Name: cd spectroscopy to study dna-protein interactions
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

Yazarlar CD spektrofotometresi için JNU İleri Enstrümantasyon Araştırma Tesisi'ne teşekkür eder. V.J. ve A.D. CSIR'den bir bursla desteklendi.

1. Reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonu
<ol><li>CD ve diğer reaksiyon bileşenleri için çalışan tampon konsantrasyonlarını yeni bir şekilde hazırlayın ( bkz. Tablo 1) ve reaksiyonları ayarlamadan önce 4 °C'de tutun. NOT: Bu makalede açıklanan CD reaksiyonları için bileşenlerin çalışma konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: Sodyum fosfat tamponu (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM....

Bu makalenin amacı, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin varlığında DNA'da meydana gelen konformasyonsal değişiklikleri incelemek ve bu konformasyonsal değişiklikleri gen ekspresyona bağlamak için bir yaklaşım olarak CD spektroskopi tekniğini tanıtmaktır. CD spektroskopisi, DNA'daki konformasyon değişikliklerini incelemek için hızlı ve kolay erişilebilir bir yöntem sağlar.

Bu teknik için dikkat edilmesi gereken önemli bir nokta DNA ve proteinin ...

Dairesel dikroizm (CD), sağ elini kullanan ve solak dairesel polarize ışığın diferansiyel emilimine yol açan biyolojik makromoleküllerin doğal chiralitesine dayanan spektroskopik bir tekniktir. Bu diferansiyel emilim dairesel dikroizm olarak bilinir. Bu nedenle teknik, her ikisi de chiral merkezleri içeren proteinler ve DNA gibi biyolojik makromoleküllerin konformasyonunu tanımlamak için kullanılabilir1,2.
Elektromanyetik dalgalar hem elektrik hem de manyetik bileşenler içerir. Hem elektriksel hem de manyetik alanlar dalga yayılma yönüne dik olarak salınır. Kutuplaşmamış ışık durumunda, bu alanlar birçok yönde salınır. Işık dairesel olarak polarize edildiğinde, birbirine 90° faz farkıyla iki elektromanyetik alan elde edilir. Chiral molekülleri dairesel optik dönüş (birefringence) gösterir, böylece sağ elle dairesel polarize ışığı ve solak dairesel polarize ışığı farklı derecelerde emerler3. Elde edilen elektrik alanı, dalga boyunun bir işlevi olan elips olarak izlenecektir. CD spektrumu böylece eliptiklik (q) olarak kaydedilir ve veriler dalga boyunun bir işlevi olarak Ortalama Kalıntı Eliptikliği olarak sunulur.
Proteinler söz konusu olduğunda, amino asitlerin Cα'ları (glisine hariç) chiral'dır ve bu makromolekül4'ün ikincil yapısını belirlemek için CD spektroskopisi ile yararlanılmıştır. Protein moleküllerinin CD spektrumları tipik olarak Uzak UV aralığında kaydedilir. α-sarmal proteinler 222 nm ve 208 nm'de iki negatif bant ve 193 nm4'te bir pozitif zirveye sahiptir. Anti-paralel β yaprak ikincil yapıya sahip proteinler 218 nm'de negatif bir zirve ve 195 nm4'te pozitif bir zirve gösterir. Düzensiz yapılara sahip proteinler 210 nm'ye yakın düşük eliptiklik ve 195 nm4'te negatif bir zirve gösterir. Bu nedenle, farklı ikincil yapılar için iyi tanımlanmış tepe / bantlar, CD'yi denatürasyon ve ligand bağlama sırasında proteinlerin ikincil yapısında meydana gelen konformasyonel değişiklikleri aydınlatmak için uygun bir araç haline getirir.
Nükleik asitlerin üç tane chirality kaynağı vardır: şeker molekülü, ikincil yapının helitesi ve ortamdaKI DNA'nın uzun menzilli üçüncül sırası5,6. Nükleik asitlerin CD spektrumları tipik olarak 190 ila 300 nm aralığında kaydedilir5,6. DNA'nın her uyumu, tıpkı proteinler gibi karakteristik bir spektrum sağlar, ancak tepeler / bantlar çözücü koşullar ve DNA dizilerindeki farklılıklar nedeniyle bir dereceye kadar değişebilir7. En yaygın form olan B-DNA, 260-280 nm civarında pozitif bir zirve ve 245 nm6 civarında negatif bir tepe ile karakterizedir. B formu DNA'sının zirveleri/bantları genellikle küçüktür, çünkü baz çiftleri çift sarmala diktir ve moleküle zayıf bir chirality tanır. A-DNA 260 nm'de baskın pozitif zirve ve 210 nm6 civarında negatif bir zirve verir. Solak sarmal olan Z-DNA, 290 nm'de negatif bir bant ve 260 nm6 civarında pozitif bir zirve sağlar. Bu DNA aynı zamanda 205 nm6'da son derece negatif bir zirve verir.
Bu konformasyonlara ek olarak, DNA tripleksler, dört yönlüler ve saç tokaları da oluşturabilir ve bunların hepsi CD spektroskopisi ile ayırt edilebilir. Paralel G-quadruplex 260 nm'de baskın pozitif bant verirken, paralel karşıtı G-quadruplex 260 nm'de negatif bir bant ve 290 nm'de pozitif bir zirve vererek iki dört yönlü yapı biçimini ayırt etmeyi kolaylaştırır6. Tripleks karakteristik bir spektrum vermez8. Örneğin, Na+ varlığında G.G.C ve T.A.T baz çiftlerini içeren intramoleküler üçlü sarmal oluşturma potansiyeline sahip 36 nükleotid uzunluğundaki DNA'nın spektrumu 240 nm'de güçlü bir negatif bant ve geniş bir pozitif zirve göstermektedir. Geniş pozitif zirve 266, 273 ve 286 nm'de katkıları göstermektedir. Na+ ve Zn+'nın varlığında aynı oligonükleotid dört negatif bant (213, 238, 266 ve 282 nm) ve 258 nm'de pozitif bir zirve gösterir. Bu nedenle, tripleks DNA tayfı tuz koşullarına bağlı olarak değişebilir8.
Bu konformasyonlara ek olarak, CD spektrası X-DNA adı verilen başka bir DNA formunun tanımlanmasını sağlamış. DNA dizisi alternatif adenin ve timin kalıntıları içerdiğinde X-DNA oluşur. X-DNA'nın CD spektrumları 250 ve 280 nm'de iki negatif tepe içerir. X-DNA hakkında çok az bilgi mevcuttur, ancak pozitif supercoiling için bir lavabo işlevi görebilmiştir6,9. CD spektrumlarındaki değişiklikler ligand-protein etkileşimleri hakkında da ayrıntıları ortaya getirebilir ve bu nedenle, ilaç-protein etkileşimlerini tespit etmek için moleküler yöntemlerin cephaneliğine eklenmiştir10,11,12,13,14. CD spektrumları, katlama işlemi sırasında proteinlerin ikincil yapısındaki değişiklikleri izlemek için de kullanılmıştır15. Benzer şekilde, CD spektrumları ligand-DNA etkileşimlerini yoklamada da kullanılabilir16,17.
Cd spektroskopisi, bu nedenle, çok ucuz olmayan ekipman ve yazılımlara erişim olması koşuluyla, farklı DNA uyum biçimlerini ayırt etmek için kolay ve ucuz bir yöntemdir. Yöntem son derece hassas ve hızlıdır. Sadece az miktarda DNA gerektirir, bu da ona alternatif nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi tekniği üzerinde bir avantaj sağlar. Ligandlar ve substratlar ile titrasyonların yapılması da kolaydır. En büyük kısıtlama DNA'nın son derece saf olması gerektiğidir. Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) saflaştırılmış DNA kullanılması tavsiye edilir.
CD spektrası tarafından elde edilen bilgiler esas olarak protein yapısal özelliklerini çıkarmak ve farklı DNA uyumlularını tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada CD spektrası, in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) deneyinden elde edilen sonuçları entegre etmek için, ilgi proteininin /tahmin edilen transkripsiyon faktörünün efektör genlerinin promotör bölgesinde konformasyonsal bir değişiklik getirip getirmeyeceğini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu işbirliği, bir organizatörün transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) üzerinde ve çevresinde öngörülen transkripsiyon faktörü tarafından transkripsiyon düzenleme mekanizmasını tahmin ederek geleneksel CD spektroskopik tekniklerinin ilerlemesine yardımcı olur.
Kromatin remodeling, sıkıca paketlenmiş kromatin transkripsiyon faktörleri, DNA replikasyonu bileşenleri veya hasar onarım proteinleri gibi çeşitli düzenleyici faktörler için erişilebilir hale getirerek DNA metabolik süreçlerini düzenlediği bilinen iyi tanımlanmış bir mekanizmadır. SWI/SNF protein ailesi olarak da bilinen ATP'ye bağımlı kromatin remodelerleri, ökaryotik hücrelerde bulunan anahtar remodeler proteinlerdir18,19. Filogenetik kümeleme, SWI/SNF protein ailesini 6 alt gruba ayırmıştır20: Snf2 benzeri, Swr1 benzeri, SSO1653 benzeri, Rad54 benzeri, Rad5/16 benzeri ve uzak. Bu çalışmada ilgi çekici protein olan SMARCAL1, uzak alt gruba aittir20. Bu protein, CD spektroskopisi kullanılarak transkripsiyonal regülasyon şeklini araştırmak için kullanılmıştır.
ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin üyelerinin çoğunun nükleozomları yeniden konumlandırdığı veya tahliye ettiği veya histone varyant değişimine ATP'ye bağımlı bir şekilde aracılık ettiği gösterilmiştir21,22. Ancak, bu ailenin bazı üyelerinin nükleozomları yeniden şekillendirdiği gösterilmemiştir, örneğin SMARCAL1. Çalışmalar SMARCAL1'in politen kromozomlarla ilişkili olduğunu göstermiş olsa da, nükleozomları yeniden şekillendirme yeteneğine ilişkin deneysel kanıtlar eksiktir23. Bu nedenle, SMARCAL1'in DNA24 konformasyonunu değiştirerek transkripsiyon düzenleyebileceği ileri sürüldü. CD spektroskopisi, bu hipotezi doğrulamak için kolay ve erişilebilir bir yöntem sağladı.
SMARCAL1, öncelikle tavlama helicase25,26,27 olarak işlev gören atp bağımlı kromatin remodeling proteinidir. DNA konformasyonunu yeniden şekillendirerek transkripsiyonu modüle etmek için postülasyon edilmiştir24. Bu hipotezi test etmek için, doksrubisin kaynaklı DNA hasarı sırasında gen transkripsiyonunun düzenlenmesinde SMARCAL1'in rolü incelenmiştir. Bu çalışmalarda in vivo analiz için SMARCAL1, in vitro tahliller için ADAAD kullanılmıştır28,29. Önceki çalışmalar ADAAD'ın DNA'yı yapıya bağımlı ancak diziden bağımsız bir şekilde tanıyabileceğini göstermiştir30,31. Protein, kök döngü DNA'sına benzer şekilde tek iplikli geçiş bölgelerine çift iplikli dna moleküllerine en uygun şekilde bağlanır ve ATP 30,31'i hidroller.
In vivo deneyler, SMARCAL1'in organizatör bölgelerine bağlanarak MYC, DROSHA, DGCR8 ve DICER'ın ifadesini düzenlediğini gösterdi28,29. Etkileşim bölgesi ChIP deneyleri ile belirlendi28,29. ChIP tekniği, bir proteinin hücre içindeki konyak DNA'sı ile etkileşimini analiz etmek için kullanılır. Amacı, organizatörler veya diğer DNA bağlama bölgelerindeki transkripsiyon faktörleri gibi belirli proteinlerin belirli genomik alanlara bağlı olup olmadığını belirlemektir. DNA'ya bağlı protein ilk olarak formaldehit kullanılarak çapraz bağlanır. Bunu kromatin izolasyonu takip ediyor. İzole kromatin, sonikasyon veya nükleaz sindirimi ile 500 bp parçaya yamaçlanır ve DNA'ya bağlı protein, proteine özgü antikorlar kullanılarak bağışıklık sistemine bağlıdır. Çapraz bağlama tersine çevrilir ve DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya nicel gerçek zamanlı PCR kullanılarak analiz edilir.
ChIP sonuçları, SMARCAL1'in bu genlerin promotör bölgelerinde konformasyonel bir değişiklik yaratarak transkripsiyonel düzenlemeye aracılık ettiği hipotezine yol açtı. QGRS haritalayıcı ve Mfold yazılımı, bu organizatör bölgelerinin ikincil yapılar oluşturma potansiyelini belirlemek için kullanıldı28,29. QGRS eşleyici G-quadruplexes32'yi tahmin etmek için kullanılırken, Mfold33 bir sıranın kök döngüler gibi ikincil yapılar oluşturma yeteneğini analiz eder.
İkincil yapı analizinden sonra, Escherichia coli34'ten arındırılmış SMARCAL1'in sığır homologu olan rekombinant 6X His etiketli Aktif DNA'ya bağımlı ATPase A Domain (ADAAD) ile daha fazla in vitro deney yapıldı. ATPase tahlilleri ADAAD kullanılarak gerçekleştirildi ve tanımlanan DNA dizilerinin efektör olarak işlev görebileceğini belirledi28,29. Son olarak ADAAD28,29 tarafından DNA molekülünde indüklenen konformasyon değişikliklerinin izlenmesi için CD spektroskopisi yapıldı.
Proteinin ATPase aktivitesinin DNA molekülünde konformasyonel bir değişime neden olmak için gerekli olduğunu kanıtlamak için, şelat Mg +2'ye etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) veya SWI/SNF proteininin spesifik bir inhibitörü olan Aktif DNA'ya bağımlı ATPase A Domain Inhibitörü Neomycin (ADAADiN) eklendi35.36 . Bu CD spektroskopik tekniği, chIP veya diğer ilgili testlerle bir organizatörün tahmin edilen genomik bölgesine bağlanmak için gösterilen herhangi bir saflaştırılmış proteinle kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Quartz Cuvette</td>
			<td>STARNA</td>
			<td>21-Q-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chirascan V100 CD spectrometer</td>
			<td>Applied Photophysics</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>SRL</td>
			<td>43272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td>Glutathione affinity chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III cleaning solution</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lactic Dehydrogenase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>&#160;L2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP215-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH disodium salt</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt</td>
			<td>SRL</td>
			<td>40083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>P178-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>P1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cd spectroscopy to study dna-protein interactions

Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi, biyomoleküllerin ikincil yapısını ve etkileşimlerini araştırmak için basit ve kullanışlı bir yöntemdir. CD spektroskopislerindeki son gelişmeler, transkripsiyonel regülasyonun daha iyi anlaşılması için DNA-protein etkileşimlerinin ve DNA'nın konformasyonel dinamiklerinin farklı mikroçevrimlerde ayrıntılı olarak incelenmesini sağlamaktadır. Transkripsiyonun gerçekleşmesi için potansiyel bir transkripsiyon bölgesinin etrafındaki alanın çözilmesi gerekir. Bu, histon modifikasyonlarının koordinasyonunu, transkripsiyon faktörünün DNA'ya bağlanmasını ve diğer kromatin yeniden şekillendirme faaliyetlerini gerektiren karmaşık bir süreçtir. CD spektroskopisi kullanılarak, transkripsiyonu teşvik etmek için ATP'ye bağımlı kromatin remodelerleri gibi düzenleyici proteinlerin neden olduğu promotör bölgesindeki konformasyonsal değişiklikleri incelemek mümkündür. Proteinde meydana gelen konformasyon değişiklikleri de izlenebilir. Ek olarak, proteinin hedef DNA'sına ve dizi özgüllüğüne olan benzeşimi ile ilgili sorgular, hedef DNA'daki mutasyonlar dahil edilerek ele alınabilir. Kısacası, bu hassas ve ucuz yöntemin benzersiz anlayışı kromatin dinamiklerindeki değişiklikleri tahmin edebilir, böylece transkripsiyonel düzenleme anlayışını geliştirebilir.

ADAAD, MYC promotöründeki yapı gibi bir kök döngüyü stabilize eder Önceki deneysel kanıtlar, SMARCAL1'in MYC29'un negatif bir düzenleyicisi olduğunu göstermiştir. MYC geninin 159 bp uzunluğundaki promotör bölgesinin QGRS haritacısı tarafından analizi, ileri telin bir G-quadruplex oluşturma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir (Tablo 2). Mfold, MYC DNA'sının her ...

Watch this Scientific Journal Video about CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions at JoVE.com

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protokol, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin neden olduğu DNA'nın ikinci yeniden yapılanmasındaki değişiklikleri görselleştirmemizi sağlar. DNA yapısındaki değişiklik transkripsiyon yönetmeliği ile ilişkilendirilebilir. Bu, oligonükleotiddeki yapısal değişiklikleri kaydetmek için çok az miktarda saf DNA kullanan kolay ve son derece hassas bir tekniktir.Bu yöntem, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin aracılık ettiği transkripsiyon regülasyonu hakkında fikir verebilir. Başlamak için, tamponların ve diğer reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonlarını taze hazırlayın ve reaksiyonları ayarlamadan önce dört santigrat derecede tutun, ardından NADH bağlantılı oksidasyon testi kullanarak farklı DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini ölçün. 0,1 milimolar ADAAD, iki milimolar ATP, 10 nanomolar DNA ve 1X REG tamponu 96 kuyulu bir plakada 250 mikrolitrelik son hacme karıştırın.Ardından, reaksiyonu 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından mikro plaka okuyucu ile birlikte sağlanan yazılımı kullanarak NAD + miktarını ölçün. Emiciliği 340 nanometre olarak ölçmek için NADH testine tıklayın ve 96 kuyu plakasını enstrümandaki plaka tutucusuna yerleştirin, ardından emiciliği kaydetmek için okuma plakası düğmesine tıklayın. CD spektrumunu yüksek saydamlıklı kuvars cuvettes'te toplayın.Dikdörtgen veya silindirik cuvettes kullanın. Cuvettes temizlemek için, birkaç kez su ile yıkayın, sonra temiz olup olmadığını kontrol etmek için cuvette su veya tampon tarama alın. Reaksiyonlar için PAGE saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın.Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın ve hemen buzda soğutun. Yavaş bir soğutma için, DNA'yı üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtarak oda sıcaklığına dakika başına bir santigrat derece soğumasını bekleyin. Taban çizgisi spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş kontrol reaksiyonunu ayarlayın.Reaksiyon hacmini tüm reaksiyonlarda 300 mikrolitrede tutun. CD spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş deneysel reaksiyon ayarlayın. Taramayı kaydetmek için gazı açın ve CD spektrometresini açın.10 ila 15 dakika sonra lambayı kapatın, su banyoyu kapatın ve tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, CD spektrum yazılımını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye, dalga boyu aralığını 180 ila 300 nanometreye, nokta başına süreyi 0,5 saniyeye ve tarama numarasını beşe ayarlayın, ardından pro veri görüntüleyiciye tıklayın, yeni bir dosya yapın ve deneyin ayrıntıları ve tarihle yeniden adlandırın. Daha sonra, taban çizgisini ve deneysel reaksiyonları pipetleme ile karıştırın ve reaksiyon karışımlarını tek tek cuvette'e dikkatlice aktarın, böylece hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.Bir zaman kursu deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gerekli süre boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından taramayı yapın. ATP hidrolizi durdurmak için DNA, ATP, magnezyum ve protein içeren tampona EDTA ekleyin. ATPase aktivitesini tamamen engellemek için EDTA konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.Yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerini çıkarın ve CD spektrum yazılımındaki veya veri çizim yazılımındaki verileri yumuşatın, ardından ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir dalga boyu grafiği çizin ve zirveleri analiz edin. M-kıvrımları, MYC DNA'sının her iki ipliğinin de kök halka benzeri bir yapı oluşturabileceğini gösterdi. İlerinin M-kat yapıları ve G dörtgen GECE'yi içeren ters DNA dizisi burada gösterilmiştir.ATP ve ADAAD'ın yokluğunda ve varlığında hızlı soğutulmuş GECE'nin CD spektrumu, ADAAD'ın biri 258 nanometrede, diğeri 210 nanometrede olmak üzere iki pozitif zirveye neden olduğunu gösterdi. EDTA'nın eklenmesi bu konformasyonsal değişimi bozmaktadır. CD spektrumları artık negatif 210 nanometre zirvesine ve 230 ve 250 nanometrede zirveleri olan geniş bir pozitif banda sahiptir.QGRS haritalayıcı ve M-fold analizi, DROSHA, DGCR8 ve DICER'in promotör bölgelerinin G dörtgeni ve kök benzeri yapılar oluşturma potansiyeline sahip olduğunu gösterdi. DROSHA çift beş'in CD spektrumu, ADAAD'ın 210 nanometrede negatif bir zirveye ve 260 nanometrede pozitif bir zirveye neden olduğunu gösterdi. Bu spektrum ADNA'nın bir özelliğidir.DGCR8 pair one'ın CD spektrumu 210 nanometrede pozitif bir zirve ve 260 nanometrede geniş bir negatif zirve gösterdi. Bu spektrum B'den X'e geçişin karakteristiğidir. DGCR8 çifti yedi için 210 ve 270 nanometrede güçlü pozitif zirveler ve 250 nanometrede negatif zirve görüldü.Bu spektrum paralel G dörtgen DNA yapılarının karakteristiğidir. Son olarak, Dicer çifti için biri 210 nanometrede pozitif zirve ve biri 230 nanometrede diğeri 260 nanometrede olmak üzere iki negatif zirve gözlendi. Bu tepeler A'dan X'e DNA geçişinin karakteristiğidir.DNA ve protein saflığının% 99 veya daha fazla olduğundan emin olun. Cuvette temiz olmalı ve taban çizgisi bir milidegreden az olmalıdır. Tüm reaktifler saf olmalıdır, böylece arka plan bir milidegreden azdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...