Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

Författarna vill tacka Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, för CD-spektrofotometern. V.J. och A.D. stöddes av ett stipendium från CSIR.

1. Arbetskoncentration av reaktionskomponenterna
<ol><li>Förbered arbetskoncentrationerna av buffertar för CD och andra reaktionskomponenter på nytt (se tabell 1) och håll dem vid 4 °C innan reaktionerna sätts upp. OBS: För de CD-reaktioner som beskrivs i detta dokument är komponenternas arbetskoncentrationer följande: Natriumfosfatbuffert (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.</li>
</ol><...

Syftet med denna artikel är att införa CD spektroskopi teknik som ett tillvägagångssätt för att studera konformationella förändringar som förekommer i DNA i närvaro av ATP-beroende kromatin remodeling proteiner och att länka dessa conformational förändringar till genuttryck. CD-spektroskopi ger en snabb och lättillgänglig metod för att studera de konformationella förändringarna i DNA.

En avgörande punkt att överväga för denna teknik är renheten hos DNA och protei...

Cirkulär dichroism (CD) är en spektroskopisk teknik som förlitar sig på den inneboende kiraliteten hos biologiska makromolekyler som leder till differentiell absorption av högerhänt och vänsterhänt cirkulärt polariserat ljus. Denna differentialabsorption kallas cirkulär dichroism. Tekniken kan därför användas för att avgränsa konformationen av biologiska makromolekyler, såsom proteiner och DNA, som båda innehåller kirala centra1,2.
Elektromagnetiska vågor innehåller både elektriska och magnetiska komponenter. Både de elektriska och magnetiska fälten svänger vinkelrätt mot vågutbredningens riktning. Vid opolariserat ljus svänger dessa fält i många riktningar. När ljuset är cirkulärt polariserat erhålls två elektromagnetiska fält vid 90° fasskillnad mot varandra. Kirala molekyler visar cirkulär optisk rotation (birefringence) så att de absorberar det högerhänta cirkulärt polariserade ljuset och det vänsterhänta cirkulärt polariserade ljuset i olika utsträckning3. Det resulterande elektriska fältet kommer att spåras som en ellips, en funktion av våglängden. CD-spektrumet registreras således som ellipticity (q), och data presenteras som Mean Residue Ellipticity som en funktion av våglängd.
När det gäller proteiner är Cα av aminosyror (utom glycin) kirala, och detta utnyttjas av CD-spektroskopi för att bestämma den sekundära strukturen hos denna makromolekyl4. CD-spektrat av proteinmolekyler registreras vanligtvis i Fjärran UV-området. α-spiralproteiner har två negativa band vid 222 nm och 208 nm och en positiv topp på 193 nm4. Proteiner med anti-parallell β sekundär struktur visar en negativ topp på 218 nm och en positiv topp på 195 nm4. Proteiner med oordnade strukturer visar låg ellipticity nära 210 nm och en negativ topp på 195 nm4. Således gör den väldefinierade topp/band för olika sekundära strukturer CD till ett bekvämt verktyg för att klargöra de konformationella förändringar som uppstår i proteinernas sekundära struktur under denaturering samt ligandbindning.
Nukleinsyror har tre källor till kiralitet: sockermolekylen, den sekundära strukturens höghet och den långsiktiga efterställningen av DNA i miljön5,6. CD-spektrat av nukleinsyror registreras vanligtvis i intervallet 190 till 300 nm5,6. Varje konformation av DNA, precis som proteiner, ger ett karakteristiskt spektrum, även om topparna/banden kan variera med vissa grader på grund av lösningsmedelsförhållanden och skillnader i DNA-sekvenser7. B-DNA, den vanligaste formen, kännetecknas av en positiv topp runt 260-280 nm och en negativ topp runt 245 nm6. Topparna/banden av B-form-DNA är i allmänhet små eftersom basparen är vinkelräta mot den dubbla spiralen, vilket ger svag kiralitet till molekylen. A-DNA ger en dominerande positiv topp på 260 nm och en negativ topp runt 210 nm6. Z-DNA, den vänsterhänta spiralen, ger ett negativt band vid 290 nm och en positiv topp runt 260 nm6. Detta DNA ger också en extremt negativ topp på 205 nm6.
Förutom dessa konformationer kan DNA också bilda triplexer, quadruplexes och hårnålar, som alla kan särskiljas av CD-spektroskopi. Den parallella G-quadruplex ger ett dominerande positivt band vid 260 nm, medan den anti-parallella G-quadruplex ger ett negativt band vid 260 nm och en positiv topp vid 290 nm, vilket gör det enkelt att skilja mellan de två formerna av quadruplex strukturer6. Triplexer ger inte ett karakteristiskt spektrum8. Till exempel visar spektrat av ett 36 nukleotidlångt DNA med potential att bilda en intramolekylär trippelspiral som innehåller G.G.C och T.A.T baspar i närvaro av Na + ett starkt negativt band vid 240 nm och en bred positiv topp. Den breda positiva toppen visar bidrag på 266, 273 och 286 nm. Samma oligonukleotid i närvaro av Na+ och Zn+ visar fyra negativa band (213, 238, 266 och 282 nm) och en positiv topp på 258 nm. Således kan spektrat av triplex DNA variera beroende på saltförhållanden8.
Utöver dessa konformationer har CD-spektra möjliggjort identifiering av en annan form av DNA som kallas X-DNA. X-DNA bildas när DNA-sekvensen innehåller alternativa adenin- och tyminrester. CD-spektrat av X-DNA innehåller två negativa toppar vid 250 och 280 nm. Mycket lite information finns tillgänglig om X-DNA, även om det har spekulerats fungera som en diskbänk för positiv supercoiling6,9. Förändringar i CD-spektra kan också avslöja detaljer om ligand-proteininteraktioner och har därför lagts till arsenalen av molekylära metoder för att upptäcka läkemedels-proteininteraktioner10,11,12,13,14. CD-spektra har också använts för att övervaka förändringarna i proteinernas sekundära struktur under vikningsprocessen15. På samma sätt kan CD-spektra också användas för att undersöka ligand-DNA-interaktioner16,17.
CD-spektroskopi är därför en enkel, billig metod för att skilja mellan de olika formerna av DNA-konformation, förutsatt att det finns tillgång till inte så billig utrustning och programvara. Metoden är mycket känslig och snabb. Det kräver bara en liten mängd DNA, vilket ger det en fördel över den alternativa tekniken för kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titreringar med ligands och substrat är också lätta att utföra. Den största begränsningen är att DNA:t ska vara mycket rent. Det är lämpligt att använda polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)-renat DNA.
Den information som erhålls genom CD-spektra har främst använts för att härleda proteinstrukturegenskaper och för att identifiera distinkta DNA-konformatörer. I denna studie har CD-spektra använts för att integrera resultaten från ett in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment för att avgränsa om proteinet av intresse /förväntad transkriptionsfaktor kan medföra en konformationell förändring i promotorn regionen av dess effektor gener. Detta samarbete hjälper till att utveckla traditionella CD-spektroskopiska tekniker genom att förutsäga mekanismen för transkriptionsreglering genom den förväntade transkriptionsfaktorn på och runt transkriptionsstartplatsen (TSS) för en promotor.
Kromatinombyggnad är en väldefinierad mekanism som är känd för att reglera DNA-metaboliska processer genom att göra det tätt packade kromatin tillgängligt för olika regulatoriska faktorer som transkriptionsfaktorer, komponenter i DNA-replikering eller reparationsproteiner. De ATP-beroende kromatin remodelers, även känd som SWI/SNF familjen av proteiner, är viktiga remodeler proteiner som finns i eukaryota celler18,19. Fylogenetisk klustring har kategoriserat SWI/SNF-proteinfamiljen i 6 undergrupper20: Snf2-liknande, Swr1-liknande, SSO1653-liknande, Rad54-liknande, Rad5/16-liknande och avlägsen. SMARCAL1, det protein som är av intresse för denna studie, tillhör den avlägsna undergruppen20. Detta protein har använts för att undersöka dess läge för transkriptionell reglering med hjälp av CD spektroskopi.
De flesta av medlemmarna i ATP-beroende kromatin ombyggnadsproteiner har visat sig antingen flytta eller vräka nukleosomer eller medla histonvariantutbyte på ett ATP-beroende sätt21,22. Vissa familjemedlemmar har dock inte visat sig bygga om nukleosomer, t.ex. SMARCAL1. Även om studier har visat att SMARCAL1 associerar med polyten kromosomer, saknas experimentella bevis för dess förmåga att renovera nukleosomer23. Därför var det förutsatt att SMARCAL1 kan reglera transkription genom att ändra konformationen av DNA24. CD-spektroskopi gav en enkel och tillgänglig metod för att validera denna hypotes.
SMARCAL1 är ett ATP-beroende kromatinombyggnadsprotein som främst fungerar som en glödgning helicase25,26,27. Det har postulerats för att modulera transkription genom att omforma DNA-konformationen24. För att testa denna hypotes studerades SMARCAL1 roll i regleringen av gen transkription under doxorubicin-inducerad DNA-skada. I dessa studier användes SMARCAL1 för in vivo-analys och ADAAD för in vitro-analyser28,29. Tidigare studier har visat att ADAAD kan känna igen DNA på ett strukturberoende men sekvensoberoende sätt30,31. Proteinet binder optimalt till DNA-molekyler som har dubbelsträngade till ensträngade övergångsregioner, liknande stamslinga-DNA, och hydrolyserar ATP 30,31.
In vivo-experiment visade att SMARCAL1 reglerar uttrycket av MYC, DROSHA, DGCR8 och DICER genom att binda till promotorregionerna28,29. Interaktionsregionen identifierades genom ChIP-experiment28,29. ChIP-tekniken används för att analysera interaktionen mellan ett protein och dess kognate-DNA i cellen. Dess mål är att avgöra om specifika proteiner, såsom transkriptionsfaktorer på promotorer eller andra DNA-bindningsställen, är bundna till specifika genomiska områden. Proteinet som är bundet till DNA är först korslänkt med formaldehyd. Detta följs av isolering av kromatin. Det isolerade kromatin klipps till 500 bp fragment antingen genom ultraljudsbehandling eller nukleas matsmältning, och proteinet som är bundet till DNA immunoprecipiteras med hjälp av antikroppar som är specifika för proteinet. Korslänkningen är omvänd och DNA analyseras med hjälp av antingen polymeraskedjereaktion (PCR) eller kvantitativt PCR i realtid.
ChIP-resultaten ledde till hypotesen att SMARCAL1 eventuellt förmedlar transkriptionsreglering genom att inducera en konformationell förändring i promotorregionerna för dessa gener. QGRS-mappare och Mfold-programvara användes för att identifiera potentialen hos dessa promotorregioner att bilda sekundära strukturer28,29. QGRS-mapper används för att förutsäga G-quadruplexes32, medan Mfold33 analyserar förmågan hos en sekvens att bilda sekundära strukturer som stamslingor.
Efter sekundär struktur analys utfördes ytterligare in vitro experiment med rekombinant 6X His-tagged Active DNA-beroende ATPase A Domain (ADAAD), bovin homolog av SMARCAL1, renad från Escherichia coli34. ATPase-analyser utfördes med hjälp av ADAAD för att fastställa att de identifierade DNA-sekvenserna kunde fungera som effektorer28,29. Slutligen utfördes CD spektroskopi för att övervaka de konformationella förändringar som induceras i DNA-molekylen av ADAAD28,29.
För att bevisa att proteinets ATPasaktivitet var nödvändig för att inducera en konformationell förändring i DNA-molekylen, tillsattes antingen etylendiamintetrataketsyra (EDTA) till kelat mg+2 eller aktiv DNA-beroende ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en specifik hämmare av SWI/SNF-proteinet, tillsattes35,36 . Denna CD spektroskopisk teknik kan användas med alla renade protein som har visats av ChIP eller någon annan relevant analys för att binda till en förutsedd genomisk region av en promotor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Cirkulär dichroism (CD) spektroskopi är en enkel och bekväm metod för att undersöka den sekundära strukturen och interaktionerna mellan biomolekyler. De senaste framstegen inom CD-spektroskopi har möjliggjort studier av DNA-proteininteraktioner och konformationell dynamik av DNA i olika mikromiljö i detalj för en bättre förståelse av transkriptionell reglering in vivo. Området runt en potentiell transkriptionszon måste avrundas för att transkription ska ske. Detta är en komplex process som kräver samordning av histonmodifieringar, bindning av transkriptionsfaktorn till DNA och andra kromatin ombyggnadsaktiviteter. Med hjälp av CD-spektroskopi är det möjligt att studera konformationella förändringar i promotorregionen som orsakas av regulatoriska proteiner, såsom ATP-beroende kromatin remodelers, för att främja transkription. De konformationella förändringar som uppstår i proteinet kan också övervakas. Dessutom kan frågor om proteinets affinitet mot dess mål-DNA och sekvens specificitet åtgärdas genom att införliva mutationer i mål-DNA. Kort sagt, den unika förståelsen av denna känsliga och billiga metod kan förutsäga förändringar i kromatindynamiken och därigenom förbättra förståelsen för transkriptionsreglering.

ADAAD stabiliserar en stamslingaliknande struktur på MYC-promotorn Tidigare experimentella bevis visade att SMARCAL1 är en negativ regulator av MYC29. Analys av den 159 bp långa promotor regionen av MYC genen av QGRS mapper visade att den främre delen hade potential att bilda en G-quadruplex (tabell 2). Mfold visade att båda strängarna av MYC-DNA:t kunde bilda en stamslingaliknande str...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Interaktionen mellan en ATP-beroende kromatin remodeler med en DNA ligand beskrivs med hjälp av CD spektroskopi. De inducerade konformationella förändringar på en genpromotor analyseras av de toppar som genereras kan användas för att förstå mekanismen för transkriptionell reglering.

CD-spektroskopi för att studera DNA-proteininteraktioner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protokollet tillåter oss att visualisera förändringarna i den andra omstruktureringen av DNA inducerad av ATP-beroende kromatin ombyggnadsproteiner. Förändringen i DNA-strukturen kan korreleras till transkriptionsreglering. Detta är en enkel och mycket känslig teknik som använder en mycket liten mängd rent DNA för att registrera de strukturella förändringarna i oligonukleotid.Denna metod kan ge insikt i transkriptionsreglering förmedlas av ATP-beroende kromatin ombyggnadsproteiner. Till att börja med, förbered arbetskoncentrationerna av buffertar och andra reaktionskomponenter nyligen och håll dem på fyra grader Celsius innan du ställer in reaktionerna och mäter sedan ATPase-aktiviteten hos proteinet i närvaro av olika DNA-molekyler med hjälp av en NADH-kopplad oxidationsanalys. Blanda 0,1 millimolar ADAAD, två millimolar ATP, 10 nanomolar DNA och 1X REG-buffert i en 96-välplatta till en slutlig volym på 250 mikroliter.Därefter inkuberar du reaktionen i 30 minuter i en 37 grader Celsius inkubator och mäter sedan mängden NAD + med hjälp av programvaran som tillhandahålls tillsammans med mikroplattans läsare. För att mäta absorbansen till 340 nanometer, klicka på NADH-analysen och placera 96-brunnsplattan på plåthållaren i instrumentet och klicka sedan på läsplattans knapp för att registrera absorbansen. Samla CD-spektrat i kvarts cuvettes med hög transparens.Använd rektangulära eller cylindriska cuvettes. För att rengöra cuvettesna, tvätta dem med vatten flera gånger och ta sedan en skanning av vattnet eller bufferten i cuvette för att kontrollera om det är rent. För reaktionerna, använd PAGE-renad DNA-oligonukleotider.För snabb kylning, värm DNA vid 94 grader Celsius i tre minuter på värmeblocket och kyl det omedelbart på is. För en långsam kylning, efter uppvärmning av DNA vid 94 grader Celsius i tre minuter, låt det svalna till rumstemperatur med en hastighet av en grad Celsius per minut. För att registrera baslinjespektrat, sätt upp totalt fem kontrollreaktioner en efter en av 1,5 milliliter centrifugrör.Håll reaktionsvolymen på 300 mikroliter i alla reaktioner. För att spela in CD-spektrat, sätt upp totalt fem experimentella reaktioner en efter en på 1,5 milliliter centrifugrör. För att spela in skanningen slår du på gasen och slår på CD-spektrometern.Efter 10 till 15 minuter slår du på lampan, slår på vattenbadet och ställer in hållarens temperatur på 37 grader Celsius. Öppna sedan CD-spektrumprogramvaran och ställ in temperaturen till 37 grader Celsius, våglängdsområdet på 180 till 300 nanometer, tiden per punkt till 0,5 sekunder och skanningsnumret till fem, klicka sedan på pro-datavisaren, skapa en ny fil och byt namn på den med detaljerna i experimentet och datumet. Blanda sedan baslinjen och experimentella reaktioner genom pipettering och överför försiktigt reaktionsblandningarna en efter en till cuvette, vilket säkerställer att det inte finns några luftbubblor.Om du utför ett tidskursexperiment, inkubera reaktionerna vid 37 grader Celsius under den önskade tiden och ta sedan skanningen. Tillsätt EDTA till bufferten som innehåller DNA, ATP, magnesium och protein för att stoppa ATP-hydrolys. För att helt hämma ATPase-aktiviteten, öka EDTA-koncentrationen och inkubationstiden.Subtrahera baslinjerna från motsvarande reaktioner i programvaran och jämna ut data antingen i CD-spektrumprogramvaran eller i data plotting-programvaran, rita sedan ett diagram över våglängd mot medelvärdet resthalt ellipticity och analysera topparna. M-veck visade att båda strängarna av MYC DNA kunde bilda en stam loop-liknande struktur. M-vikningsstrukturerna i framåt och den omvända DNA-sekvensen som innehåller G quadruplex GECE visas här.CD-spektra av snabbkyld GECE i avsaknad och närvaro av ATP och ADAAD visade att ADAAD inducerar två positiva toppar, en på 258 nanometer och den andra på 210 nanometer. Tillägget av EDTA upphäver denna konformationsändring. CD-spektrat har nu en negativ topp på 210 nanometer och ett brett positivt band med toppar på 230 och 250 nanometer.QGRS-mapper och M-fold analys visade att promotorregionerna DROSHA, DGCR8 och DICER har potential att bilda G quadruplex och stem-liknande strukturer. CD-spektrat för DROSHA-paret fem visade att ADAAD inducerar en negativ topp på 210 nanometer och en positiv topp på 260 nanometer. Detta spektrum är ett kännetecken för ADNA.CD-spektrat för DGCR8 par en visade en positiv topp på 210 nanometer och en bred negativ topp på 260 nanometer. Detta spektrum är karakteristiskt för övergången B till X. För DGCR8-paret sju sågs starka positiva toppar på 210 och 270 nanometer och en negativ topp på 250 nanometer.Detta spektrum är karakteristiskt för parallella G quadruplex DNA-strukturer. Slutligen, för DICER-paret en, observerades en positiv topp på 210 nanometer och två negativa toppar, en på 230 nanometer och den andra på 260 nanometer. Dessa toppar är karakteristiska för en A till X DNA-övergång.Se till att renheten hos DNA och protein är 99% eller mer. Cuvettet ska vara rent och baslinjen ska vara mindre än en millidegree. Alla reagenser ska vara rena så att bakgrunden är mindre än en millidegree.

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optisk pincett för att studera RNA-proteininteraktioner i översättningsreglering

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Fluorescens spektroskopi med dubbla färger för att studera protein-proteininteraktion och proteindynamik i levande celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...