las reacciones. Para registrar los espectros del CD, configure un total de cinco reacciones experimentales una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Para grabar el escaneo, encienda el gas y encienda el espectrómetro de CD.Después de 10 a 15 minutos, encienda la lámpara, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 grados centígrados. A continuación, abra el software de espectro de CD y configure la temperatura a 37 grados Celsius, el rango de longitud de onda de 180 a 300 nanómetros, el tiempo por punto a 0.5 segundos y el número de escaneo a cinco, luego haga clic en el visor de datos profesional, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con los detalles del experimento y la fecha. A continuación, mezcle las reacciones de referencia y experimentales mediante pipeteo y transfiera cuidadosamente las mezclas de reacción una por una a la cubeta, asegurándose de que no haya burbujas de aire.Si realiza un experimento de curso de tiempo, incube las reacciones a 37 grados Celsius durante el tiempo requerido, luego realice el escaneo. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, magnesio y proteína para detener la hidrólisis de ATP. Para inhibir completamente la actividad de la ATPasa, aumente la concentración de EDTA y el tiempo de incubación.Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software y suavice los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos, luego trace un gráfico de longitud de onda contra la elipticidad media de residuos y analice los picos. Los pliegues M mostraron que ambas hebras del ADN MYC podrían formar una estructura similar a un bucle en el tallo. Las estructuras del pliegue M de la secuencia de ADN hacia adelante y la secuencia de ADN inversa que contiene el G quadruplex GECE se muestran aquí.Los espectros de CD de GECE enfriado rápidamente en ausencia y presencia de ATP y ADAAD mostraron que ADAAD induce dos picos positivos, uno a 258 nanómetros y el otro a 210 nanómetros. La adición de EDTA deroga este cambio conformacional. Los espectros de CD ahora tienen un pico negativo de 210 nanómetros y una amplia banda positiva con picos de 230 y 250 nanómetros.El mapeador QGRS y el análisis del pliegue M mostraron que las regiones promotoras de DROSHA, DGCR8 y DICER poseen el potencial de formar estructuras cuadrúplex G y similares al tallo. Los espectros de CD del par cinco de DROSHA mostraron que ADAAD induce un pico negativo a 210 nanómetros y un pico positivo a 260 nanómetros. Este espectro es una característica de ADNA.Los espectros de CD del par uno de DGCR8 mostraron un pico positivo a 210 nanómetros y un amplio pico negativo a 260 nanómetros. Este espectro es característico de la transición de B a X. Para el par siete dgcr8, se observaron fuertes picos positivos a 210 y 270 nanómetros y un pico negativo a 250 nanómetros.Este espectro es característico de las estructuras paralelas de ADN cuadrúplex G. Por último, para el par DICER uno, se observó un pico positivo a 210 nanómetros y dos picos negativos, uno a 230 nanómetros y el otro a 260 nanómetros. Estos picos son característicos de una transición de ADN de A a X.Asegúrese de que la pureza del ADN y la proteína sea del 99% o más. La cubeta debe estar limpia y la línea de base debe ser inferior a un milímetro. Todos los reactivos deben ser puros para que el fondo sea inferior a un milímetro.

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