Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Nous remercions Bettina Semsch et Jia Sun (Infinigene) pour les soins experts des souris; Florian Salomons et Göran Månsson de Biomedicum Imaging Core (BIC) pour l’aide à l’acquisition d’images et à la consultation. Financement : Nous remercions les bailleurs de fonds suivants pour leur soutien à ce projet : le Conseil suédois de la recherche, le Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID funding et SFO StratNeuro funding, le Center of Innovative Medicine), la Fondation Ollie and Elof Ericssons, la Fondation Tornspiran, la Fondation Jeansssons, le Prix Sven et Ebba-Christina Hagbergs et la bourse de recherche, Knut and Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik and Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation, and the Swedish Foundations Starting Grant to ERA. Les figures 4D,E ont été créées avec BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Il y a plusieurs étapes dans ce protocole qui influencent la survie embryonnaire, la qualité des injections et la lecture. L’âge gestationnel des embryons est défini comme E0,5 à midi le jour du bouchon vaginal après l’accouplement nocturne. L’exécution de l’échographie pour la grossesse à E6.5 en fin d’après-midi / soir garantit que les embryons sont suffisamment développés pour être identifiés par échographie. La vérification (1) permet de présélectionner le nombre de souris plug-positives qui sont réellement gestantes, (2) garantit qu’aucun virus n’est décongelé inutilement et gaspillé dans le cas où les souris plug-positives ne sont pas gestantes, et (3) réduit les interventions inutiles sur les souris (évite la chirurgie sur les femelles non gravides).
À E7.5, les embryons sont sensibles aux forces externes et doivent être manipulés avec précaution. Par exemple, tirer sur les cornes utérines ou presser les déciduas peut entraîner une résorption embryonnaire. Le tissu utérin doit toujours être maintenu humide à l’extérieur de l’abdomen féminin pour empêcher le tissu de sécher. La majorité des déciduas doivent rester à l’intérieur de l’abdomen féminin, avec seulement 3-4 exposés pour les injections. La netteté de l’aiguille est un autre déterminant crucial pour le succès des injections. Les pointes d’aiguille émoussées ou cassées entraînent des piqûres répétées de déciduas ou une compression contre la pâte à modeler avant d’entrer dans le climatiseur, ce qui peut augmenter le taux de résorption. Par conséquent, les aiguilles bien moulues et pointues doivent toujours être stockées en toute sécurité et remplacées après un maximum de 2 femelles.
Ce protocole décrit comment cibler la plaque neurale avec une seule injection de lentivirus. En outre, il montre comment l’efficacité de la transduction peut être adaptée à partir de clones unicellulaires à l’ensemble du cerveau. Cependant, d’autres tissus non neuraux, y compris la peau et l’épithélium buccal, sont également ciblés. De plus, tous les types de cellules (progéniteurs et cellules différenciées) sont transduits, ce qui rend cette approche efficace mais non spécifique. L’utilisation de MiniPromoters dans la construction virale conduit à l’expression spécifique du transgène dans les neurones ou les astrocytes15. Cela a l’avantage d’éviter l’utilisation d’animaux Cre transgéniques dédiés et donc de réduire la quantité de travail (maintenance des souches et génotypage) et les coûts.
Les limites de NEPTUNE comprennent sa difficulté technique, les défis à obtenir des femelles enceintes à un rythme prévisible et constant, et les coûts d’acquisition d’instruments spécialisés. De plus, le ciblage non sélectif des cellules par lentivirus peut être considéré à la fois comme un avantage et une limitation de la technique. L’injection de plus grands volumes dans le courant alternatif entraîne une exencéphalie13, bien que les malformations cérébrales et l’exencéphalie soient évitées avec les volumes décrits ici15. Un impact négatif sur le développement cérébral est donc un risque avec les nano-injections in utero qui doivent être soigneusement évitées en injectant des volumes corrects adaptés au stade embryonnaire et à la taille du CA.
Les adaptations futures de la technique pourraient se concentrer sur le tropisme viral. Les virus adéno-associés (AAV) ont différents sérotypes, dont il a été démontré qu’ils ciblent de manière robuste différents types de cellules dans le SNC17,26. Cependant, les AAV ne s’intègrent pas dans le génome de la cellule hôte et peuvent donc être perdus dans les cellules à taux de division élevé. Bien qu’il existe plusieurs façons d’accroître la spécificité de NEPTUNE, les animaux transgéniques restent l’étalon-or en matière de manipulation génétique in vivo. Des souris Cas9 et un lentivirus codant pour l’ARNg ont été utilisés pour le dépistage génétique dans l’épiderme embryonnaire27 et peuvent également être adaptés au SNC en développement.
Les injections dans le courant alternatif à E7.5 ciblent efficacement les cellules du neuroectoderme avant le début de la neurulation et ciblent le cerveau en développement plus efficacement que l’électroporation in utero . Cela permet d’étudier les indices génétiques importants pour le développement du cerveau à partir d’un point temporel antérieur. Contrairement aux modèles génétiques classiques de souris, NEPTUNE offre une approche flexible pour effectuer une analyse génétique fonctionnelle. Les phénotypes après surexpression ou suppression de gènes peuvent être étudiés en quelques jours à quelques semaines par rapport à des mois ou des années. Les injections de constructions virales multiples permettent la manipulation de plusieurs gènes au sein d’un embryon et évitent la génération d’animaux knock-out doubles ou triples. Par conséquent, NEPTUNE permet non seulement de gagner du temps, mais aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche.

Le cerveau et la moelle épinière sont parmi les premiers organes à initier la formation au cours de l’embryogenèse 1,2. Bien que les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux soient en cours d’identification, l’interrogation fonctionnelle des variantes génétiques a pris du retard par rapport à 3,4. Comme la génération de souris knockout conditionnelles peut prendre des mois ou des années, une technique alternative pour étudier rapidement la fonction des gènes dans le cerveau en développement est intéressante. Chez les embryons de souris, la neurulation - le processus morphogénétique par lequel la plaque neurale se transforme en tube neural pour donner naissance au système nerveux central (SNC) - se produit entre les jours 8 et 10 après la conception5. Avant le début de la neurulation, la plaque neurale, en tant que partie de l’ectoderme, est constituée d’une seule couche de cellules cylindriques qui vont proliférer et se différencier en nombreux types de cellules neuronales et gliales dans le SNC 6,7. Par conséquent, pour induire expérimentalement des altérations durables de l’expression génique dans le SNC, cibler la plaque neurale offre des avantages évidents, y compris l’accessibilité de toutes les cellules progénitrices.
En neurosciences, l’électroporation in ovo 8,9 et la transduction virale d’embryons de souris ont été utilisées pour manipuler l’expression génique embryonnaire du SNC. L’embryon de poussin en développement a été un modèle de choix pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement de la moelle épinière en raison de l’accessibilité de l’embryon de poussin dans l’œuf et de la facilité de manipulation de l’expression génique qui en résulte. En particulier, l’électroporation plasmidique in ovo génère des conditions expérimentales et de contrôle dans la moelle épinière de chaque poussin. L’électroporation provoque la perméabilisation de la membrane cellulaire et dirige l’ADN chargé négativement loin de la cathode (négative) vers l’anode (positive) en appliquant une impulsion électrique via deux électrodes à l’embryon. Chez la souris, l’électroporation in utero a généralement été limitée aux stades embryonnaires auxquels la neurulation est terminée, et le cerveau ou la moelle épinière est déjà constitué de plusieurs couches cellulaires, ce qui entraîne une faible efficacité d’électroporation10. L’électroporation plasmidique entraîne une expression transitoire des gènes et cible généralement quelques cellules.
La microinjection in utero guidée par ultrasons a été utilisée pour manipuler différentes structures embryonnaires telles que la peau et le cerveau11,12,13,14. Cependant, les injections ciblant le SNC murin en développement se sont révélées peu efficaces ou ont eu un impact négatif sur la survie embryonnaire12,13,14. Par conséquent, un protocole amélioré a été développé pour l’administration de lentivirus à titre élevé dans la cavité amniotique (AC) à E7.5, qui a été surnommé NEPTUNE pour neural plate targeting with in uteronano-injection15. Les injections ont entraîné une efficacité de ciblage durable de >95% de l’ensemble du cerveau à E13.5. De plus, une étape de stadification a été introduite lors de la vérification échographique de la grossesse pour trier les femelles et les grossesses par stade de développement afin de minimiser les procédures inutiles sur les animaux de recherche et de maximiser le succès de l’injection. L’efficacité et la survie de l’injection sont étroitement liées à l’augmentation de la taille du climatiseur. Par conséquent, cet article décrit comment mesurer la taille du courant alternatif avant l’injection pour délivrer un volume approprié au courant alternatif qui ne provoquera pas de résorption de l’embryon. NEPTUNE est une alternative robuste aux approches in utero actuelles et peut être adapté à plusieurs utilisations, y compris, mais sans s’y limiter, les études de gain et de perte de fonction, le traçage de la lignée ou le dépistage15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

La manipulation de l’expression génique dans le cerveau de souris en développement in utero présente un grand potentiel pour les études de génétique fonctionnelle. Cependant, il était auparavant largement limité à la manipulation des stades embryonnaires post-neurulation. Un protocole a été développé pour injecter la cavité amniotique au jour embryonnaire (E)7,5 et délivrer le lentivirus, codant pour l’ADNc ou shRNA, ciblant >95% de la plaque neurale et des cellules de la crête neurale, contribuant au futur cerveau, à la moelle épinière et au système nerveux périphérique. Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour réussir la transduction, y compris le broyage des aiguilles capillaires en verre, la vérification de la grossesse, la stadification du développement à l’aide de l’imagerie échographique et les volumes d’injection optimaux adaptés aux stades embryonnaires. 
En suivant ce protocole, il est possible d’obtenir la transduction de >95% du cerveau en développement avec un lentivirus à titre élevé et d’effectuer ainsi une manipulation génétique du cerveau entier. En revanche, il est possible d’obtenir une transduction en mosaïque en utilisant des titres viraux inférieurs, ce qui permet un dépistage génétique ou un traçage de la lignée. L’injection à E7.5 cible également l’ectoderme et la crête neurale contribuant à des compartiments distincts de l’œil, de la langue et du système nerveux périphérique. Cette technique offre ainsi la possibilité de manipuler l’expression génique dans les tissus dérivés de la plaque neurale et de l’ectoderme de souris à partir des stades de preneurulation, avec l’avantage de réduire le nombre de souris utilisées dans les expériences.

Des embryons injectés à E7.5 avec le lentivirus hPGK-H2B-GFP11,12 ont été prélevés à E13.5 et examinés au microscope à dissection fluorescente (figure 5A). Une transduction réussie de la plaque neurale donne des embryons avec une forte expression d’un rapporteur fluorescent dans le cerveau principalement et dans d’autres tissus dérivés de l’ectoderme, par exemple la peau (Figure 5A, B). L’injection d’un volume excessivement élevé (supérieur aux volumes recommandés ici, par exemple ≥500 nL) augmente la pression dans le courant alternatif et peut entraîner une résorption complète (données non présentées) ou des anomalies du tube neural telles que l’exencéphalie (Figure 5A). Des injections réussies à E7.5 entraînent une transduction uniforme du cerveau antérieur au cerveau postérieur (Figure 5C-J).
Les titres lentiviraux autour de 2 × 1010 unités infectieuses (IFU) atteignent un ciblage de plus de 95%, tandis que les titres de ~1 × 109 IFU atteignent une efficacité de ciblage de 15%15. De plus, des structures auparavant difficiles à cibler par électroporation, comme le plexus choroïde17,18, sont également ciblées (Figure 5 E,F). L’efficacité de la transduction peut être modifiée en ajustant le titre viral délivré dans le CA. Les injections de faible titre entraînent la transduction de clones unicellulaires (Figure 5C, Figure 5E et Figure 5G,H) tandis que l’utilisation de virus à titre élevé transduit près de 100% de l’ensemble du cerveau (Figure 5D, Figure 5F, Figure 5H et Figure 5J ). Par conséquent, NEPTUNE peut être utilisé pour la transduction clonale, le traçage de la lignée et les approches de dépistage génétique ou pour étudier les effets globaux de la surexpression ou de la régulation négative des gènes dans l’ensemble du cerveau.
Le développement de l’œil des mammifères est le résultat d’une communication bien organisée entre trois dérivés de l’ectoderme embryonnaire : la rétine neurale (NR) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) sont dérivés du neuroépithélium du cerveau antérieur ventral, tandis que l’ectoderme de surface donne naissance au futur cristallin et à l’épithélium cornéen. Cependant, le stroma central et l’endothélium postérieur, les deux autres couches de la cornée, sont dérivés des cellules de la crête neurale du mésenchyme périoculaire19,20. Les coupes coronales à travers des embryons E13.5, injectées à E7.5 avec un lentivirus à titre élevé, ont montré, comme dans le cerveau, une transduction élevée et uniforme du tissu neural de l’œil, ainsi que du cristallin, de la cornée et du mésenchyme (Figure 5K). Au fur et à mesure que la neurulation progresse, les injections à E8.5 et E9.5 entraînent le ciblage continu du cristallin et de l’épithélium cornéen (Figure 5L et Figure 5N), tandis que la transduction des tissus oculaires dérivés du neuroectoderme est moins efficace à E8.5 (Figure 5L,M) ou non ciblée à E9.5 (Figure 5N).
Alors que la plupart des particules virales infectent les tissus exposés lors de l’injection, certaines particules transduisent des tissus non ectodermiques dérivés qui se développent plus tard (Figure 6A). Les glandes et les canaux salivaires se développent autour de E11,5 à partir de l’épithéliumoral 21 et sont ciblés par NEPTUNE (Figure 6B). Après les injections à E9.5, l’épithélium lingual de la langue est bien transduit ; cependant, le mésenchyme sous-jacent est négatif (Figure 6C; les parenthèses indiquent les cellules transdudues; les astérisques indiquent le signal d’autofluorescence et non les cellules transdudues). De plus, il existe des grappes positives dans l’épithélium lingual, séparées par des sections négatives (Figure 6C, pointes de flèches blanches), suggérant une transduction de la surface de la papille. Les cellules de la crête neurale ont été décrites dans le mésenchyme langagier sous-jacent et dans l’épithélium lingual, où elles sont impliquées dans le développement des papilles gustatives et des papilles gustatives22. En effet, les injections à E7.5 entraînent une transduction généralisée du mésenchyme de la langue à E13.5 (Figure 6D), suggérant que les injections précoces ciblent les cellules de la crête neurale, contribuant au mésenchyme dans la langue.
Chez les vertébrés, les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont une composante centrale du système nerveux périphérique (SNP), car toutes les entrées somatosensorielles de la périphérie du corps (température, douleur, pression) sont transmises au cerveau via l’activation des neurones DRG23. Les neurones et les cellules gliales du DRG sont dérivés des cellules de la crête neurale du tronc24. L’injection lentivirale, dans laquelle le promoteur hPGK omniprésent contrôle l’expression du rapporteur fluorescent, conduit à un ciblage généralisé du système nerveux central et périphérique (Figure 7A), transduisant à la fois les neurones et les progéniteurs de la moelle épinière (Figure 7B), ainsi que le DRG (Figure 7C). L’utilisation d’un MiniPromoter pour la doublecortine25 permet de limiter l’expression de la GFP aux seuls neurones (15 et Figure 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figure 5 : Haute efficacité ou transduction clonale avec NEPTUNE. (A) Embryons E13.5 sous un microscope à dissection éclairé avec un éclairage standard (panneau de gauche) et mêmes embryons éclairés pour la GFP (panneau de droite). Embryon non injecté à l’extrême gauche, embryon injecté avec succès à l’extrême droite, produisant un signal positif dans le cerveau (embryon le plus à droite). Embryon exencéphalique dû à un excès de volume injecté (embryon intermédiaire). (B) Ciblage cutané et cérébral avec injection d’E7.5. Barre d’échelle = 50 μm. (C, D) E13.5 images confocales du cerveau antérieur avec une faible transduction clonale (C) ou une transduction à haute efficacité (D). (C, E, G, I) Transduction clonale de différentes régions du cerveau. (D, F, H, J) Transduction à haute efficacité de différentes régions du cerveau. Barres d’échelle = 200 μm. Différentes efficacités de transduction sont représentatives d’autres zones du SNC. (E, F) Ciblage du plexus choroïde, clonalement (E) ou avec une efficacité élevée (F). Barres d’échelle = 200 μm. (G, H) Ciblage clonal (G) et ciblage à haute efficacité (H) du cerveau postérieur, amplifié en (I, J). Barres d’échelle = 200 μm. (K) Expression du rapporteur de la GFP dans l’œil à E13,5 après injection in utero à E7,5 (L, M) Expression du rapporteur de la GFP dans l’œil à E15,5 après injection in utero à E8,5 (L), région en boîte amplifiée dans (M) ou à E9,5 (N). Les vaisseaux sanguins autofluorescents sont marqués d’étoiles blanches. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = cornée; LE = épithélium du cristallin; LF = Fibres de lentille; M = Mésenchyme; NR = Rétine neurale; ON = nerf optique; EPR = épithélium pigmentaire rétinien; GFP = protéine fluorescente verte; SNC = système nerveux central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figure 6 : Transduction in utero de tissus non neuraux. (A) Image confocale de la cavité buccale E15.5. L’embryon a été injecté avec un lentivirus rapporteur fluorescent à E9.5. Barre d’échelle = 200 μm. (B, C) (B) Grossissement du panneau encastré; épithélium des canaux salivaires transduits avec le virus. C) Grossissement du panneau encastré; épithélium lingual dorsal transduit avec le virus rapporteur GFP (crochet blanc). Le mésenchyme sous-jacent dérivé des cellules de la crête neurale est négatif. Les pointes de flèches blanches indiquent des papilles avec des cellules de crête neurale négatives entourées de cellules épithéliales transduites par virus (les cellules / vaisseaux sanguins autofluorescents sont marqués d’étoiles blanches). Barres d’échelle = 50 μm. (D) Image schématique et confocale du mésenchyme de la langue E13.5 après injections avec le virus rapporteur fluorescent à E7.5. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : D = Dorsale; M = Mésenchyme; N = Nasopharynx; SLD = canal sublingual; DMS = canal sous-maxillaire; T = Langue; V = Ventral; GFP = protéine fluorescente verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figure 7 : Transduction des cellules ganglionnaires de la racine dorsale dérivées de la crête neurale. (A) Le ciblage NEPTUNE à E7.5 permet de cibler à la fois le SNC et le SNP. (B) L’image confocale de la moelle épinière E13.5 et des DRG injectés avec le lentivirus rapporteur hPGK-H2B-GFP à E7.5 montre la transduction des progéniteurs neuronaux SOX2+ et des neurones NeuN+. Barre d’échelle = 100 μm. (C) Région encadrée de B montrant le DRG avec expression de GFP dans les populations cellulaires SOX2+ (flèches blanches) et NeuN+ (pointes de flèches blanches). Barre d’échelle = 20 μm. (D) Image confocale de la moelle épinière E13.5 et DRG injectés avec le lentivirus DCX-H2B-GFP à E7.5, ciblant uniquement les cellules DCX+. Barre d’échelle = 100 μm. (E) Région encadrée de D montrant DRG avec expression GFP limitée aux neurones DCX+ (pointes de flèches blanches). Les cellules DCX- sont négatives pour la GFP (flèches blanches). Barre d’échelle = 20 μm. Abréviations: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; SNC = système nerveux central; SNP = système nerveux périphérique; DRG = ganglions de la racine dorsale; GFP = protéine fluorescente verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Dans ce protocole, nous décrivons comment injecter le lentivirus à la cavité amniotique de la souris à E7.5, conduisant à une transduction uniforme de toute la plaque neurale, avec des effets néfastes minimes sur la survie ou le développement embryonnaire.

Ciblage de la plaque neurale murine par nano-injection in utero (NEPTUNE) au jour embryonnaire 7,5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE permet le ciblage et la manipulation génétique du système nerveux embryonnaire de la souris à partir du jour embryonnaire 7.5 et permet la génération de modèles knockdown ou traçage de lignée en quelques jours. Ce protocole est adaptable, flexible et rapide. Nous pouvons fournir des shRNA, de l’ARNc ou des bibliothèques virales à code-barres pour répondre à différentes questions en quelques jours plutôt qu’en mois ou en années.Nous nous attendons à ce que NEPTUNE fournisse des informations en neurosciences, mais il peut également être adapté à d’autres systèmes d’organes. L’identification de la cavité amniotique peut être assez difficile, alors prenez votre temps pour regarder l’image échographique et peut-être avoir un manuel ou une autre ressource anatomique à portée de main. Pour commencer à charger l’aiguille, faites glisser l’aiguille en verre sur le piston en métal, en maintenant le collett attaché mais légèrement desserré.Ensuite, poussez l’aiguille capillaire avec le piston métallique à travers le joint avant jusqu’à ce qu’il atteigne l’entretoise. Appuyez sur Vide pour enfoncer le piston dans l’aiguille et expulser l’huile de l’extrémité de l’aiguille. Appuyez ensuite sur Remplir pour créer une bulle d’air, en divisant l’huile et la solution.Enfin, abaissez l’aiguille, immergez la pointe dans la solution et appuyez à nouveau sur Remplir pour charger l’aiguille. Après avoir fixé une souris femelle anesthésiée avec des cavités amniotiques de taille idéale sur la table chauffante, appliquez du gel pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne et injectez un analgésique par voie sous-cutanée. Ensuite, stérilisez le bas-ventre en essuyant avec un chiffon imbibé de 0,5 milligramme par millilitre de solution de chlorhexidine et séchez la peau.Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision cutanée verticale médiane de 1,5 à 2 centimètres dans le bas-ventre. Ensuite, soulevez doucement la peau et libérez-la de la couche musculaire sous-jacente d’environ un centimètre autour du point d’incision pour faciliter la suture après la chirurgie. Ensuite, faites une incision verticale médiane d’un centimètre dans la couche musculaire.À l’aide d’une paire de forceps, soulevez un côté de la peau et de la couche musculaire, et avec une autre paire, recherchez les cornes utérines. Ensuite, à l’aide d’une pince, tenez le tissu entre les embryons et retirez soigneusement les deux cornes utérines de l’abdomen. Comptez et numérotez les embryons, soit de l’ovaire au col de l’utérus, soit du col de l’utérus à l’ovaire, des deux côtés.Ensuite, avec un coton-tige humide, repoussez doucement tous les embryons dans la cavité abdominale, sauf les trois premiers à injecter. Ensuite, placez une goutte de PBS sur une membrane élastique collée à l’ouverture centrale ronde d’une boîte de Petri modifiée disponible dans le commerce et maintenez-la immédiatement au-dessus des embryons. Insérez une pince fermée dans l’incision de l’élastique, puis relâchez la pince pour ouvrir l’incision élastique, laissant tomber le liquide sur les embryons.À l’aide d’une pince, tirez la section de l’utérus correspondant aux trois embryons à travers l’élastique et perchez doucement la boîte de Petri sur l’abdomen de la souris. À l’aide de quatre pieds d’argile, fixez et fixez la boîte de Petri au-dessus de l’abdomen pour réduire la pression sur la souris et réduire la sensibilité de l’imagerie à la respiration et au rythme cardiaque de la souris. Ensuite, à l’aide d’une pince et d’un coton-tige humide, ajustez l’utérus et l’élastique pour vous assurer que l’élastique est scellé autour de la peau de la souris, empêchant ainsi les fuites de PBS.Ensuite, pour fixer l’utérus, appuyez sur le cylindre de pâte à modeler à droite des embryons ou de l’utérus et ajoutez du PBS à la boîte de Petri jusqu’à ce que les embryons et l’utérus soient entièrement recouverts du PBS. Pour faciliter l’enregistrement des injections, plongez la sonde à ultrasons dans le PBS et ajustez la souris ou la table chirurgicale de sorte que le premier embryon soit aligné avec la sonde à ultrasons. Scannez les trois embryons et inspectez les cavités amniotiques.Ensuite, à l’aide de l’appareil à ultrasons, mesurez le diamètre de la cavité amniotique pour déterminer le volume d’injection approprié. À l’aide du contrôleur d’injection, réglez les volumes d’injection déterminés et la vitesse d’injection sur ralentir, avec un débit d’injection de 23 nanolitres par seconde. Après avoir abaissé l’aiguille dans le PBS, à l’aide des roues principales du système de rails, appuyez sur Vide sur le contrôleur du nanoinjecteur jusqu’à ce que le liquide atteigne l’extrémité de l’aiguille.Ensuite, soulevez l’aiguille du PBS et appuyez sur Injecter pour vérifier qu’une goutte du volume approximatif souhaité est déchargée. Abaissez à nouveau l’aiguille dans le PBS et déplacez le nanoinjecteur avec la roue du plan Y sur le micromanipulateur pour aligner l’aiguille avec la sonde à ultrasons et l’embryon. Ajustez l’angle de l’aiguille avec la molette d’injection pour assurer un angle d’injection presque perpendiculaire par rapport à la paroi utérine.Ensuite, à l’aide de la roue d’injection du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans la cavité amniotique en un seul mouvement. Si la pointe de l’aiguille disparaît de l’image échographique, déplacez la sonde vers l’avant ou vers l’arrière pour ramener l’aiguille au point. Ensuite, injectez le volume souhaité en appuyant sur Injecter pendant le nombre approprié de fois.Une fois le volume requis injecté, attendez 5 à 10 secondes avant de rétracter l’aiguille en un seul mouvement. Déplacez l’étape vers l’embryon suivant et répétez l’injection pour les deux autres embryons comme démontré. Ensuite, soulevez la sonde à ultrasons et l’aiguille hors du PBS à l’aide du micromanipulateur, en détournant l’aiguille de l’opérateur pour éviter les dommages et les blessures.À l’aide d’une pince, replacez les premier et deuxième embryons dans l’abdomen en les poussant doucement à travers l’élastique. Ensuite, saisissez doucement le tissu adjacent au troisième embryon et tirez l’utérus vers l’extrémité supérieure de l’incision élastique. Tirez doucement vers le haut du quatrième au sixième embryon avec une pince et laissez le troisième embryon rentrer à nouveau dans l’abdomen.Une fois que tous les embryons avec des cavités amniotiques optimales ont été injectés, repoussez doucement les embryons et l’utérus dans l’abdomen de la souris. Une transduction réussie de la plaque neurale donne des embryons avec une forte expression d’un rapporteur fluorescent dans le cerveau et d’autres tissus dérivés de l’ectoderme, comme la peau. L’injection de volumes excessivement élevés peut entraîner des anomalies du tube neural, telles que l’exencéphalie.Des injections réussies au jour embryonnaire 7,5 entraînent une transduction uniforme du cerveau antérieur au cerveau postérieur, y compris le plexus choroïde. Les injections à faible titre entraînent la transduction de clones unicellulaires, tandis que le virus à titre élevé transduit près de 100% du cerveau entier. Les coupes coronales jusqu’au jour embryonnaire 13,5 embryonnaires ont montré une transduction élevée et uniforme du tissu neural de l’œil, du cristallin, de la cornée et du mésenchyme.Après l’injection au jour embryonnaire 9,5, les glandes salivaires et les canaux se développent vers le jour embryonnaire 11,5 à partir de l’épithélium buccal. L’épithélium lingual de la langue est bien transduit, alors que le mésenchyme sous-jacent est négatif. De plus, les amas positifs dans l’épithélium lingual sont séparés par des sections négatives, suggérant une transduction de la surface papillaire.Les injections au jour embryonnaire 7,5 entraînent une transduction généralisée du mésenchyme de la langue au jour embryonnaire 13,5, ce qui suggère que les injections précoces ciblent les cellules de la crête neurale, contribuant au mésenchyme dans la langue. Les injections de lentiviraux conduisent également à un ciblage généralisé du système nerveux central et périphérique, transduisant à la fois les neurones et les progéniteurs de la moelle épinière, ainsi que les ganglions de la racine dorsale. Une bonne préparation est essentielle.Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite et que les embryons sont bien fixés, afin que vous puissiez vous concentrer entièrement sur les injections dans la cavité du rat. Après NEPTUNE, l’analyse peut être effectuée par diverses méthodes, telles que l’analyse immunofluorescente du cerveau, le séquençage de l’ARN unicellulaire ou la naissance des embryons injectés pour une analyse comportementale.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Recherche

Biologie du développement

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intraveineuse amniotique et In Utero une Transplantation chez le modèle murin

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

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In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

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