Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

We bedanken Bettina Semsch en Jia Sun (Infinigene) voor de deskundige verzorging van muizen; Florian Salomons en Göran Månsson van Biomedicum Imaging Core (BIC) voor hulp bij beeldacquisitie en consultatie. Financiering: We bedanken de volgende financiers voor hun steun aan dit project: de Zweedse onderzoeksraad, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID-financiering en SFO StratNeuro-financiering, het Center of Innovative Medicine), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, de Tornspiran Foundation, de Jeansssons Foundation, Sven en Ebba-Christina Hagbergs Prize en research Grant, Knut en Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik en Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation en de Swedish Foundations Starting Grant to ERA. Figuur 4D,E zijn gemaakt met BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Er zijn verschillende stappen in dit protocol die de embryonale overleving, de kwaliteit van de injecties en de uitlezing beïnvloeden. De zwangerschapsduur van embryo's wordt gedefinieerd als E0,5 's middags op de dag van de vaginale plug na een nachtelijke paring. Het uitvoeren van de echografie voor zwangerschap op E6.5 in de late namiddag / avond zorgt ervoor dat de embryo's voldoende ontwikkeld zijn om door echografie te worden geïdentificeerd. De controle (1) maakt het mogelijk om vooraf te screenen hoeveel plug-positieve muizen daadwerkelijk zwanger zijn, (2) zorgt ervoor dat er geen virus onnodig wordt ontdooid en verspild in het geval dat plug-positieve muizen niet zwanger zijn, en (3) vermindert onnodige interventies op muizen (vermijdt chirurgie bij niet-zwangere vrouwen).
Bij E7.5 zijn embryo's gevoelig voor externe krachten en moeten ze met zorg worden behandeld. Het trekken aan de baarmoederhoorns of het knijpen in de deciduas kan bijvoorbeeld leiden tot embryoresorptie. Het baarmoederweefsel moet altijd vochtig worden gehouden wanneer het zich buiten de vrouwelijke buik bevindt om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. De meerderheid van de deciduas moet in de vrouwelijke buik blijven, met slechts 3-4 blootgesteld voor injecties. Naaldscherpte is een andere cruciale determinant voor succesvolle injecties. Stompe of gebroken naaldpunten resulteren in herhaalde prikken van deciduas of compressie tegen de modelleerklei voordat de AC wordt binnengegaan, wat de resorptiesnelheid kan verhogen. Daarom moeten goed gemalen en scherpe naalden altijd veilig worden opgeslagen en vervangen na maximaal 2 vrouwtjes.
Dit protocol beschrijft hoe de neurale plaat te richten met één enkele injectie van lentivirus. Bovendien laat het zien hoe de transductie-efficiëntie kan worden aangepast van eencellige klonen naar de hele hersenen. Andere niet-neurale weefsels, waaronder de huid en het orale epitheel, zijn echter ook gericht. Bovendien worden alle celtypen (voorlopers en gedifferentieerde cellen) getransduceerd, waardoor deze aanpak efficiënt maar niet-specifiek is. Het gebruik van MiniPromoters in het virale construct leidt tot de specifieke expressie van het transgen in neuronen of astrocyten15. Dit heeft het voordeel dat het gebruik van speciale transgene Cre-dieren wordt vermeden en vermindert daarom de hoeveelheid arbeid (stamonderhoud en genotypering) en kosten.
De beperkingen van NEPTUNE omvatten de technische moeilijkheid, uitdagingen bij het verkrijgen van zwangere vrouwen in een voorspelbaar en consistent tempo, en de kosten van het verwerven van gespecialiseerde instrumentatie. Bovendien kan niet-selectieve targeting van cellen door lentivirus worden gezien als zowel een voordeel als een beperking van de techniek. Injectie van grotere volumes in de AC resulteert in exencefalie13, hoewel hersenmisvormingen en exencefalie worden vermeden met de hier beschreven volumes15. Een negatieve impact op de ontwikkeling van de hersenen is dus een risico met in utero nano-injecties die zorgvuldig moeten worden vermeden door het injecteren van de juiste volumes aangepast aan het embryonale stadium en de AC-grootte.
Toekomstige aanpassingen van de techniek kunnen zich richten op viraal tropisme. Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) hebben verschillende serotypen, waarvan is aangetoond dat ze zich robuust richten op verschillende celtypen in het CZS17,26. AAV's integreren echter niet in het genoom van de gastheercel en kunnen daarom verloren gaan in cellen met een hoge delingssnelheid. Hoewel er verschillende manieren zijn om de specificiteit van NEPTUNE te vergroten, zijn transgene dieren nog steeds de gouden standaard als het gaat om genmanipulatie in vivo. Cas9-muizen en sgRNA-coderend lentivirus zijn gebruikt voor genetische screening in de embryonale epidermis27 en kunnen ook worden aangepast aan het zich ontwikkelende CZS.
Injecties in de AC op E7.5 richten zich efficiënt op cellen van het neuro-elektro-emtrofme vóór de start van de neurulatie en richten zich efficiënter op de zich ontwikkelende hersenen dan bij utero-elektroporatie . Dit maakt de studie mogelijk van genetische signalen die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van de hersenen vanaf een eerder tijdstip. In tegenstelling tot klassieke genetische muismodellen biedt NEPTUNE een flexibele aanpak om functionele genanalyse uit te voeren. Fenotypen na overexpressie of gendeletie kunnen binnen dagen tot weken worden bestudeerd in vergelijking met maanden of jaren. Injecties van meerdere virale constructies maken de manipulatie van verschillende genen binnen één embryo mogelijk en voorkomen de generatie van dubbele of drievoudige knock-out dieren. Daarom bespaart NEPTUNE niet alleen tijd, maar kan het ook het aantal dieren dat in onderzoek wordt gebruikt verminderen.

De hersenen en het ruggenmerg behoren tot de eerste organen die de vorming tijdens embryogenese in gang zetten 1,2. Hoewel de genen geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen worden geïdentificeerd, is de functionele ondervraging van genetische varianten achtergebleven bij 3,4. Omdat het genereren van voorwaardelijke knock-out muizen maanden of jaren kan duren, is een alternatieve techniek om snel de genfunctie in de zich ontwikkelende hersenen te onderzoeken van belang. Bij muizenembryo's vindt neurulatie - het morfogenetische proces waarbij de neurale plaat transformeert in de neurale buis om het centrale zenuwstelsel (CZS) te veroorzaken - plaats tussen dag 8 en 10 na de conceptie5. Voorafgaand aan het begin van de neurulatie bestaat de neurale plaat, als onderdeel van het ectoderm, uit een enkele laag zuilcellen die zich zullen vermenigvuldigen en differentiëren in de talrijke neuronale en gliaceltypen binnen het CZS 6,7. Daarom, om experimenteel langdurige veranderingen in genexpressie in het CZS te induceren, biedt het richten op de neurale plaat duidelijke voordelen, waaronder de toegankelijkheid van alle voorlopercellen.
In de neurowetenschappen zijn in ovo-elektroporatie 8,9 en virale transductie van muizenembryo's gebruikt om embryonale CZS-genexpressie te manipuleren. Het zich ontwikkelende kuikenembryo is een model bij uitstek geweest voor het bestuderen van de genfunctie tijdens de ontwikkeling van het ruggenmerg vanwege de toegankelijkheid van het kuikenembryo in het ei en het resulterende gemak van het manipuleren van genexpressie. In het bijzonder genereert plasmide-elektroporatie in ovo experimentele en controleomstandigheden in elk ruggenmerg van het kuiken. Elektroporatie veroorzaakt celmembraanpermeabilisatie en leidt negatief geladen DNA weg van de (negatieve) kathode naar de (positieve) anode door een elektrische puls via twee elektroden op het embryo aan te brengen. Bij muizen is elektroporatie in utero over het algemeen beperkt tot embryonale stadia waarin de neurulatie is voltooid, en de hersenen of het ruggenmerg bestaan al uit verschillende cellagen, wat resulteert in een lage elektroporatie-efficiëntie10. Plasmide-elektroporatie resulteert in voorbijgaande genexpressie en richt zich over het algemeen op weinig cellen.
Echogeleide micro-injectie in utero is gebruikt om verschillende embryonale structuren zoals de huid en de hersenen te manipuleren 11,12,13,14. Injecties gericht op het zich ontwikkelende murine CZS hebben echter een lage werkzaamheid aangetoond of hebben een negatieve invloed gehad op de embryonale overleving 12,13,14. Daarom werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de toediening van lentivirus met een hoog titergehalte in de vruchtwaterholte (AC) bij E7.5, dat NEPTUNE werd genoemd voor neural plate targueting with in uteronano-injection15. Injecties resulteerden in een langdurige doelgerichte werkzaamheid van >95% van de hele hersenen op E13,5. Bovendien werd een faseringsstap geïntroduceerd tijdens echografieverificatie van zwangerschap om vrouwtjes en zwangerschappen te sorteren op ontwikkelingsfase om onnodige procedures op proefdieren te minimaliseren en het injectiesucces te maximaliseren. Injectie-efficiëntie en overleving zijn nauw verbonden met de toename van ac-grootte. Daarom beschrijft dit artikel hoe de AC-grootte voorafgaand aan de injectie kan worden gemeten om een geschikt volume aan de AC te leveren dat geen resorptie van het embryo veroorzaakt. NEPTUNE is een robuust alternatief voor de huidige in utero-benaderingen en kan worden aangepast voor verschillende toepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, gain and loss of function studies, lineage tracing of screening15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

Het manipuleren van genexpressie in het zich ontwikkelende muizenbrein in de baarmoeder heeft een groot potentieel voor functionele geneticastudies. Het is echter eerder grotendeels beperkt gebleven tot de manipulatie van embryonale stadia na de neurulatie. Er werd een protocol ontwikkeld om de vruchtwaterholte op embryonale dag (E) 7.5 te injecteren en lentivirus af te leveren, coderend voor cDNA of shRNA, gericht op >95% van de neurale plaat en neurale crestcellen, wat bijdraagt aan de toekomstige hersenen, het ruggenmerg en het perifere zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om succesvolle transductie te bereiken, waaronder het slijpen van de glazen capillaire naalden, zwangerschapsverificatie, ontwikkelingsstadiëring met behulp van ultrasone beeldvorming en optimale injectievolumes afgestemd op embryonale stadia. 
Volgens dit protocol is het mogelijk om transductie van >95% van de zich ontwikkelende hersenen te bereiken met high-titer lentivirus en zo genetische manipulatie van de hele hersenen uit te voeren. Daarentegen is het mogelijk om mozaïektransductie te bereiken met behulp van lagere virale titers, waardoor genetische screening of afstammingstracering mogelijk is. Injectie bij E7.5 richt zich ook op ectoderm en neurale crest die bijdragen aan verschillende compartimenten van het oog, de tong en het perifere zenuwstelsel. Deze techniek biedt dus de mogelijkheid om genexpressie te manipuleren in neurale plaat- en ectoderm-afgeleide weefsels van muizen uit preneurulatiestadia, met het voordeel van het verminderen van het aantal muizen dat in experimenten wordt gebruikt.

Embryo's geïnjecteerd op E7.5 met hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 werden verzameld op E13.5 en onderzocht onder de fluorescerende dissectiemicroscoop (figuur 5A). Succesvolle transductie van de neurale plaat resulteert in embryo's met een sterke expressie van een fluorescerende reporter in de hersenen, voornamelijk en in andere van ectoderm afgeleide weefsels, bijvoorbeeld de huid (figuur 5A, B). Injectie van een te hoog volume (groter dan de hier aanbevolen volumes, bijvoorbeeld ≥500 nL) verhoogt de druk in de AC en kan resulteren in volledige resorptie (gegevens niet getoond) of neurale buisdefecten zoals exencefalie (figuur 5A). Succesvolle injecties bij E7.5 resulteren in uniforme transductie van de voorhersenen naar de achterhersenen (figuur 5C-J).
Lentivirale titers rond 2 × 1010 infectieuze eenheden (IFU) bereiken meer dan 95% targeting, terwijl titers van ~ 1 × 109 IFU 15% targeting efficiëntiebereiken 15. Daarnaast worden ook structuren geviseerd die voorheen moeilijk te richten waren met behulp van elektroporatie, zoals de plexus 17,18 van het vaat (figuur 5 E,F). De effectiviteit van transductie kan worden gewijzigd door de virale titer aan te passen die in de AC wordt afgeleverd. Injecties van lage titer resulteren in de transductie van eencellige klonen (figuur 5C, figuur 5E en figuur 5G, H), terwijl het gebruik van het high-titervirus bijna 100% van de hele hersenen transduceert (figuur 5D, figuur 5F, figuur 5H en figuur 5J ). Daarom kan NEPTUNE worden gebruikt voor klonale transductie, lineage tracing en genetische screeningsbenaderingen of het bestuderen van de wereldwijde effecten van genoverexpressie of downregulatie in de hele hersenen.
De oogontwikkeling van zoogdieren is het resultaat van goed georganiseerde communicatie tussen drie derivaten van het embryonale ectoderm: het neurale netvlies (NR) en retinaal pigmentepitheel (RPE) zijn afgeleid van het neuro-epitheel van de ventrale voorhersenen, terwijl het oppervlakte-ectoderm aanleiding geeft tot de toekomstige lens en het hoornvliesepitheel. Het centrale stroma en het achterste endotheel, de andere twee lagen van het hoornvlies, zijn echter afgeleid van neurale topcellen van het perioculaire mesenchym19,20. Coronale secties via E13.5 embryo's, geïnjecteerd op E7.5 met high-titer lentivirus toonden, vergelijkbaar met de hersenen, hoge en uniforme transductie van het neurale weefsel van het oog, evenals de lens, het hoornvlies en mesenchym (figuur 5K). Naarmate de neurulatie vordert, resulteren injecties bij E8.5 en E9.5 in de voortdurende targeting van de lens en het cornea-epitheel (figuur 5L en figuur 5N), terwijl transductie van de van neuro-ecctoderm afgeleide weefsels van het oog minder efficiënt is bij E8.5 (figuur 5L,M) of niet gericht op E9.5 (figuur 5N).
Terwijl de meeste virale deeltjes de blootgestelde weefsels infecteren bij injectie, transduceren sommige deeltjes niet-ectodermale weefsels die zich later ontwikkelen (figuur 6A). Speekselklieren en kanalen ontwikkelen zich rond E11.5 uit het orale epitheel21 en zijn gericht op NEPTUNUS (figuur 6B). Na injecties op E9.5 is het linguale epitheel van de tong goed getransduceerd; het onderliggende mesenchym is echter negatief (figuur 6C; haakjes geven getransduceerde cellen aan; asterisken duiden op autofluorescentiesignaal en niet op getransduceerde cellen). Bovendien zijn er positieve clusters in het linguale epitheel, gescheiden door negatieve secties (figuur 6C, witte pijlpunten), wat transductie van het papillaoppervlak suggereert. Neurale crestcellen zijn beschreven in het onderliggende tongmesenchym en in het linguale epitheel, waar ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van smaakpapillen en smaakpapillen22. Inderdaad, injecties op E7.5 resulteren in wijdverspreide transductie van het tong mesenchym bij E13.5 (Figuur 6D), wat suggereert dat vroege injecties zich richten op neurale crestcellen, wat bijdraagt aan mesenchym in de tong.
Bij gewervelde dieren zijn de dorsale wortelganglia (DRG's) een centraal onderdeel van het perifere zenuwstelsel (PNS), omdat alle somatosensorische input uit de periferie van het lichaam (temperatuur, pijn, druk) wordt overgedragen aan de hersenen via activering van de DRG-neuronen23. Zowel neuronen als gliacellen van de DRG zijn afgeleid van stamneuraalkamcellen24. Lentivirale injectie, waarbij de alomtegenwoordige hPGK-promotor de expressie van de fluorescerende reporter regelt, leidt tot wijdverspreide targeting van het centrale en perifere zenuwstelsel (figuur 7A), waarbij zowel neuronen als voorlopers in het ruggenmerg worden getransduceerd (figuur 7B), evenals de DRG (figuur 7C). Het gebruik van een MiniPromoter voor doublecortin25 maakt het mogelijk om GFP-expressie te beperken tot alleen neuronen (15 en Figuur 7D, E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figuur 5: Hoge efficiëntie of klonale transductie met NEPTUNUS. (A) E13.5 embryo's onder een dissectiemicroscoop verlicht met standaardverlichting (linkerpaneel) en dezelfde embryo's verlicht voor GFP (rechterpaneel). Ongeïnjecteerd embryo helemaal links, succesvol geïnjecteerd embryo uiterst rechts, wat een positief signaal in de hersenen oplevert (meest rechtse embryo). Exencefalisch embryo als gevolg van overtollig volume geïnjecteerd (middelste embryo). (B) Huid- en hersenfocus met E7.5-injectie. Schaalbalk = 50 μm. (C, D) E13.5 confocale beelden van voorhersenen met lage klonale transductie (C) of hoogrenderende transductie (D). (C, E, G, I) Klonale transductie van verschillende regio's in de hersenen. (D, F, H, J) Hoogrenderende transductie van verschillende regio's in de hersenen. Schaalstaven = 200 μm. Verschillende transductie-werkzaamheid is representatief voor andere gebieden van het CZS. (E, F) Choroid Plexus targeting, clonally (E) of met een hoge efficiëntie (F). Schaalstaven = 200 μm. (G, H) Klonale targeting (G) en hoogrenderende (H) targeting van achterhersenen, vergroot in (I, J). Schaalstaven = 200 μm. (K) GFP-reporterexpressie in het oog bij E13,5 na injectie in utero bij E7,5 (L, M) GFP-reporterexpressie in het oog op E15,5 na injectie in utero bij E8,5 (L), in dozen vergroot in (M) of bij E9,5 (N). Autofluorescente bloedvaten zijn gemarkeerd met witte sterren. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: NEPTUNE = neural plate targueeting with in utero nano-injection; C = Hoornvlies; LE = Lens Epitheel; LF = Lensvezels; M = Mesenchym; NR = Neuraal Netvlies; ON = Oogzenuw; RPE = Retinaal Pigment Epitheel; GFP = groen fluorescerend eiwit; CZS = centraal zenuwstelsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figuur 6: In utero transductie van niet-neurale weefsels. (A) Confocale afbeelding van E15.5 mondholte. Embryo werd geïnjecteerd met fluorescerend reporter lentivirus op E9,5. Schaalbalk = 200 μm. (B, C) (B) Vergroting van het inzetpaneel; speekselkanaalepitheel getransduceerd met virus. (C) Vergroting van het inzetpaneel; dorsaal linguaal epitheel getransduceerd met GFP reporter virus (witte beugel). Het onderliggende mesenchym afgeleid van neurale crest-cellen is negatief. Witte pijlpunten duiden op papillen met negatieve neurale topcellen omgeven door virus-getransduceerde epitheelcellen (autofluorescente bloedcellen / bloedvaten zijn gemarkeerd met witte sterren). Schaalstaven = 50 μm. (D) Schematisch en confocaal beeld van E13,5 tong mesenchym na injecties met fluorescerend reportervirus op E7,5. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: D = Dorsal; M = Mesenchym; N = Nasofarynx; SLD = Sublinguaal kanaal; SMD = Submandibulair kanaal; T = Tong; V = Ventraal; GFP = groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figuur 7: Transductie van neurale crest-afgeleide dorsale wortel ganglioncellen. (A) NEPTUNE targeting op E7.5 maakt targeting van zowel CZS als PNS mogelijk. (B) Confocale afbeelding van E13.5 ruggenmerg en DRG's geïnjecteerd met hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus op E7.5 toont transductie van zowel SOX2+ neurale voorlopers als NeuN+ neuronen. Schaalbalk = 100 μm. (C) Boxed gebied van B met de DRG met GFP-expressie in SOX2+ (witte pijlen) en NeuN+ (witte pijlpunten) celpopulaties. Schaalbalk = 20 μm. (D) Confocale afbeelding van E13,5 ruggenmerg en DRG geïnjecteerd met DCX-H2B-GFP lentivirus op E7,5, alleen gericht op DCX+ cellen. Schaalbalk = 100 μm. (E) Boxed gebied van D met DRG met GFP-expressie beperkt tot DCX+ neuronen (witte pijlpunten). DCX-cellen zijn negatief voor GFP (witte pijlen). Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: NEPTUNE = neural plate targueeting with in utero nano-injection; CZS = centraal zenuwstelsel; PNS = perifeer zenuwstelsel; DRG's = dorsale wortel ganglia; GFP = groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE maakt targeting en genetische manipulatie van het embryonale zenuwstelsel van de muis mogelijk vanaf embryonale dag 7.5 en maakt het genereren van knockdown- of lineage tracing-modellen in dagen mogelijk. Dit protocol is aanpasbaar, flexibel en snel. We kunnen shRNA- , cdRNA- of virale bibliotheken met streepjescodes leveren om verschillende vragen in dagen in plaats van maanden of jaren te beantwoorden.We verwachten dat NEPTUNE inzichten zal verschaffen in de neurowetenschappen, maar het kan ook worden aangepast aan andere orgaansystemen. Het identificeren van de vruchtwaterholte kan een behoorlijke uitdaging zijn, dus neem de tijd om naar het echografiebeeld te kijken en misschien een leerboek of andere anatomiebron bij de hand te hebben. Om te beginnen met het laden van de naald, schuift u de glazen naald op de metalen zuiger, waarbij u de collett vasthoudt maar enigszins losmaakt.Duw vervolgens de capillaire naald samen met de metalen zuiger door de voorste pakking totdat deze de afstandhouder bereikt. Druk op Leeg om de zuiger in de naald te duwen en de olie uit de naaldpunt te verwijderen. Druk vervolgens op Fill om een luchtbel te creëren, waarbij de olie en de oplossing worden verdeeld.Laat ten slotte de naald zakken, dompel de punt onder in de oplossing en druk nogmaals op Fill om de naald te laden. Na het fixeren van een verdoofde vrouwelijke muis met vruchtwaterholtes van ideale grootte op de verwarmingstafel, brengt u ooggel aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en injecteert u een pijnstiller subcutaan. Steriliseer vervolgens de onderbuik door af te vegen met een doek gedrenkt in 0,5 milligram per milliliter chloorhexidine-oplossing en droog de huid.Maak vervolgens met behulp van een chirurgische schaar een verticale middenlijn incisie van 1,5 tot 2 centimeter in de onderbuik. Til vervolgens de huid voorzichtig op en bevrijd deze van de onderliggende spierlaag ongeveer een centimeter rond het incisiepunt om het hechten na de operatie te vergemakkelijken. Maak vervolgens een verticale middellijnincisie van één centimeter in de spierlaag.Til met behulp van een tang een kant van de huid- en spierlaag op en zoek met een ander paar naar de baarmoederhoorns. Houd vervolgens met behulp van een tang het weefsel tussen de embryo's en trek voorzichtig beide baarmoederhoorns uit de buik. Tel en nummer de embryo's, hetzij van de eierstok tot de baarmoederhals of van de baarmoederhals tot de eierstok, aan beide zijden.Duw vervolgens met een vochtig wattenstaafje alle embryo's voorzichtig terug in de buikholte, behalve de eerste drie die moeten worden geïnjecteerd. Plaats vervolgens een druppel PBS op een elastisch membraan dat is gelijmd op de ronde centrale opening van een in de handel verkrijgbare gemodificeerde petrischaal en houd deze direct boven de embryo's. Breng een gesloten tang in de incisie van het elastiek in en laat vervolgens de tang los om de elastische incisie te openen en laat de vloeistof op de embryo's vallen.Trek met behulp van een tang het deel van de baarmoeder dat overeenkomt met de drie embryo's door het elastiek en plaats voorzichtig de petrischaal op de buik van de muis. Gebruik vier kleivoeten om de petrischaal boven de buik vast te maken en vast te maken om de druk op de muis te verminderen en ook de gevoeligheid van beeldvorming voor de ademhaling en hartslag van de muis te verminderen. Pas vervolgens met behulp van een tang en een vochtig wattenstaafje de baarmoeder en het elastiek aan om ervoor te zorgen dat het elastiek rond de huid van de muis wordt afgesloten, waardoor PBS-lekkage wordt voorkomen.Om vervolgens de baarmoeder te fixeren, drukt u de modelleerkleicilinder rechts van de embryo's of baarmoeder en voegt u PBS toe aan de petrischaal totdat de embryo's en baarmoeder volledig bedekt zijn met de PBS. Om de registratie van de injecties te vergemakkelijken, dompelt u de ultrasone sonde in de PBS en past u de muis of operatietafel aan zodat het eerste embryo is uitgelijnd met de ultrasone sonde. Scan alle drie de embryo's en inspecteer de vruchtwaterholtes.Meet vervolgens met behulp van het echoapparaat de diameter van de vruchtholte om het juiste injectievolume te bepalen. Stel met behulp van de injectieregelaar de vastgestelde injectievolumes en de injectiesnelheid in op langzaam, met een injectiesnelheid van 23 nanoliter per seconde. Nadat u de naald in de PBS hebt laten zakken, drukt u met behulp van de hoofdwielen op het railsysteem op Leeg op de nanoinjectorcontroller totdat de vloeistof de punt van de naald bereikt.Til vervolgens de naald uit de PBS en druk op Injecteren om te controleren of een druppel van ongeveer het gewenste volume wordt afgevoerd. Laat de naald opnieuw in de PBS zakken en beweeg de nanoinjector met het Y-plane wiel op de micromanipulator om de naald uit te lijnen met de ultrasone sonde en het embryo. Pas de naaldhoek aan met het injectiehoekwiel om een bijna loodrechte injectiehoek ten opzichte van de baarmoederwand te garanderen.Steek vervolgens met behulp van het injectiewiel op de micromanipulator de naald in één beweging in de vruchtwaterholte. Als de punt van de naald uit het echografiebeeld verdwijnt, beweegt u de sonde naar voren of naar achteren om de naald weer scherp te stellen. Injecteer vervolgens het gewenste volume door het juiste aantal keren op Injecteren te drukken.Nadat het vereiste volume is geïnjecteerd, wacht u 5 tot 10 seconden voordat u de naald in één zachte beweging intrekt. Verplaats het stadium naar het volgende embryo en herhaal de injectie voor de andere twee embryo's zoals aangetoond. Til vervolgens de ultrasone sonde en naald uit de PBS met behulp van de micromanipulator en draai de naald weg van de operator om schade en letsel te voorkomen.Plaats met behulp van een tang de eerste en tweede embryo's terug in de buik door ze voorzichtig door het elastiek te duwen. Pak vervolgens voorzichtig het weefsel naast het derde embryo vast en trek de baarmoeder naar het bovenste uiteinde van de elastische incisie. Trek voorzichtig het vierde tot het zesde embryo met een tang omhoog en laat het derde embryo weer in de buik komen.Nadat alle embryo's met optimale vruchtwaterholtes zijn geïnjecteerd, duwt u de embryo's en baarmoeder voorzichtig terug in de buik van de muis. Succesvolle transductie van de neurale plaat resulteert in embryo's met een sterke expressie van een fluorescerende reporter in de hersenen en andere van ectoderm afgeleide weefsels, zoals de huid. Het injecteren van te hoge volumes kan leiden tot neurale buisdefecten, zoals exencefalie.Succesvolle injecties op embryonale dag 7.5 resulteren in uniforme transductie van de voorhersenen naar de achterhersenen, inclusief de plexus choroid. Injecties van lage titer resulteren in de transductie van eencellige klonen, terwijl het hoge titervirus bijna 100% van de hele hersenen transduceert. Coronale secties tot embryonale dag 13,5 embryo's vertoonden een hoge en uniforme transductie van neuraal weefsel van het oog, de lens, het hoornvlies en mesenchym.Na injectie op embryonale dag 9.5 ontwikkelen speekselklieren en -kanalen zich rond embryonale dag 11,5 uit het orale epitheel. Het linguale epitheel van de tong is goed getransduceerd, terwijl het onderliggende mesenchym negatief is. Bovendien worden de positieve clusters in het linguale epitheel gescheiden door negatieve secties, wat transductie van het papillaire oppervlak suggereert.Injecties op embryonale dag 7,5 resulteren in wijdverspreide transductie van het tongmesenchym op embryonale dag 13.5, wat suggereert dat vroege injecties zich richten op neurale crestcellen, wat bijdraagt aan het mesenchym in de tong. Lentivirale injecties leiden ook tot wijdverspreide targeting van het centrale en perifere zenuwstelsel, waarbij zowel neuronen als voorlopers in het ruggenmerg worden getransduceerd, evenals de dorsale wortelganglia. Een goede voorbereiding is essentieel.Zorg ervoor dat er geen lekkage is en dat de embryo's goed gefixeerd zijn, zodat je je volledig kunt richten op de injecties in de rattenholte. Na NEPTUNE kan analyse worden uitgevoerd met verschillende methoden, zoals immunofluorescente analyse van de hersenen, eencellige RNA-sequencing of het laten geboren van de geïnjecteerde embryo's voor gedragsanalyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Nauwkeurige en Fenol Gratis DNA Sexing van Dag 30 embryo&#39;s van varkens door PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intraveneuze en Intra-vruchtwater In Utero transplantatie in het lymfkliertest Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...