Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Vi takker Bettina Semsch og Jia Sun (Infinigene) for ekspertpleje af mus; Florian Salomons og Göran Månsson fra Biomedicum Imaging Core (BIC) for hjælp til billedoptagelse og konsultation. Finansiering: Vi takker følgende bidragydere for deres støtte til dette projekt: Det svenske forskningsråd, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID-finansiering og SFO StratNeuro-finansiering, Center of Innovative Medicine), Ollie og Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven og Ebba-Christina Hagbergs Pris og forskningsbevilling, Knut og Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik og Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation og Swedish Foundations Starting Grant til ERA. Figur 4D,E blev oprettet med BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Der er flere trin i denne protokol, der påvirker embryonal overlevelse, kvaliteten af injektionerne og udlæsningen. Embryoners svangerskabsalder defineres som E0.5 ved middagstid dagen for vaginalpluggen efter parring natten over. Udførelse af ultralydskontrol for graviditet ved E6.5 sent på eftermiddagen / aftenen sikrer, at embryonerne udvikles nok til at blive identificeret ved hjælp af ultralyd. Kontrollen (1) giver mulighed for præscreening af, hvor mange plug-positive mus der faktisk er gravide, (2) sikrer, at ingen virus optøes unødigt og spildes i tilfælde af, at plug-positive mus ikke er gravide, og (3) reducerer unødvendige indgreb på mus (undgår operation på ikke-gravide hunner).
Ved E7.5 er embryoner følsomme over for eksterne kræfter og skal håndteres med omhu. For eksempel kan trække i livmoderhornene eller klemme løvfælderne føre til embryoresorption. Livmodervævet skal altid holdes fugtigt, når det er uden for kvindens underliv for at forhindre vævet i at tørre. Størstedelen af løvfælderne skal forblive inde i den kvindelige mave, med kun 3-4 udsat for injektioner. Nåleskarphed er en anden afgørende determinant for vellykkede injektioner. Stumpe eller ødelagte nålespidser resulterer i gentagen stikning af løvfælder eller kompression mod modellervokseret, inden det kommer ind i AC, hvilket kan øge resorptionshastigheden. Derfor bør velmalede og skarpe nåle altid opbevares sikkert og udskiftes efter højst 2 hunner.
Denne protokol beskriver, hvordan man målretter den neurale plade med en enkelt injektion af lentivirus. Desuden viser det, hvordan transduktionseffektivitet kan tilpasses fra enkeltcellekloner til hele hjernen. Imidlertid er andre ikke-neurale væv, herunder huden og det orale epitel, også målrettet. Derudover transduceres alle celletyper (forfædre og differentierede celler), hvilket gør denne tilgang effektiv, men uspecifik. Anvendelsen af MiniPromoters i den virale konstruktion fører til den specifikke ekspression af transgenet i neuroner eller astrocytter15. Dette har den fordel, at man undgår brugen af dedikerede transgene Cre-dyr og reducerer derfor mængden af arbejdskraft (belastningsvedligeholdelse og genotypning) og omkostninger.
NEPTUN's begrænsninger omfatter dets tekniske vanskeligheder, udfordringer med at opnå gravide kvinder i en forudsigelig og konsekvent hastighed og omkostningerne ved at erhverve specialiseret instrumentering. Desuden kan ikke-selektiv målretning af celler med lentivirus ses som både en fordel og en begrænsning af teknikken. Injektion af større volumener i AC resulterer i exencephaly13, selvom hjernemisdannelser og exencephaly undgås med de mængder, der er beskrevet her15. En negativ indvirkning på hjernens udvikling er således en risiko med in utero nano-injektioner, der omhyggeligt skal undgås ved at injicere korrekte mængder tilpasset embryonale stadium og AC-størrelse.
Fremtidige tilpasninger af teknikken kan fokusere på viral tropisme. Adeno-associerede vira (AAV'er) har forskellige serotyper, som har vist sig at være robust målrettet mod forskellige celletyper i CNS17,26. AAV'er integreres imidlertid ikke i værtscellegenomet og kan derfor gå tabt i celler med en høj delingshastighed. Selvom der er flere måder at øge NEPTUNS specificitet på, er transgene dyr stadig guldstandarden, når det kommer til genmanipulation in vivo. Cas9-mus og sgRNA-kodende lentivirus er blevet brugt til genetisk screening i den embryonale epidermis27 og kan også tilpasses den udviklende CNS.
Injektioner i AC ved E7.5 målretter effektivt celler i neuroektodermen før initiering af neurulation og målretter den udviklende hjerne mere effektivt end i utero elektroporation. Dette gør det muligt at studere genetiske signaler, der er vigtige for hjernens udvikling fra et tidligere tidspunkt. I modsætning til klassiske genetiske musemodeller tilbyder NEPTUNE en fleksibel tilgang til at udføre funktionel genanalyse. Fænotyper efter overekspression eller gensletning kan undersøges inden for dage til uger sammenlignet med måneder eller år. Injektioner af flere virale konstruktioner giver mulighed for manipulation af flere gener i et embryo og undgår generering af dobbelt eller tredobbelt knockout dyr. Derfor sparer NEPTUNE ikke kun tid, men kan også reducere antallet af dyr, der anvendes i forskning.

Hjernen og rygmarven er blandt de første organer, der initierer dannelse under embryogenese 1,2. Selvom generne forbundet med neuroudviklingsforstyrrelser identificeres, har den funktionelle undersøgelse af genetiske varianter haltet bagefter 3,4. Da dannelsen af betingede knockout-mus kan tage måneder eller år, er en alternativ teknik til hurtigt at undersøge genfunktionen i den udviklende hjerne af interesse. I museembryoner forekommer neurulation - den morfogenetiske proces, hvorved neuralpladen omdannes til neuralrøret for at give anledning til centralnervesystemet (CNS) - mellem dag 8 og 10 efter undfangelse5. Før neurulationen begynder, består neuralpladen som en del af ektodermen af et enkelt lag søjleceller, der vil sprede sig og differentiere sig i de mange neuronale og gliacelletyper inden for CNS 6,7. For eksperimentelt at fremkalde langvarige ændringer af genekspression i CNS giver målretning mod den neurale plade derfor indlysende fordele, herunder tilgængeligheden af alle stamceller.
Inden for neurovidenskab erder i ovo-elektroporation 8,9 og viral transduktion af museembryoner blevet brugt til at manipulere embryonal CNS-genekspression. Det udviklende kyllingembryo har været en valgmodel til undersøgelse af genfunktion under rygmarvsudvikling på grund af tilgængeligheden af kyllingembryoet i ægget og den deraf følgende lette manipulation af genekspression. Især i ovoplasmid genererer elektroporation eksperimentelle og kontrolbetingelser i hver kylling rygmarv. Elektroporation forårsager cellemembranpermeabilisering og leder negativt ladet DNA væk fra den (negative) katode mod den (positive) anode ved at anvende en elektrisk puls via to elektroder på embryoet. Hos mus har in utero elektroporation generelt været begrænset til embryonale stadier, hvor neurulation er afsluttet, og hjernen eller rygmarven består allerede af flere cellelag, hvilket resulterer i lav elektroporationseffektivitet10. Plasmidelektroporation resulterer i forbigående genekspression og er generelt rettet mod få celler.
Ultralyd-guidet i utero mikroinjektion er blevet brugt til at manipulere forskellige embryonale strukturer såsom hud og hjerne11,12,13,14. Imidlertid har injektioner rettet mod den udviklende murine CNS vist lav effekt eller har negativt påvirket embryonal overlevelse12,13,14. Derfor blev der udviklet en forbedret protokol til levering af højtiter lentivirus i fosterhulen (AC) ved E7.5, som blev døbt NEPTUNE for neural plate targeting med in uteronano-injection15. Injektioner resulterede i en langvarig målretningseffekt på >95% af hele hjernen ved E13.5. Desuden blev der introduceret et iscenesættelsestrin under ultralydsverifikation af graviditet for at sortere kvinder og graviditeter efter udviklingsstadium for at minimere unødvendige procedurer på forsøgsdyr og maksimere injektionssucces. Injektionseffektivitet og overlevelse er tæt forbundet med stigningen i AC-størrelse. Derfor beskriver dette papir, hvordan man måler AC-størrelse før injektion for at levere et passende volumen til AC, der ikke vil forårsage resorption af embryoet. NEPTUN er et robust alternativ til nuværende in utero-tilgange og kan tilpasses til flere anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, gain and loss of function-studier, afstamningssporing eller screening15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

Manipulation af genekspression i den udviklende musehjerne i utero har et stort potentiale for funktionelle genetikstudier. Det har dog tidligere stort set været begrænset til manipulation af embryonale stadier efter neurulation. En protokol blev udviklet til at injicere fosterhulen ved embryonal dag (E) 7.5 og levere lentivirus, kodning af cDNA eller shRNA, rettet mod >95% af neurale plade- og neurale kamceller, hvilket bidrager til den fremtidige hjerne, rygmarv og perifere nervesystem. Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for at opnå en vellykket transduktion, herunder slibning af glaskapillærnåle, graviditetsverifikation, udviklingsmæssig iscenesættelse ved hjælp af ultralydsbilleddannelse og optimale injektionsvolumener matchet med embryonale stadier. 
Efter denne protokol er det muligt at opnå transduktion af >95% af den udviklende hjerne med højtiter lentivirus og dermed udføre genmanipulation i hele hjernen. I modsætning hertil er det muligt at opnå mosaiktransduktion ved hjælp af lavere virale titere, hvilket giver mulighed for genetisk screening eller afstamningssporing. Injektion ved E7.5 er også rettet mod ektoderm og neural crest, der bidrager til forskellige rum i øjet, tungen og det perifere nervesystem. Denne teknik giver således mulighed for at manipulere genekspression i mus neurale plade- og ektodermafledte væv fra præneurulationsstadier med den fordel at reducere antallet af mus, der anvendes i forsøg.

Embryoner injiceret ved E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 blev indsamlet ved E13.5 og undersøgt under fluorescerende dissektionsmikroskop (figur 5A). Vellykket transduktion af neuralpladen resulterer i embryoner med stærk ekspression af en fluorescerende reporter i hjernen hovedsageligt og i andre ektodermafledte væv, fx huden (figur 5A, B). Injektion af et for højt volumen (større end de mængder, der anbefales her, f.eks. ≥500 nL) øger trykket i AC og kan resultere i enten fuldstændig resorption (data ikke vist) eller neuralrørsdefekter såsom exencephaly (figur 5A). Vellykkede injektioner ved E7.5 resulterer i ensartet transduktion fra forhjernen til baghjernen (figur 5C-J).
Lentivirale titere omkring 2 × 10 10 infektiøse enheder (IFU) opnår over 95% målretning, mens titre på ~ 1 ×10 9 IFU opnår 15% målretning effektivitet15. Derudover er strukturer, der tidligere har været vanskelige at målrette ved hjælp af elektroporation, såsom choroid plexus17,18, også målrettet (figur 5 E, F). Transduktionseffektivitet kan ændres ved at justere den virale titer, der leveres til AC. Injektioner af lav titer resulterer i transduktion af enkeltcellekloner (figur 5C, figur 5E og figur 5G, H), mens brug af højtitervirus transducerer næsten 100% af hele hjernen (figur 5D, figur 5F, figur 5H og figur 5J ). Derfor kan NEPTUNE bruges til enten klonal transduktion, afstamningssporing og genetiske screeningsmetoder eller studere de globale virkninger af genoverekspression eller nedregulering i hele hjernen.
Pattedyrs øjenudvikling er resultatet af velorganiseret kommunikation mellem tre derivater af embryonal ektoderm: den neurale nethinde (NR) og retinal pigmentepitel (RPE) er afledt af neuroepitelet i den ventrale forhjerne, mens overfladeektodermen giver anledning til det fremtidige linse- og hornhindeepitel. Imidlertid er den centrale stroma og det bageste endotel, de to andre lag af hornhinden, afledt af neurale kamceller i det periokulære mesenchyme19,20. Koronale sektioner gennem E13.5-embryoner, injiceret ved E7.5 med højtiterlentivirus, viste i lighed med hjernen høj og ensartet transduktion af øjets neurale væv såvel som linsen, hornhinden og mesenchymet (figur 5K). Efterhånden som neurulationen skrider frem, resulterer injektioner ved E8.5 og E9.5 i den fortsatte målretning af linse- og hornhindeepitelet (figur 5L og figur 5N), mens transduktion af øjets neuroektodermafledte væv er mindre effektiv ved E8.5 (figur 5L, M) eller ikke målrettet mod E9.5 (figur 5N).
Mens de fleste virale partikler inficerer det udsatte væv ved injektion, transducerer nogle partikler ikke-ektodermalt afledt væv, der udvikler sig senere (figur 6A). Spytkirtler og kanaler udvikler sig omkring E11.5 fra det orale epitel21 og er målrettet mod NEPTUN (figur 6B). Efter injektioner ved E9.5 transduceres tungens sproglige epitel godt; det underliggende mesenkym er imidlertid negativt (figur 6C; parenteser angiver transducerede celler; stjerner angiver autofluorescenssignal ikke transducerede celler). Derudover er der positive klynger inden for det sproglige epitel, adskilt af negative sektioner (figur 6C, hvide pilespidser), hvilket tyder på transduktion af papillaoverfladen. Neurale kamceller er beskrevet i det underliggende tungemesenkym og i det sproglige epitel, hvor de er involveret i udviklingen af smagspapiller og smagsløg22. Faktisk resulterer injektioner ved E7.5 i udbredt transduktion af tungemesenkymet ved E13.5 (figur 6D), hvilket tyder på, at tidlige injektioner er målrettet mod neurale kamceller, hvilket bidrager til mesenchym i tungen.
Hos hvirveldyr er dorsale rodganglier (DRG'er) en central komponent i det perifere nervesystem (PNS), da al somatosensorisk input fra kroppens periferi (temperatur, smerte, tryk) overføres til hjernen via aktivering af DRG-neuronerne23. Både neuroner og gliaceller i DRG er afledt af trunk neurale kamceller24. Lentiviral injektion, hvor den allestedsnærværende hPGK-promotor styrer ekspressionen af den fluorescerende reporter, fører til udbredt målretning af det centrale og perifere nervesystem (figur 7A), der transducerer både neuroner og forfædre i rygmarven (figur 7B) samt DRG (figur 7C). Brug af en MiniPromoter til doublecortin25 gør det muligt at begrænse GFP-ekspression til kun neuroner (15 og figur 7D, E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figur 5: Høj effektivitet eller klonal transduktion med NEPTUN. (A) E13.5-embryoner under et dissektionsmikroskop belyst med standardbelysning (venstre panel) og samme embryoner belyst til GFP (højre panel). Ikke-injiceret embryo yderst til venstre, med succes injiceret embryo yderst til højre, hvilket giver positivt signal i hjernen (embryo længst til højre). Exencephalic embryo på grund af overskydende volumen injiceret (mellemembryo). (B) Hud- og hjernemålretning med E7.5-injektion. Skalabjælke = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokale billeder af forhjernen med lav klonal transduktion (C) eller højeffektiv transduktion (D). (C, E, G, I) Klonal transduktion af forskellige regioner i hjernen. (D, F, H, J) Højeffektiv transduktion af forskellige regioner i hjernen. Skala søjler = 200 μm. Forskellige transduktionseffektiviteter er repræsentative for andre områder af CNS. (E, F) Choroid Plexus målretning, klonalt (E) eller med høj effektivitet (F). Skalabjælker = 200 μm. (G, H) Klonal målretning (G) og højeffektiv (H) målretning af baghjerne, forstørret i (I, J). Skalabjælker = 200 μm. (K) GFP-reporterekspression i øjet ved E13,5 efter in utero-injektion ved E7,5 (L, M) GFP-reporterekspression i øjet ved E15,5 efter in utero-injektion ved E8,5 (L), boksområde forstørret i (M) eller ved E9,5 (N). Autofluorescerende blodkar er markeret med hvide stjerner. Skala søjler = 100 μm. Forkortelser: NEPTUN = neural plate targeting med in uteronano-injection; C = Hornhinde; LE = Linse epitel; LF = Linsefibre; M = Mesenchyme; NR = Neural nethinden; ON = Optisk nerve; RPE = retinal pigment epitel; GFP = grønt fluorescerende protein; CNS = centralnervesystemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figur 6: In utero transduktion af ikke-neurale væv. (A) Konfokalbillede af E15.5 mundhule. Embryo blev injiceret med fluorescerende reporter lentivirus ved E9.5. Skala bar = 200 μm. (B, C) (B) Forstørrelse af indsat panel; spytkanalepitel transduceret med virus. (C) Forstørrelse af indsatspanel; dorsal lingual epitel transduceret med GFP reporter virus (hvid parentes). Det underliggende mesenkym afledt af neurale kamceller er negativt. Hvide pilespidser angiver papiller med negative neurale kamceller omgivet af virustransducerede epitelceller (autofluorescerende blodlegemer/kar er markeret med hvide stjerner). Skalabjælker = 50 μm. (D) Skematisk og konfokalt billede af E13,5 tungemesenkym efter injektioner med fluorescerende reportervirus ved E7.5. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: D = Dorsal; M = Mesenchyme; N = Nasopharynx; SLD = sublingual kanal; SMD = submandibulær kanal; T = tunge; V = Ventral; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figur 7: Transduktion af neurale crest-afledte dorsale rodganglionceller. (A) NEPTUN-målretning ved E7.5 tillader målretning af både CNS og PNS. (B) Konfokalbillede af E13.5 rygmarv og DRG'er injiceret med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus ved E7.5 viser transduktion af både SOX2+ neurale forfædre og NeuN+ neuroner. Skalalinje = 100 μm. (C) Indrammet område af B, der viser DRG med GFP-udtryk i SOX2+ (hvide pile) og NeuN+ (hvide pilespidser) cellepopulationer. Skalabar = 20 μm. (D) Konfokalbillede af E13.5 rygmarv og DRG injiceret med DCX-H2B-GFP lentivirus ved E7.5, kun rettet mod DCX + celler. Skala bar = 100 μm. (E) Bokset område af D, der viser DRG med GFP-ekspression begrænset til DCX + neuroner (hvide pilespidser). DCX-celler er negative for GFP (hvide pile). Skala bar = 20 μm. Forkortelser: NEPTUN = neural plate targeting med in utero nano-injection; CNS = centralnervesystemet; PNS = perifert nervesystem; DRG'er = dorsale rodganglier; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

I denne protokol beskriver vi, hvordan man injicerer musens fosterhule ved E7.5 med lentivirus, hvilket fører til ensartet transduktion af hele neuralpladen med minimale skadelige virkninger på overlevelse eller embryonal udvikling.

Murine neurale plade målretning af In Utero nano-injektion (NEPTUN) på embryonal dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUN tillader målretning og genetisk manipulation af musens embryonale nervesystem fra embryonal dag 7.5 og muliggør generering af knockdown- eller afstamningssporingsmodeller i dage. Denne protokol er tilpasningsdygtig, fleksibel og hurtig. Vi kan levere shRNA, cdRNA eller stregkodede virale biblioteker til at løse forskellige spørgsmål i dage snarere end måneder eller år.Vi forventer, at NEPTUNE vil give indsigt i neurovidenskab, men det kan også tilpasses andre organsystemer. At identificere fosterhulen kan være ret udfordrende, så tag dig tid til at se på ultralydsbilledet og måske have en lærebog eller anden anatomiressource ved hånden. For at begynde at lægge nålen skal du skubbe glasnålen på metalstemplet og holde spændet fastgjort, men let løsnet.Skub derefter kapillærnålen sammen med metalstemplet gennem den forreste pakning, indtil den når afstandsstykket. Tryk på Tom for at skubbe stemplet ind i nålen og udvise olien fra kanylespidsen. Tryk derefter på Fyld for at oprette en luftboble, der deler olien og opløsningen.Til sidst skal du sænke nålen, nedsænke spidsen i opløsningen og trykke på Fyld igen for at lægge nålen. Efter fiksering af en bedøvet kvindelig mus med fosterhulrum i ideel størrelse på varmebordet, skal du anvende øjengel på begge øjne for at forhindre hornhindeudtørring og injicere et smertestillende middel subkutant. Derefter steriliseres underlivet ved at tørre med en klud gennemblødt med 0,5 milligram pr. Milliliter chlorhexidinopløsning og tør huden.Dernæst skal du bruge kirurgisk saks til at lave et 1,5 til 2 centimeter lodret midterlinie hudsnit i underlivet. Løft derefter huden forsigtigt og frigør den fra det underliggende muskellag cirka en centimeter omkring snitpunktet for at lette suturering efter operationen. Lav derefter et lodret midterlinjesnit på en centimeter i muskellaget.Brug et par tang til at løfte den ene side af huden og muskellaget, og med et andet par skal du kigge efter livmoderhornene. Hold derefter vævet mellem embryonerne ved hjælp af tang og træk forsigtigt begge livmoderhorn ud af maven. Tæl og tal embryonerne, enten fra æggestokken til livmoderhalsen eller fra livmoderhalsen til æggestokken, på begge sider.Derefter, med en fugtig vatpind, skal du forsigtigt skubbe alle embryoner tilbage i bukhulen, undtagen de første tre, der skal injiceres. Placer derefter en dråbe PBS på en elastisk membran limet til den runde centrale åbning af en kommercielt tilgængelig modificeret petriskål og hold den umiddelbart over embryonerne. Indsæt lukkede tang i elastikkens snit, slip derefter tangen for at åbne det elastiske snit og slip væsken på embryonerne.Brug tang til at trække den del af livmoderen, der svarer til de tre embryoner, gennem elastikken og forsigtigt sætte petriskålen på musens mave. Brug fire lerfødder til at fastgøre og fastgøre petriskålen over maven for at reducere trykket på musen og også reducere følsomheden af billeddannelse over for musens vejrtrækning og hjerteslag. Brug derefter tang og en fugtig vatpind til at justere livmoderen og elastikken for at sikre, at elastikken er forseglet omkring musens hud, hvilket forhindrer PBS-lækage.For at fiksere livmoderen skal du derefter trykke modelleringslercylinderen ned til højre for embryonerne eller livmoderen og tilføje PBS til petriskålen, indtil embryonerne og livmoderen er helt dækket af PBS. For at lette optagelsen af injektionerne skal du dyppe ultralydssonden i PBS og justere musen eller operationsbordet, så det første embryo er justeret med ultralydssonden. Scan gennem alle tre embryoner og inspicer fosterhulerne.Derefter måles diameteren af fosterhulen ved hjælp af ultralydsmaskinen for at bestemme det passende injektionsvolumen. Brug injektionsregulatoren til at indstille de bestemte injektionsvolumener og injektionshastigheden til langsom med en injektionshastighed på 23 nanoliter pr. Sekund. Når du har sænket nålen i PBS'en ved hjælp af hovedhjulene på skinnesystemet, skal du trykke på Tom på nanoinjektorregulatoren, indtil væsken når nålespidsen.Løft derefter nålen ud af PBS'en, og tryk på Inject for at kontrollere, at en dråbe med omtrentligt ønsket volumen udledes. Sænk nålen ned i PBS igen, og flyt nanoinjektoren med Y-planhjulet på mikromanipulatoren for at justere nålen med ultralydssonden og embryoet. Juster nålevinklen med injektionsvinkelhjulet for at sikre en næsten vinkelret injektionsvinkel i forhold til livmodervæggen.Brug derefter injektionshjulet på mikromanipulatoren til at indsætte nålen i fosterhulen i en bevægelse. Hvis nålespidsen forsvinder fra ultralydsbilledet, skal du flytte sonden frem eller tilbage for at bringe nålen tilbage i fokus. Indsprøjt derefter det ønskede volumen ved at trykke på Injicer i det relevante antal gange.Når det ønskede volumen er blevet injiceret, skal du vente i 5 til 10 sekunder, før du trækker nålen tilbage i en blid bevægelse. Flyt scenen til det næste embryo, og gentag injektionen for de to andre embryoner som demonstreret. Løft derefter ultralydssonden og nålen ud af PBS ved hjælp af mikromanipulatoren, og drej nålen væk fra operatøren for at undgå skader og personskade.Brug tang til at placere det første og andet embryo tilbage i maven ved forsigtigt at skubbe dem gennem elastikken. Tag derefter forsigtigt fat i vævet ved siden af det tredje embryo og træk livmoderen mod den øvre ende af det elastiske snit. Træk forsigtigt det fjerde til det sjette embryo op med pincet og lad det tredje embryo komme ind i maven igen.Når alle embryoner med optimale fosterhulrum er blevet injiceret, skal du forsigtigt skubbe embryonerne og livmoderen tilbage i musens mave. Vellykket transduktion af den neurale plade resulterer i embryoner med stærkt udtryk for en fluorescerende reporter i hjernen og andre ektodermafledte væv, som hud. Injektion af for høje volumener kan resultere i neuralrørsdefekter, såsom exencephaly.Vellykkede injektioner på fosterdag 7,5 resulterer i ensartet transduktion fra forhjernen til baghjernen, herunder choroid plexus. Injektioner af lav titer resulterer i transduktion af enkeltcellekloner, mens højtitervirus transducerer næsten 100% af hele hjernen. Koronale sektioner gennem embryonal dag 13,5 embryoner viste høj og ensartet transduktion af neuralt væv i øjet, linsen, hornhinden og mesenchymet.Efter injektion på fosterdag 9,5 udvikles spytkirtler og kanaler omkring fosterdag 11,5 fra det orale epitel. Tungens sproglige epitel er godt transduceret, mens det underliggende mesenkym er negativt. Derudover adskilles de positive klynger i det sproglige epitel af negative sektioner, hvilket tyder på transduktion af papillaroverfladen.Injektioner på embryonal dag 7.5 resulterer i udbredt transduktion af tungemesenchymet på embryonal dag 13.5, hvilket tyder på, at tidlige injektioner er målrettet mod neurale kamceller, hvilket bidrager til mesenchymet i tungen. Lentivirale injektioner fører også til udbredt målretning af det centrale og perifere nervesystem, der transducerer både neuroner og forfædre i rygmarven samt dorsale rodganglier. God forberedelse er afgørende.Sørg for, at der ikke er lækage, og at embryonerne er godt fastgjort, så du kan fokusere helt på injektionerne i rottehulen. Efter NEPTUN kan analysen udføres ved forskellige metoder, såsom immunfluorescerende analyse af hjernen, enkeltcelle RNA-sekventering eller tillader de injicerede embryoner at blive født til adfærdsanalyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differentiering af Mouse Embryonale stamceller i Serumfrit monolagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Nøjagtig og Phenol Gratis DNA Kønsselektion Dag 30 soembryoner ved PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-fostervand In Utero Transplantation i Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Påvisning af Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline ved hjælp af Nærhed Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...