Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

マウスの専門家によるケアをしてくれたベッティーナ・セムシュとジア・サン(インフィニジーン)に感謝します。Biomedicum Imaging Core(BIC)のFlorian Salomons氏とGöran Månsson氏が画像取得と相談を支援。資金:このプロジェクトを支援してくれた次の資金提供者に感謝します:スウェーデン研究評議会、カロリンスカ研究所(KI財団、キャリア開発助成金、博士課程の学生KID資金、SFOストラトニューロ資金、革新的医学センター)、オリーとエロフエリクソン財団、トルンスピラン財団、ジャンソン財団、スヴェンとエバクリスティーナハグバーグ賞と研究助成金、 Knut and Alice Wallenberg Project Grant、Fredrik and Ingrid Thurings Foundation、Lars Hiertas Minne、The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden)、The Åhlen Foundation、Åke Wibergs Foundation、Torre Nilssons Foundation、Swedish Foundations Starting Grant to ERA。図4D,Eは BioRender.com で作成した。

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

このプロトコルには、胚の生存、注射の質、および読み出しに影響を与えるいくつかのステップがあります。胚の妊娠期間は、一晩交配した後の膣栓の日の正午にE0.5と定義される。午後遅く/夕方にE6.5で妊娠の超音波検査を行うことで、胚が超音波で識別されるのに十分なほど発達していることが保証されます。このチェックにより、(1)プラグ陽性マウスが実際に妊娠している数の事前スクリーニングが可能になり、(2)プラグ陽性マウスが妊娠していない場合にウイルスが不必要に解凍されて無駄にならないようにし、(3)マウスへの不必要な介入を減らします(妊娠していない女性への手術を回避します)。
E7.5では、胚は外力に敏感であり、注意して取り扱う必要があります。例えば、子宮角を引っ張ったり、脱落膜を絞ったりすると、胚の吸収につながる可能性があります。子宮組織は、組織が乾燥するのを防ぐために、女性の腹部の外側にあるときは常に湿った状態に保つ必要があります。落膜の大部分は女性の腹部の内側に留まり、注射のために露出するのは3〜4個だけです。針の鋭さは、注射を成功させるためのもう一つの重要な決定要因です。針先が鈍くなったり折れたりすると、ACに入る前に脱落膜が繰り返し突かれたり、モデリング粘土に圧縮されたりして、吸収率を高めることができます。したがって、よく挽いた鋭利な針は常に安全に保管し、最大2匹の女性の後に交換する必要があります。
このプロトコルは、レンチウイルスの1回の単回注射で神経板を標的にする方法を説明しています。さらに、形質導入の有効性を単一細胞クローンから脳全体にどのように適応させることができるかを示しています。ただし、皮膚や口腔上皮を含む他の非神経組織も標的としています。さらに、すべての細胞型(前駆細胞および分化細胞)が形質導入されるため、このアプローチは効率的ですが非特異的です。ウイルス構築物におけるMiniPropatorsの使用は、ニューロンまたは星状細胞における導入遺伝子の特異的発現をもたらす15。これは、専用のトランスジェニックCre動物の使用を回避し、したがって労力(株の維持およびジェノタイピング)およびコストを削減するという利点を有する。
NEPTUNEの限界には、その技術的な難しさ、予測可能で一貫した速度で妊娠中の女性を取得することの課題、および特殊な機器を取得するためのコストが含まれます。さらに、レンチウイルスによる細胞の非選択的標的化は、この技術の利点と制限の両方と見なすことができます。ACにより大きなボリュームを注入すると、脳奇形と外脳症はここで説明するボリュームで回避されますが、13はexencephalyをもたらします15。したがって、脳の発達への悪影響は、胚期とACサイズに適合した正しい量を注入することによって慎重に回避しなければならない 子宮内 ナノ注射のリスクです。
この技術の将来の適応は、ウイルスの向性に焦点を当てる可能性があります。アデノ随伴ウイルス(AAV)は異なる血清型を有し、CNSの異なる細胞型を頑健に標的とすることが示されている17,26。ただし、AAVは宿主細胞ゲノムに組み込まれないため、分裂率の高い細胞では失われる可能性があります。ネプチューンの特異性を高める方法はいくつかありますが、生体内での遺伝子操作に関しては、トランスジェニック動物が依然としてゴールドスタンダードです。Cas9マウスおよびsgRNAコードレンチウイルスは、胚性表皮27における遺伝子スクリーニングに使用されており、また、発生中のCNSに適合し得る。
E7.5のACへの注射は、神経形成の開始前に神経外胚葉の細胞を効率的に標的とし、 子宮 内エレクトロポレーションよりも効率的に発達中の脳を標的とする。これにより、脳の発達に重要な遺伝的手がかりを早い時点から研究することができます。古典的な遺伝子マウスモデルとは対照的に、NEPTUNEは機能的遺伝子解析を実行するための柔軟なアプローチを提供します。過剰発現または遺伝子欠失後の表現型は、数ヶ月または数年と比較して数日から数週間以内に研究することができる。複数のウイルス構築物の注射は、1つの胚内のいくつかの遺伝子の操作を可能にし、二重または三重ノックアウト動物の生成を回避する。したがって、NEPTUNEは時間を節約するだけでなく、研究に使用される動物の数を減らすこともできます。

脳と脊髄は、胚形成中に形成を開始する最初の器官の1つです1,2。神経発達障害に関連する遺伝子は同定されていますが、遺伝的変異の機能的調査は遅れています3,4。条件付きノックアウトマウスの作製には数か月から数年かかることがあるため、発達中の脳の遺伝子機能を迅速に調べるための代替技術が注目されています。マウス胚では、神経形成(神経板が神経管に変化して中枢神経系(CNS)を生じさせる形態形成プロセス)は、受胎後8日目から10日目の間に発生します5。神経形成の開始前に、神経板は、外胚葉の一部として、CNS 6,7内の多数のニューロンおよびグリア細胞型に増殖および分化する柱状細胞の単層からなる。したがって、CNSにおける遺伝子発現の長期的な変化を実験的に誘導するために、神経板を標的とすることは、すべての前駆細胞のアクセス可能性を含む明らかな利点を提供する。
神経科学では、ovoエレクトロポレーション8,9およびマウス胚のウイルス形質導入において、胚性CNS遺伝子発現を操作するために使用されてきた。発生中のニワトリ胚は、卵子内のニワトリ胚へのアクセス可能性とその結果としての遺伝子発現の操作の容易さのために、脊髄発生中の遺伝子機能を研究するための選択モデルであった。特に、ovoプラスミドエレクトロポレーションでは、各ひよこ脊髄における実験条件および対照条件を生成する。エレクトロポレーションは細胞膜透過処理を引き起こし、2つの電極を介して胚に電気パルスを印加することにより、負に帯電したDNAを(負の)陰極から(正の)陽極に向けます。マウスでは、子宮内でのエレクトロポレーションは一般に神経形成が完了した胚期に限定されており、脳または脊髄はすでにいくつかの細胞層で構成されているため、エレクトロポレーション効率は低くなります10。プラスミドエレクトロポレーションは一過性の遺伝子発現をもたらし、一般に少数の細胞を標的とします。
子宮内マイクロインジェクションにおける超音波ガイド下は、皮膚および脳などの異なる胚構造を操作するために使用されてきた11、12、13、14。しかし、発生中のマウスCNSを標的とする注射は、有効性が低いか、胚の生存に悪影響を及ぼしています12、13、14。そのため、E7.5の羊膜腔(AC)に高力価のレンチウイルスを送達するための改良されたプロトコルが開発され、これは子宮内で発生するネプチューンと呼ばれました15。注射は、E13.5で脳全体の>95%の長期的な標的効果をもたらしました。さらに、妊娠の超音波検証中に病期分類ステップを導入し、研究動物の不要な手順を最小限に抑え、注射の成功を最大化するために、発達段階ごとに女性と妊娠を分類しました。注入効率と生存率は、ACサイズの増加と密接に関連しています。したがって、この論文では、注入前にACサイズを測定して、胚の再吸収を引き起こさない適切な体積をACに送達する方法について説明します。海王星は、現在の子宮内アプローチの堅牢な代替手段であり、機能研究の獲得と喪失、系統追跡、またはスクリーニングを含むがこれらに限定されないいくつかの用途に適応することができます15,16。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

胎内発達中のマウス脳における遺伝子発現の操作は、機能遺伝学研究の大きな可能性を秘めています。しかし、以前は主に神経形成後の胚期の操作に限定されていました。胚の日(E)7.5に羊膜腔を注入し、cDNAまたはshRNAをコードするレンチウイルスを神経板と神経堤細胞の>95%を標的とし、将来の脳、脊髄、末梢神経系に寄与するプロトコルが開発されました。このプロトコルでは、ガラス毛細血管針の研削、妊娠確認、超音波イメージングを使用した発生病期分類、胚期に合わせた最適な注入量など、形質導入を成功させるために必要な手順について説明します。
このプロトコルに従って、発達中の脳の>95%を高力価レンチウイルスで形質導入し、全脳遺伝子操作を実行することが可能です。対照的に、より低いウイルス力価を用いてモザイク形質導入を達成することが可能であり、遺伝子スクリーニングまたは系統追跡を可能にする。E7.5での注射は、眼、舌、および末梢神経系の明確なコンパートメントに寄与する外胚葉および神経堤も標的とする。したがって、この技術は、マウスの神経板および外胚葉由来の組織における遺伝子発現を前神経形成段階から操作する可能性を提供し、実験に使用するマウスの数を減らすという利点をもたらします。

hPGK-H2B-GFPレンチウイルス11,12をE7.5で注射した胚をE13.5で採取し、蛍光解剖顕微鏡で調べた(図5A)。神経板の形質導入が成功すると、主に脳および他の外胚葉由来組織、例えば皮膚において蛍光レポーターが強く発現する胚が生じる(図5A、B)。過度に高い容量(ここで推奨される容量よりも大きい、たとえば≥500 nL)を注入すると、AC内の圧力が上昇し、完全な吸収(データは示されていません)または脳症などの神経管欠損を引き起こす可能性があります(図5A)。E7.5での注射が成功すると、前脳から後脳への均一な形質導入が得られます(図5C-J)。
レンチウイルス力価は約2 × 1010感染単位(IFU)で95%以上のターゲティングを達成し、1~1 ×10 9 IFUの力価は15%のターゲティング効率を達成します15。さらに、脈絡叢17,18など、これまでエレクトロポレーションを使用して標的とすることが困難であった構造も標的としています(図5 E、F)。形質導入の有効性は、ACに送達されるウイルス力価を調整することによって変更することができる。 低力価の注射は単一細胞クローンの形質導入をもたらし(図5C、図5E、および図5G、H)、高力価ウイルスの使用は脳全体のほぼ100%の形質導入をもたらします(図5D、図5F、図5H、および図5J).したがって、NEPTUNEは、クローン形質導入、系統追跡、および遺伝子スクリーニングアプローチのいずれか、または脳全体における遺伝子過剰発現またはダウンレギュレーションの全体的な影響の研究に使用できます。
哺乳類の眼の発達は、胚性外胚葉の3つの派生物間のよく組織化されたコミュニケーションの結果です:神経網膜(NR)と網膜色素上皮(RPE)は腹側前脳の神経上皮に由来し、表面外胚葉は将来の水晶体と角膜上皮を生じさせます。しかしながら、中枢間質および後内皮、角膜の他の2つの層は、眼周囲間葉の神経堤細胞に由来する19、20。E13.5胚を通した冠状切片に高力価レンチウイルスをE7.5で注射したところ、脳と同様に、眼の神経組織、ならびに水晶体、角膜、間葉樹の高度で均一な形質導入が示されました(図5K)。神経形成が進行するにつれて、E8.5およびE9.5での注射は、水晶体および角膜上皮の継続的な標的化をもたらし(図5Lおよび図5N)、眼の神経外胚葉由来組織の形質導入は、E8.5(図5L、M)またはE9.5を標的としない(図5N)で効率が低下する。
ほとんどのウイルス粒子は注射時に露出した組織に感染しますが、一部の粒子は後に発生する非外胚葉由来の組織を形質導入します(図6A)。唾液腺と唾液管は、口腔上皮21からE11.5 の周りに発生し、ネプチューンを標的としています(図6B)。E9.5での注射後、舌の舌上皮はよく形質導入されます。しかしながら、根底にある間葉は陰性である(図6C;括弧は形質導入された細胞を示し、アスタリスクは形質導入されていない細胞を示す。さらに、舌上皮内には陰性のセクションで区切られた陽性のクラスターがあり(図6C、白い矢印)、乳頭表面の形質導入を示唆しています。神経堤細胞は、下にある舌間葉および舌上皮内で説明されており、そこでは味乳頭および味蕾の発生に関与している22。実際、E7.5での注射は、E13.5での舌間葉の広範な形質導入をもたらし(図6D)、早期注射が神経堤細胞を標的とし、舌の間葉に寄与することを示唆しています。
脊椎動物では、後根神経節(DRG)は末梢神経系(PNS)の中心的な構成要素であり、体の末梢からのすべての体性感覚入力(温度、痛み、圧力)はDRGニューロン23の活性化を介して脳に伝達されます。DRGのニューロンおよびグリア細胞の両方が、体幹神経堤細胞24に由来する。ユビキタスhPGKプロモーターが蛍光レポーターの発現を制御するレンチウイルス注射は、中枢神経系および末梢神経系(図7A)の広範な標的化をもたらし、脊髄のニューロンと前駆細胞の両方(図7B)、およびDRG(図7C)を形質導入します。ダブルコルチン25にミニプロモーターを使用すると、GFP発現をニューロンのみに制限することができます(図15および図7D、E)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> 図5:ネプチューンによる高効率またはクローン形質導入。 (A)標準照明で照らされた解剖顕微鏡下のE13.5胚(左パネル)とGFPで照らされた同じ胚(右パネル)。左端に未注入胚、右端に胚の注入に成功し、脳内で陽性のシグナルを生じる(右端の胚)。過剰量の注入による外脳胚(中胚)。(B)E7.5注射による皮膚と脳の標的化。スケールバー= 50 μm。 (C、D)低クローン形質導入(C)または高効率形質導入(D)の前脳のE13.5共焦点画像。(C, E, G, I)脳内の異なる領域のクローン形質導入。(D, F, H, J)脳内の異なる領域の高効率トランスダクション。スケールバー= 200μm。異なる形質導入有効性は、CNSの他の領域を代表するものである。(E, F)脈絡叢を標的とする、クローン的(E)または高効率(F)。スケールバー = 200 μm。 (G, H) 後脳のクローンターゲティング(G)および高効率(H)ターゲティング、(I、J)で拡大。スケールバー = 200 μm。 (K)E7.5での子宮内注射後のE13.5での眼におけるGFPレポーター発現(L、M)E8.5(L)での子宮内注射後のE15.5での眼におけるGFPレポーター発現(M)、またはE9.5(N)で拡大されたボックス化された領域。自己蛍光血管は白い星でマークされています。スケールバー= 100μm。略語:海王星=子宮内では、子宮内では遅くなります。 C =角膜;LE =水晶体上皮;LF =レンズファイバー;M =間葉;NR =神経網膜;ON =視神経;RPE =網膜色素上皮;GFP = 緑色蛍光タンパク質;中枢神経系=中枢神経系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> 図6:非神経組織の子宮内導入。 (A)E15.5口腔の共焦点画像。胚に蛍光レポーターレンチウイルスをE9.5で注射した。スケールバー = 200 μm。 (B, C) (B) はめ込みパネルの倍率;ウイルスで形質導入された唾液管上皮。(C)はめ込みパネルの倍率。GFPレポーターウイルスで形質導入された背側舌上皮(白括弧)。神経堤細胞に由来する根底にある間葉系は陰性です。白い矢印は、ウイルス形質導入上皮細胞に囲まれた陰性の神経堤細胞を持つ乳頭を示しています(自己蛍光性血液細胞/血管は白い星でマークされています)。スケールバー = 50 μm。 (D)E7.5に蛍光レポーターウイルスを注射した後のE13.5舌間葉の概略図および共焦点画像。スケールバー= 50μm。 略語:D =背側;M =間葉;N =鼻咽頭;SLD =舌下管;SMD =顎下管;T =舌;V =腹側;GFP = 緑色蛍光タンパク質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> 図7:神経堤由来後根神経節細胞の形質導入。 (A)E7.5でのネプチューンターゲティングは、CNSとPNSの両方のターゲティングを可能にします。(B)E13.5脊髄とE7.5でhPGK-H2B-GFPレポーターレンチウイルスを注射したDRGの共焦点画像は、SOX2+神経前駆細胞とNeuN+ニューロンの両方の形質導入を示しています。スケールバー = 100 μm。 (C)SOX2+(白矢印)およびNeuN+(白矢印)細胞集団におけるGFP発現を有するDRGを示すBの四角形領域。スケールバー= 20μm。 (D)E13.5脊髄と、DCX+細胞のみを標的としたE7.5でDCX-H2B-GFPレンチウイルスを注射したDRGの共焦点画像。スケールバー= 100μm。 (E)DCX+ニューロンに限定されたGFP発現を有するDRGを示すDのボックス領域(白い矢印)。DCX−細胞はGFPに対して陰性である(白い矢印)。スケールバー= 20μm。略語:海王星=子宮内では、子宮内では遅くなります。 CNS =中枢神経系;PNS =末梢神経系;DRG =後根神経節;GFP = 緑色蛍光タンパク質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

このプロトコルでは、E7.5のマウス羊膜腔にレンチウイルスを注入し、生存や胚発生への有害な影響を最小限に抑えながら、神経板全体の均一な形質導入をもたらす方法について説明します。

胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNEは、胚発生7.5日目からマウス胚神経系のターゲティングと遺伝子操作を可能にし、数日でノックダウンまたは系統追跡モデルの生成を可能にします。このプロトコルは、適応性があり、柔軟性があり、高速です。shRNA、cdRNA、またはバーコード化されたウイルスライブラリを提供して、数か月または数年ではなく数日でさまざまな質問に対処できます。私たちは、海王星が神経科学の洞察を提供することを期待していますが、他の臓器系にも適応することができます。羊膜腔を特定することは非常に難しい場合があるため、時間をかけて超音波画像を見て、教科書やその他の解剖学リソースを手元に用意してください。針の装填を開始するには、ガラス針を金属製のプランジャーにスライドさせ、コレットを取り付けたまま少し緩めます。次に、キャピラリーニードルを金属プランジャーと一緒にフロントガスケットに通して、スペーサーに到達するまで押します。空を押してプランジャーを針に押し込み、針先からオイルを排出します。次に、塗りつぶしを押して気泡を作成し、オイルと溶液を分割します。最後に、針を下げ、先端を溶液に浸し、もう一度[塗りつぶし]を押して針をロードします。麻酔をかけた羊膜が理想の大きさの雌マウスを加熱台に固定した後、角膜の乾燥を防ぐためにアイジェルを両目に塗布し、鎮痛剤を皮下注射します。次に、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのクロルヘキシジン溶液を浸した布で拭いて下腹部を滅菌し、皮膚を乾燥させます。次に、外科用ハサミを使用して、下腹部の1.5〜2センチメートルの垂直正中線皮膚切開を行います。次に、皮膚をやさしく持ち上げ、切開点の周りの約1センチの下にある筋肉層から解放して、手術後の縫合を容易にします。次に、筋肉層に1センチの垂直正中線切開を行います。1対の鉗子を使用して、皮膚と筋肉層の片側を持ち上げ、別の対で子宮角を探します。次に、鉗子を使用して、胚の間に組織を保持し、腹部から両方の子宮角を慎重に引き出します。両側の卵巣から子宮頸部まで、または子宮頸部から卵巣まで、胚を数えて番号を付けます。次に、湿った綿棒で、注射する最初の3つを除くすべての胚を腹腔内にそっと押し戻します。次に、市販の改良ペトリ皿の丸い中央開口部に接着された弾性膜にPBSを一滴置き、胚のすぐ上に保持します。閉じた鉗子を弾性の切開部に挿入し、次に鉗子を放して弾性切開部を開き、液体を胚に落とします。鉗子を使用して、3つの胚に対応する子宮の部分を弾性を通して引っ張り、マウスの腹部にペトリ皿を静かにとめます。4本の粘土の足を使用して、ペトリ皿を腹部の上に固定して固定し、マウスへの圧力を軽減し、マウスの呼吸と心拍に対するイメージングの感度を低下させます。次に、鉗子と湿った綿棒を使用して、子宮と弾性体を調整して、弾性体がマウスの皮膚の周りに密閉されるようにし、PBSの漏れを防ぎます。次に、子宮を固定するために、モデリング粘土シリンダーを胚または子宮の右側に押し下げ、胚と子宮が完全にPBSで覆われるまでPBSをペトリ皿に追加します。注射の記録を容易にするために、超音波プローブをPBSに浸し、最初の胚が超音波プローブと整列するようにマウスまたは手術台を調整します。3つの胚すべてをスキャンし、羊膜腔を検査します。次に、超音波装置を使用して、羊膜腔の直径を測定し、適切な注入量を決定します。注入コントローラーを使用して、決定された注入量と射出速度を、毎秒23ナノリットルの射出速度で遅く設定します。レールシステムの主輪を使用して針をPBSに下げた後、液体が針の先端に到達するまでナノインジェクターコントローラーのEmptyを押します。次に、針をPBSから持ち上げてInjectを押して、おおよその目的の量の滴が排出されることを確認します。針を再びPBSに下げ、マイクロマニピュレーターのYプレーンホイールでナノインジェクターを動かして、針を超音波プローブと胚に合わせます。注入角度ホイールで針の角度を調整して、子宮壁に対してほぼ垂直な注入角度を確保します。次に、マイクロマニピュレーターの注入ホイールを使用して、針を羊膜腔に1回の動きで挿入します。針先が超音波画像から消えた場合は、プローブを前後に動かして針の焦点を元に戻します。次に、Injectを適切な回数押して、目的のボリュームを注入します。必要な量を注入した後、5〜10秒待ってから、針を1回の穏やかな動きで引っ込めます。ステージを次の胚に移動し、示されているように他の2つの胚に対して注射を繰り返します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して超音波プローブと針をPBSから持ち上げ、損傷や怪我を避けるために針をオペレーターから遠ざけます。鉗子を使用して、1番目と2番目の胚をゴムを通して静かに押して腹部に戻します。次に、3番目の胚に隣接する組織をそっとつかみ、子宮を弾性切開の上端に向かって引っ張ります。4番目から6番目の胚を鉗子でそっと引き上げ、3番目の胚が腹部に再び入るようにします。最適な羊膜腔を持つすべての胚を注入した後、胚と子宮をマウスの腹部にそっと押し戻します。神経板の形質導入が成功すると、脳や皮膚などの他の外胚葉由来組織に蛍光レポーターが強く発現する胚が得られます。過度に大量の注射をすると、脳症などの神経管欠損が生じる可能性があります。胚7.5日目に注射が成功すると、脈絡叢を含む前脳から後脳への均一な形質導入がもたらされます。低力価の注射は単一細胞クローンの形質導入をもたらし、高力価ウイルスは脳全体のほぼ100%を形質導入します。胚13.5日目までの冠状切片は、眼、水晶体、角膜、間葉の神経組織の高度で均一な形質導入を示しました。胚9.5日目に注射した後、唾液腺と管は口腔上皮から胚11.5日目頃に発生します。舌の舌上皮はよく形質導入されていますが、下にある間葉系は陰性です。さらに、舌上皮内の陽性クラスターは陰性部分によって分離されており、乳頭表面の形質導入を示唆している。胚7.5日目の注射は、胚13.5日目に舌間葉の広範な形質導入をもたらし、早期注射が神経堤細胞を標的とし、舌の間葉に寄与することを示唆している。レンチウイルス注射はまた、中枢神経系および末梢神経系の広範な標的化をもたらし、脊髄ならびに後根神経節のニューロンおよび前駆細胞の両方を形質導入する。十分な準備が不可欠です。漏れがなく、胚がしっかりと固定されていることを確認して、ラット腔への注射に完全に集中できるようにします。海王星の後、脳の免疫蛍光分析、単一細胞RNAシーケンシング、または行動分析のために注入された胚を産むことを可能にするなど、さまざまな方法で分析を行うことができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

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マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内子宮内移植

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

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Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

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ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

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近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...