Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

نشكر بيتينا سيمش وجيا صن (إنفينيجين) على رعاية الخبراء للفئران. فلوريان سالومونز وغوران مونسون من Biomedicum Imaging Core (BIC) للمساعدة في الحصول على الصور والاستشارة. التمويل: نشكر الممولين التاليين على دعمهم لهذا المشروع: مجلس البحوث السويدي ، معهد كارولينسكا (مؤسسات KI ، منحة التطوير الوظيفي ، تمويل KID لطلاب الدكتوراه ، وتمويل SFO StratNeuro ، مركز الطب المبتكر) ، مؤسسة أولي وإيلوف إريكسون ، مؤسسة تورنسبيران ، مؤسسة جينسون ، جائزة سفين وإيبا كريستينا هاغبرغس ومنحة الأبحاث ، منحة مشروع كنوت وأليس والنبرغ، ومؤسسة فريدريك وإنغريد تورينغس، ولارس هيرتاس مين، ومؤسسة سرطان الأطفال (بارنبوركارفوندن)، ومؤسسة أوهلن، ومؤسسة أوكي ويبرغس، ومؤسسة توري نيلسونز، ومنحة بدء المؤسسات السويدية ل ERA. تم إنشاء الشكل 4D ، E مع BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي تؤثر على البقاء الجنيني ، وجودة الحقن ، والقراءة. يتم تعريف عمر الحمل للأجنة على أنه E0.5 عند الظهر في يوم القابس المهبلي بعد التزاوج بين عشية وضحاها. يضمن إجراء فحص الموجات فوق الصوتية للحمل في E6.5 في وقت متأخر من بعد الظهر / المساء تطوير الأجنة بما يكفي ليتم تحديدها بواسطة الموجات فوق الصوتية. يسمح الفحص (1) بإجراء فحص مسبق لعدد الفئران الإيجابية للقابس الحامل بالفعل ، (2) يضمن عدم إذابة أي فيروس دون داع وإهداره في حالة عدم حمل الفئران الإيجابية للقابس ، و (3) يقلل من التدخلات غير الضرورية على الفئران (يتجنب الجراحة على الإناث غير الحوامل).
في E7.5 ، تكون الأجنة حساسة للقوى الخارجية ويجب التعامل معها بعناية. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي سحب قرون الرحم أو الضغط على الديسيدوات إلى ارتشاف الجنين. يجب دائما إبقاء أنسجة الرحم رطبة عندما تكون خارج بطن الأنثى لمنع الأنسجة من الجفاف. يجب أن تبقى غالبية الديسيدات داخل بطن الأنثى ، مع تعرض 3-4 فقط للحقن. حدة الإبرة هي محدد حاسم آخر للحقن الناجحة. تؤدي أطراف الإبرة الحادة أو المكسورة إلى تكرار دس الديسيدوات أو الضغط على طين النمذجة قبل الدخول إلى التيار المتردد ، مما قد يزيد من معدل الارتشاف. لذلك ، يجب دائما تخزين الإبر الأرضية والحادة بأمان واستبدالها بعد 2 أنثى كحد أقصى.
يصف هذا البروتوكول كيفية استهداف الصفيحة العصبية بحقنة واحدة من فيروس lentivirus. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح كيف يمكن تكييف فعالية النقل من استنساخ خلية واحدة إلى الدماغ بأكمله. ومع ذلك ، يتم استهداف الأنسجة غير العصبية الأخرى ، بما في ذلك الجلد والظهارة الفموية ، أيضا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم نقل جميع أنواع الخلايا (السلف والخلايا المتباينة) ، مما يجعل هذا النهج فعالا ولكنه غير محدد. يؤدي استخدام MiniPromoters في البنية الفيروسية إلى التعبير المحدد عن الجين المحور في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية15. هذا له ميزة تجنب استخدام Cre المعدلة وراثيا المخصصة ، وبالتالي يقلل من كمية العمالة (صيانة الإجهاد والتنميط الجيني) والتكاليف.
وتشمل القيود المفروضة على نبتون صعوبته التقنية، والتحديات التي تواجه الحصول على إناث حوامل بمعدل ثابت يمكن التنبؤ به، وتكاليف الحصول على أجهزة متخصصة. علاوة على ذلك ، يمكن اعتبار الاستهداف غير الانتقائي للخلايا بواسطة الفيروس اللئيم بمثابة فائدة وقيود على هذه التقنية. يؤدي حقن كميات أكبر في التيار المتردد إلى ظهور13 دماغيا ، على الرغم من تجنب تشوهات الدماغ والدماغ الخارجي مع الأحجام الموضحة هنا15. وبالتالي فإن التأثير السلبي على نمو الدماغ هو خطر مع حقن النانو في الرحم التي يجب تجنبها بعناية عن طريق حقن كميات صحيحة تتكيف مع المرحلة الجنينية وحجم التيار المتردد.
قد تركز التعديلات المستقبلية لهذه التقنية على المدارية الفيروسية. الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAVs) لها أنماط مصلية مختلفة ، والتي ثبت أنها تستهدف بقوة أنواع الخلايا المختلفة في الجهاز العصبي المركزي17,26. ومع ذلك ، لا تندمج AAVs في جينوم الخلية المضيفة ، وبالتالي قد تضيع في الخلايا ذات معدل الانقسام المرتفع. على الرغم من وجود عدة طرق لزيادة خصوصية NEPTUNE ، إلا أن الحيوانات المعدلة وراثيا لا تزال المعيار الذهبي عندما يتعلق الأمر بالتلاعب الجيني في الجسم الحي. تم استخدام الفئران Cas9 وفيروس lentivirus المشفر sgRNA للفحص الجيني في البشرة الجنينية27 ويمكن أيضا تكييفها مع الجهاز العصبي المركزي النامي.
الحقن في AC في E7.5 يستهدف بكفاءة خلايا الأديم العصبي قبل بدء العصب ويستهدف الدماغ النامي بشكل أكثر كفاءة من كهربية الرحم . هذا يسمح بدراسة الإشارات الجينية المهمة لنمو الدماغ من نقطة زمنية سابقة. على النقيض من نماذج الفئران الجينية الكلاسيكية ، يقدم NEPTUNE نهجا مرنا لإجراء تحليل الجينات الوظيفي. يمكن دراسة الأنماط الظاهرية بعد الإفراط في التعبير أو حذف الجينات في غضون أيام إلى أسابيع مقارنة بالأشهر أو السنوات. تسمح حقن تركيبات فيروسية متعددة بالتلاعب بالعديد من الجينات داخل جنين واحد وتجنب توليد بالضربة القاضية المزدوجة أو الثلاثية. لذلك ، لا يوفر NEPTUNE الوقت فحسب ، بل يمكنه أيضا تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في البحث.

الدماغ والحبل الشوكي هي من بين الأعضاء الأولى التي تبدأ التكوين أثناء التكوين الجنيني 1,2. على الرغم من أنه يتم تحديد الجينات المرتبطة باضطرابات النمو العصبي ، إلا أن الاستجواب الوظيفي للمتغيرات الجينية قد تخلف عن 3,4. نظرا لأن توليد الفئران القاضية المشروطة يمكن أن يستغرق شهورا أو سنوات ، فإن تقنية بديلة للتحقيق بسرعة في وظيفة الجينات في الدماغ النامي أمر مثير للاهتمام. في أجنة الفئران ، يحدث العصب - العملية المورفوجينية التي تتحول من خلالها الصفيحة العصبية إلى الأنبوب العصبي لتؤدي إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) - بين الأيام 8 و 10 بعد الحمل5. قبل ظهور العصب ، تتكون الصفيحة العصبية ، كجزء من الأديم الخارجي ، من طبقة واحدة من الخلايا العمودية التي ستتكاثر وتتمايز إلى العديد من أنواع الخلايا العصبية والدبقية داخل الجهاز العصبي المركزي 6,7. لذلك ، للحث تجريبيا على تعديلات طويلة الأمد في التعبير الجيني في الجهاز العصبي المركزي ، فإن استهداف الصفيحة العصبية يوفر مزايا واضحة ، بما في ذلك إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا السلفية.
في علم الأعصاب ، في البويضة الكهربائية 8,9 والنقل الفيروسي لأجنة الفئران تم استخدامها للتلاعب بالتعبير الجيني الجنيني CNS. كان جنين الفرخ النامي نموذجا مفضلا لدراسة وظيفة الجينات أثناء تطور الحبل الشوكي بسبب إمكانية الوصول إلى جنين الفرخ في البويضة وما ينتج عن ذلك من سهولة التلاعب بالتعبير الجيني. على وجه الخصوص ، في بلازميد البلازميد الكهربائي يولد الظروف التجريبية والتحكم في كل الحبل الشوكي الفرخ. يؤدي الكهربية إلى تخلل غشاء الخلية ويوجه الحمض النووي سالب الشحنة بعيدا عن الكاثود (السلبي) نحو الأنود (الإيجابي) عن طريق تطبيق نبضة كهربائية عبر قطبين كهربائيين على الجنين. في الفئران ، في الرحم ، اقتصر الكهربائي بشكل عام على المراحل الجنينية التي اكتمل فيها العصب ، ويتكون الدماغ أو الحبل الشوكي بالفعل من عدة طبقات خلوية ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة الكهربية10. ينتج عن الكهربية البلازميدية تعبير جيني عابر ويستهدف عموما عددا قليلا من الخلايا.
تم استخدام الموجات فوق الصوتية الموجهة في الحقن المجهري للرحم للتلاعب بالهياكل الجنينية المختلفة مثل الجلد والدماغ11،12،13،14. ومع ذلك ، فقد أظهرت الحقن التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي الفئراني النامي فعالية منخفضة أو أثرت سلبا على البقاء الجنيني12،13،14. لذلك ، تم تطوير بروتوكول محسن لتوصيل فيروس lentivirus عالي العيار إلى التجويف الأمنيوسي (AC) في E7.5 ، والذي أطلق عليه اسم NEPTUNE ل neural plate targeting with in uteronano-injection15. أدت الحقن إلى فعالية استهداف طويلة الأمد تبلغ >95٪ من الدماغ بأكمله عند E13.5. علاوة على ذلك ، تم إدخال خطوة تدريجية أثناء التحقق بالموجات فوق الصوتية من الحمل لفرز الإناث والحمل حسب مرحلة النمو لتقليل الإجراءات غير الضرورية على البحث وزيادة نجاح الحقن. ترتبط كفاءة الحقن والبقاء على قيد الحياة ارتباطا وثيقا بزيادة حجم التيار المتردد. لذلك ، تصف هذه الورقة كيفية قياس حجم التيار المتردد قبل الحقن لتوصيل حجم مناسب إلى التيار المتردد الذي لن يسبب ارتشاف الجنين. NEPTUNE هو بديل قوي للنهج الحالية في الرحم ويمكن تكييفه لعدة استخدامات ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، دراسات الكسب والخسارة في الوظائف ، أو تتبع النسب ، أو فحص15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

إن التلاعب بالتعبير الجيني في دماغ الفأر النامي في الرحم يحمل إمكانات كبيرة لدراسات علم الوراثة الوظيفية. ومع ذلك ، فقد اقتصر في السابق إلى حد كبير على التلاعب بالمراحل الجنينية بعد العصبية. تم تطوير بروتوكول لحقن التجويف الأمنيوسي في اليوم الجنيني (E)7.5 وتوصيل الفيروس lentivirus ، وترميز cDNA أو shRNA ، مستهدفا >95٪ من الصفيحة العصبية وخلايا القمة العصبية ، مما يساهم في الدماغ المستقبلي والحبل الشوكي والجهاز العصبي المحيطي. يصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتحقيق نقل ناجح ، بما في ذلك طحن الإبر الشعرية الزجاجية ، والتحقق من الحمل ، والتدريج التنموي باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية ، وأحجام الحقن المثلى المطابقة للمراحل الجنينية. 
باتباع هذا البروتوكول ، من الممكن تحقيق نقل >95٪ من الدماغ النامي مع فيروس lentivirus عالي العيار وبالتالي إجراء معالجة جينية للدماغ بأكمله. في المقابل ، من الممكن تحقيق نقل الفسيفساء باستخدام عيارات فيروسية أقل ، مما يسمح بالفحص الجيني أو تتبع الأنساب. يستهدف الحقن في E7.5 أيضا الأديم الخارجي والقمة العصبية التي تساهم في مقصورات مميزة من العين واللسان والجهاز العصبي المحيطي. وبالتالي توفر هذه التقنية إمكانية التعامل مع التعبير الجيني في الأنسجة المشتقة من الصفائح العصبية والأديم الظاهر للفئران من مراحل ما قبل ريادة الأعمال ، مع الاستفادة من تقليل عدد الفئران المستخدمة في التجارب.

تم جمع الأجنة التي تم حقنها في E7.5باستخدام فيروس hPGK-H2B-GFP lentivirus 11,12 في E13.5 وفحصها تحت مجهر تشريح الفلورسنت (الشكل 5A). ينتج عن النقل الناجح للصفيحة العصبية أجنة ذات تعبير قوي عن مراسل الفلورسنت في الدماغ بشكل رئيسي وفي الأنسجة الأخرى المشتقة من الأديم الخارجي ، على سبيل المثال ، الجلد (الشكل 5A ، B). إن حقن حجم كبير بشكل مفرط (أكبر من الأحجام الموصى بها هنا ، على سبيل المثال ، ≥500 نانولتر) يزيد من الضغط في التيار المتردد ويمكن أن يؤدي إما إلى ارتشاف كامل (البيانات غير معروضة) أو عيوب الأنبوب العصبي مثل exencephaly (الشكل 5A). تؤدي الحقن الناجحة في E7.5 إلى نقل منتظم من الدماغ الأمامي إلى الدماغ الخلفي (الشكل 5C-J).
تحقق عيارات Lentiviral حوالي 2 × 10 10 وحدات معدية (IFU) أكثر من 95٪ من الاستهداف ، في حين أن عيارات ~ 1 ×10 9 IFU تحقق 15٪ من كفاءة الاستهداف15. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استهداف الهياكل التي كان من الصعب استهدافها سابقا باستخدام الكهربية ، مثل الضفيرة المشيمية 17,18 ، (الشكل 5 E ، F). يمكن تعديل فعالية النقل عن طريق ضبط العيار الفيروسي الذي يتم تسليمه إلى AC. تؤدي حقن العيار المنخفض إلى نقل المستنسخات أحادية الخلية (الشكل 5C والشكل 5E والشكل 5G وH) في حين أن استخدام الفيروس عالي العيار ينقل ما يقرب من 100٪ من الدماغ بأكمله (الشكل 5D والشكل 5F والشكل 5H والشكل 5J ). لذلك ، يمكن استخدام NEPTUNE إما للنقل النسيلي ، وتتبع النسب ، ونهج الفحص الجيني أو دراسة الآثار العالمية للإفراط في التعبير الجيني أو خفض التنظيم في الدماغ بأكمله.
تطور عين الثدييات هو نتيجة للاتصال المنظم جيدا بين ثلاثة مشتقات من الأديم الخارجي الجنيني: الشبكية العصبية (NR) وظهارة صبغة الشبكية (RPE) مشتقة من الظهارة العصبية للدماغ الأمامي البطني ، في حين أن الأديم الخارجي السطحي يؤدي إلى العدسة المستقبلية وظهارة القرنية. ومع ذلك ، فإن السدى المركزية والبطانة الخلفية ، وهما الطبقتان الأخريان من القرنية ، مشتقتان من خلايا القمة العصبية في اللحمة المتوسطة حول العين19,20. أظهرت المقاطع الإكليلية من خلال أجنة E13.5 ، التي تم حقنها في E7.5 مع فيروس lentivirus عالي العيار ، على غرار الدماغ ، انتقالا عاليا وموحدا للأنسجة العصبية للعين ، وكذلك العدسة والقرنية واللحمة المتوسطة (الشكل 5K). مع تقدم العصاب ، تؤدي الحقن عند E8.5 و E9.5 إلى استمرار استهداف العدسة وظهارة القرنية (الشكل 5L والشكل 5N) ، في حين أن نقل الأنسجة المشتقة من الأديم العصبي في العين أقل كفاءة عند E8.5 (الشكل 5L ، M) أو لا يستهدف E9.5 (الشكل 5N).
في حين أن معظم الجسيمات الفيروسية تصيب الأنسجة المكشوفة عند الحقن ، فإن بعض الجسيمات تنقل الأنسجة المشتقة غير الخارجية التي تتطور لاحقا (الشكل 6A). تتطور الغدد والقنوات اللعابية حول E11.5 من الظهارة الفموية21 ويتم استهدافها باستخدام NEPTUNE (الشكل 6B). بعد الحقن في E9.5 ، يتم نقل الظهارة اللسانية للسان بشكل جيد. ومع ذلك ، فإن اللحمة المتوسطة الأساسية سالبة (الشكل 6C ؛ تشير الأقواس إلى الخلايا المحولة ؛ تشير العلامات النجمية إلى إشارة التألق الذاتي وليس الخلايا المحولة). بالإضافة إلى ذلك ، هناك مجموعات إيجابية داخل الظهارة اللسانية ، مفصولة بأقسام سالبة (الشكل 6C ، رؤوس الأسهم البيضاء) ، مما يشير إلى نقل سطح الحليمة. تم وصف خلايا القمة العصبية في اللحمة المتوسطة للسان الأساسية وداخل الظهارة اللسانية ، حيث تشارك في تطوير حليمات التذوق وبراعم التذوق22. في الواقع ، تؤدي الحقن في E7.5 إلى نقل واسع النطاق لحامة اللسان المتوسطة عند E13.5 (الشكل 6D) ، مما يشير إلى أن الحقن المبكرة تستهدف خلايا القمة العصبية ، مما يساهم في اللحمة المتوسطة في اللسان.
في الفقاريات ، تعد العقد الجذرية الظهرية (DRGs) مكونا مركزيا للجهاز العصبي المحيطي (PNS) ، حيث تنتقل جميع المدخلات الحسية الجسدية من محيط الجسم (درجة الحرارة والألم والضغط) إلى الدماغ عن طريق تنشيط الخلايا العصبية DRG23. يتم اشتقاق كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في DRG من خلايا القمة العصبية الجذعية24. يؤدي الحقن الفيروسي اللئيم ، الذي يتحكم فيه مروج hPGK في كل مكان في التعبير عن مراسل الفلورسنت ، إلى استهداف واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي والمحيطي (الشكل 7A) ، مما يؤدي إلى نقل كل من الخلايا العصبية والأسلاف في الحبل الشوكي (الشكل 7B) ، وكذلك DRG (الشكل 7C). إن استخدام MiniPromoter ل doublecortin25 يجعل من الممكن قصر تعبير GFP على الخلايا العصبية فقط (15 والشكل 7D ، E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> الشكل 5: كفاءة عالية أو نقل نسيلي مع نبتون. (أ) أجنة E13.5 تحت مجهر تشريح مضاء بإضاءة قياسية (اللوحة اليسرى) ونفس الأجنة مضاءة ل GFP (اللوحة اليمنى). الجنين غير المحقون في أقصى اليسار ، حقن الجنين بنجاح في أقصى اليمين ، مما أدى إلى إشارة إيجابية في الدماغ (الجنين في أقصى اليمين). الجنين الخارجي بسبب الحجم الزائد الذي يتم حقنه (الجنين الأوسط). (ب) استهداف الجلد والدماغ بحقن E7.5. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (C، D) E13.5 صور متحدة البؤرة للدماغ الأمامي مع نقل نسيلي منخفض (C) أو نقل عالي الكفاءة (D). (ج، هاء، ز، ط) النقل الاستنساخي لمناطق مختلفة في الدماغ. (د، و، و، ح، ي) نقل عالي الكفاءة لمناطق مختلفة في الدماغ. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. تمثل فعالية النقل المختلفة مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. (هاء، واو) استهداف الضفيرة المشيمية ، استنساخيا (E) أو بكفاءة عالية (F). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (G، H) الاستهداف النسيلي (G) والاستهداف عالي الكفاءة (H) للدماغ الخلفي، مكبرة في (I، J). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (K) تعبير مراسل GFP في العين عند E13.5 بعد حقن الرحم عند E7.5 (L ، M) تعبير مراسل GFP في العين عند E15.5 بعد حقن الرحم عند E8.5 (L) ، المنطقة المربعة المكبرة في (M) ، أو عند E9.5 (N). يتم تمييز الأوعية الدموية ذاتية الفلورسنت بنجوم بيضاء. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = القرنية; LE = عدسة الظهارة; LF = ألياف العدسة; M = اللحمة المتوسطة; NR = شبكية العين العصبية; ON = العصب البصري; RPE = صبغة شبكية العين الظهارة; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> الشكل 6: نقل الأنسجة غير العصبية في الرحم. (أ) صورة متحدة البؤرة لتجويف الفم E15.5. تم حقن الجنين بفيروس lentivirus المراسل الفلورسنت في E9.5. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (B, C) (B) تكبير اللوحة المضمنة; ظهارة القناة اللعابية المنقولة بالفيروس. (ج) تكبير اللوحة الداخلية؛ الظهارة اللسانية الظهرية المحولة مع فيروس مراسل GFP (قوس أبيض). اللحمة المتوسطة الكامنة المشتقة من خلايا القمة العصبية سلبية. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى الحليمات ذات الخلايا العصبية السلبية المحاطة بالخلايا الظهارية المنقولة بالفيروسات (يتم تمييز خلايا / أوعية الدم ذاتية الفلورسنت بنجوم بيضاء). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (D) صورة تخطيطية ومتحدة البؤرة للحمة اللسان المتوسطة E13.5 بعد الحقن بفيروس مراسل الفلورسنت عند E7.5. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: D = الظهرية; M = اللحمة المتوسطة; N = البلعوم الأنفي; SLD = القناة تحت اللسان; SMD = القناة تحت الفك السفلي; T = اللسان; V = البطني; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> الشكل 7: نقل خلايا العقدة الجذرية الظهرية المشتقة من القمة العصبية. (A) يسمح استهداف NEPTUNE عند E7.5 باستهداف كل من الجهاز العصبي المركزي و PNS. (ب) تظهر الصورة البؤرية للحبل الشوكي E13.5 و DRGs التي تم حقنها بمراسل hPGK-H2B-GFP lentivirus في E7.5 نقل كل من السلف العصبي SOX2+ والخلايا العصبية NeuN+. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C) منطقة مربعة من B تظهر DRG مع تعبير GFP في مجموعات خلايا SOX2+ (الأسهم البيضاء) و NeuN+ (رؤوس الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 20 ميكرومتر (D) صورة متحدة البؤرة للحبل الشوكي E13.5 و DRG المحقونة بفيروس DCX-H2B-GFP lentivirus عند E7.5 ، مستهدفة خلايا DCX + فقط. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (E) منطقة مربعة من D تظهر DRG مع تعبير GFP يقتصر على الخلايا العصبية DCX+ (رؤوس الأسهم البيضاء). خلايا DCX سالبة GFP (الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي; PNS = الجهاز العصبي المحيطي; DRGs = العقد الجذرية الظهرية. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية حقن التجويف الأمنيوسي للفأر عند E7.5 مع lentivirus ، مما يؤدي إلى نقل موحد للصفيحة العصبية بأكملها ، مع الحد الأدنى من الآثار الضارة على البقاء على قيد الحياة أو التطور الجنيني.

استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

يسمح NEPTUNE بالاستهداف والتلاعب الجيني للجهاز العصبي الجنيني للفأر من اليوم الجنيني 7.5 ويتيح توليد نماذج الضربة القاضية أو تتبع النسب في أيام. هذا البروتوكول قابل للتكيف ومرن وسريع. يمكننا تقديم shRNA أو cdRNA أو مكتبات فيروسية مشفرة لمعالجة أسئلة مختلفة في أيام بدلا من أشهر أو سنوات.نتوقع أن يوفر NEPTUNE رؤى في علم الأعصاب ولكن يمكن أيضا تكييفه مع أنظمة الأعضاء الأخرى. يمكن أن يكون تحديد التجويف الأمنيوسي أمرا صعبا للغاية ، لذا خذ وقتك للنظر في صورة الموجات فوق الصوتية وربما يكون لديك كتاب مدرسي أو مورد تشريح آخر في متناول اليد. لبدء تحميل الإبرة ، حرك الإبرة الزجاجية على المكبس المعدني ، مع الحفاظ على كوليت متصلا ولكن مخففا قليلا.ثم ، ادفع الإبرة الشعرية مع المكبس المعدني عبر الحشية الأمامية حتى تصل إلى الفاصل. اضغط على Empty (فارغ) لدفع المكبس إلى داخل الإبرة وطرد الزيت من طرف الإبرة. ثم اضغط على تعبئة لإنشاء فقاعة هواء، تقسم الزيت والمحلول.أخيرا ، اخفض الإبرة ، واغمر الطرف في المحلول ، واضغط على Fill مرة أخرى لتحميل الإبرة. بعد تثبيت أنثى فأرة مخدرة مع تجاويف أمنيوسية مثالية الحجم على طاولة التسخين ، ضع جل العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية وحقن مسكن للألم تحت الجلد. ثم ، قم بتعقيم أسفل البطن عن طريق المسح بقطعة قماش منقوعة ب 0.5 ملليغرام لكل محلول كلورهيكسيدين ملليلتر وجفف الجلد.بعد ذلك ، باستخدام مقص جراحي ، قم بعمل شق جلدي عمودي في خط الوسط بطول 1.5 إلى 2 سم في أسفل البطن. ثم ارفع الجلد بلطف وحرره من طبقة العضلات الأساسية حوالي سنتيمتر واحد حول نقطة الشق لتسهيل الخياطة بعد الجراحة. بعد ذلك ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط يبلغ طوله سنتيمترا واحدا في طبقة العضلات.باستخدام زوج واحد من الملقط ، ارفع جانبا واحدا من الجلد وطبقة العضلات ، ومع زوج آخر ، ابحث عن قرون الرحم. ثم ، باستخدام الملقط ، أمسك الأنسجة بين الأجنة واسحب بعناية كل من قرون الرحم من البطن. عد الأجنة وعددها ، إما من المبيض إلى عنق الرحم أو من عنق الرحم إلى المبيض ، على كلا الجانبين.بعد ذلك ، باستخدام قطعة قطن رطبة ، ادفع جميع الأجنة بلطف إلى تجويف البطن ، باستثناء الثلاثة الأولى التي يتم حقنها. ثم ضع قطرة من PBS على غشاء مرن ملتصق بالفتحة المركزية المستديرة لطبق بتري معدل متاح تجاريا وأمسكه مباشرة فوق الأجنة. أدخل ملقطا مغلقا في شق المرونة ، ثم حرر الملقط لفتح الشق المرن ، وأسقط السائل على الأجنة.باستخدام الملقط ، اسحب قسم الرحم المقابل للأجنة الثلاثة من خلال المرونة وجثم طبق بتري بلطف على بطن الفأر. باستخدام أربعة أقدام طينية ، قم بتأمين وربط طبق بتري فوق البطن لتقليل الضغط على الماوس ، وكذلك تقليل حساسية التصوير لتنفس الفأر وضربات قلبه. بعد ذلك ، باستخدام ملقط وقطعة قطن رطبة ، اضبط الرحم والمرونة لضمان إغلاق المرونة حول جلد الماوس ، مما يمنع تسرب PBS.بعد ذلك ، لتثبيت الرحم ، اضغط على أسطوانة الطين النمذجة لأسفل على يمين الأجنة أو الرحم وأضف PBS إلى طبق Petri حتى يتم تغطية الأجنة والرحم بالكامل ب PBS. لتسهيل تسجيل الحقن ، اغمس مسبار الموجات فوق الصوتية في PBS واضبط الماوس أو الجدول الجراحي بحيث يتم محاذاة الجنين الأول مع مسبار الموجات فوق الصوتية. افحص الأجنة الثلاثة وافحص التجاويف الأمنيوسية.ثم ، باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية ، قم بقياس قطر التجويف الأمنيوسي لتحديد حجم الحقن المناسب. باستخدام وحدة التحكم في الحقن ، اضبط أحجام الحقن المحددة وسرعة الحقن على التباطؤ ، بمعدل حقن يبلغ 23 نانولتر في الثانية. بعد خفض الإبرة في PBS ، باستخدام العجلات الرئيسية على نظام السكك الحديدية ، اضغط على Empty (فارغ) على وحدة التحكم في حاقن النانو حتى يصل السائل إلى طرف الإبرة.ثم ارفع الإبرة من PBS واضغط على حقن للتحقق من تفريغ قطرة من الحجم المطلوب التقريبي. اخفض الإبرة إلى PBS مرة أخرى وحرك الحاقن النانوي باستخدام عجلة المستوى Y على المتلاعب الدقيق لمحاذاة الإبرة مع مسبار الموجات فوق الصوتية والجنين. اضبط زاوية الإبرة باستخدام عجلة زاوية الحقن لضمان زاوية حقن شبه عمودية بالنسبة لجدار الرحم.ثم ، باستخدام عجلة الحقن على المتلاعب الدقيق ، أدخل الإبرة في التجويف الأمنيوسي في حركة واحدة. إذا اختفى طرف الإبرة من صورة الموجات فوق الصوتية، فحرك المسبار إلى الأمام أو الخلف لإعادة الإبرة إلى التركيز البؤري. ثم قم بحقن الحجم المطلوب عن طريق الضغط على حقن لعدد مناسب من المرات.بعد حقن الحجم المطلوب ، انتظر لمدة 5 إلى 10 ثوان قبل سحب الإبرة في حركة واحدة لطيفة. انقل المرحلة إلى الجنين التالي وكرر الحقن للجنينين الآخرين كما هو موضح. بعد ذلك ، ارفع مسبار الموجات فوق الصوتية والإبرة من PBS باستخدام المتلاعب الدقيق ، مع تحويل الإبرة بعيدا عن المشغل لتجنب التلف والإصابة.باستخدام الملقط ، ضع الجنينين الأول والثاني مرة أخرى في البطن عن طريق دفعهما بلطف عبر المرن. ثم، أمسك بلطف الأنسجة المجاورة للجنين الثالث واسحب الرحم نحو الطرف العلوي من الشق المرن. اسحب بلطف الأجنة الرابعة إلى السادسة باستخدام ملقط واسمح للجنين الثالث بالعودة إلى البطن.بعد حقن جميع الأجنة ذات التجاويف الأمنيوسية المثلى ، ادفع الأجنة والرحم بلطف إلى بطن الفأر. يؤدي النقل الناجح للصفيحة العصبية إلى أجنة ذات تعبير قوي عن مراسل الفلورسنت في الدماغ والأنسجة الأخرى المشتقة من الأديم الخارجي ، مثل الجلد. قد يؤدي حقن كميات كبيرة بشكل مفرط إلى عيوب في الأنبوب العصبي، مثل التهاب الدماغ.تؤدي الحقن الناجحة في اليوم الجنيني 7.5 إلى نقل موحد من الدماغ الأمامي إلى الدماغ الخلفي ، بما في ذلك الضفيرة المشيمية . تؤدي حقن العيار المنخفض إلى نقل الحيوانات المستنسخة أحادية الخلية ، في حين أن فيروس العيار العالي ينقل ما يقرب من 100٪ من الدماغ بأكمله. أظهرت المقاطع الإكليلية خلال اليوم الجنيني 13.5 جنينا انتقالا عاليا وموحدا للأنسجة العصبية للعين والعدسة والقرنية واللحمة المتوسطة.بعد الحقن في اليوم الجنيني 9.5 ، تتطور الغدد والقنوات اللعابية حول اليوم الجنيني 11.5 من الظهارة الفموية. يتم نقل الظهارة اللسانية للسان بشكل جيد ، في حين أن اللحمة المتوسطة الكامنة سالبة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم فصل المجموعات الإيجابية داخل الظهارة اللسانية بواسطة أقسام سالبة ، مما يشير إلى نقل سطح الحليم.تؤدي الحقن في اليوم الجنيني 7.5 إلى نقل واسع النطاق للحمة المتوسطة للسان في اليوم الجنيني 13.5 ، مما يشير إلى أن الحقن المبكرة تستهدف خلايا القمة العصبية ، مما يساهم في اللحمة المتوسطة في اللسان. تؤدي الحقن الفيروسية اللسعية أيضا إلى استهداف واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي والمحيطي ، مما يؤدي إلى نقل كل من الخلايا العصبية والأسلاف في الحبل الشوكي ، وكذلك العقد الجذرية الظهرية. الإعداد الجيد ضروري.تأكد من عدم وجود تسرب وأن الأجنة ثابتة بشكل جيد ، بحيث يمكنك التركيز بالكامل على الحقن في تجويف الفئران. بعد نبتون ، يمكن إجراء التحليل بطرق مختلفة ، مثل تحليل الفلورسنت المناعي للدماغ ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو السماح للأجنة المحقونة بالولادة للتحليل السلوكي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في الرحم زرع في نموذج مورين

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...