Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Vi takker Bettina Semsch og Jia Sun (Infinigene) for ekspertpleie av mus; Florian Salomons og Göran Månsson fra Biomedicum Imaging Core (BIC) for hjelp med bildeinnhenting og konsultasjon. Finansiering: Vi takker følgende finansiører for deres støtte til dette prosjektet: Det svenske Vetenskapsrådet, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID finansiering, og SFO StratNeuro finansiering, Center of Innovative Medicine), The Ollie og Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven og Ebba-Christina Hagbergs Prize og forskningsstipend, Knut og Alice Wallenberg Prosjektstipend, Fredrik og Ingrid Thürings Stiftelse, Lars Hiertas Minne, Barncancerfonden, Åhlenstiftelsen, Åke Wibergs Stiftelse, Tore Nilssons Stiftelsesfond, og Stiftelsen Stiftelsesstipend til ERA. Figur 4D,E ble opprettet med BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Det er flere trinn i denne protokollen som påvirker embryonal overlevelse, kvaliteten på injeksjonene og avlesningen. Embryoenes svangerskapsalder er definert som E0.5 ved middagstid dagen for vaginalpluggen etter parring over natten. Ultralydkontroll ved E6.5 sent på ettermiddagen/kvelden sikrer at embryoene utvikles nok til å kunne identifiseres med ultralyd. Kontrollen (1) tillater prescreening av hvor mange plug-positive mus som faktisk er gravide, (2) sikrer at ingen virus tines unødvendig og bortkastes i tilfelle plug-positive mus ikke er gravide, og (3) reduserer unødvendige inngrep på mus (unngår kirurgi på ikke-gravide kvinner).
Ved E7.5 er embryoer følsomme for ytre krefter og bør håndteres med forsiktighet. For eksempel kan det å trekke på livmorhornene eller klemme deciduaene føre til embryoresorpsjon. Livmorvevet skal alltid holdes fuktig når det er utenfor den kvinnelige magen for å forhindre at vevet tørker. Flertallet av deciduaene skal forbli inne i den kvinnelige magen, med bare 3-4 utsatt for injeksjoner. Nåleskarphet er en annen avgjørende faktor for vellykkede injeksjoner. Stumpe eller ødelagte nålespisser resulterer i gjentatt poking av deciduas eller kompresjon mot modelleringsleiren før de kommer inn i AC, noe som kan øke resorpsjonshastigheten. Derfor bør velmalte og skarpe nåler alltid lagres trygt og erstattes etter maksimalt 2 kvinner.
Denne protokollen beskriver hvordan du målretter nevralplaten med en enkelt injeksjon av lentivirus. Videre viser den hvordan transduksjonseffekten kan tilpasses fra encellede kloner til hele hjernen. Imidlertid er andre ikke-nevrale vev, inkludert hud og oralt epitel, også målrettet. I tillegg transduseres alle celletyper (forfedre og differensierte celler), noe som gjør denne tilnærmingen effektiv, men ikke-spesifikk. Bruken av MiniPromoters i viruskonstruksjonen fører til det spesifikke uttrykket av transgenet i nevroner eller astrocytter15. Dette har fordelen av å unngå bruk av dedikerte transgene Cre-dyr og reduserer derfor mengden arbeidskraft (belastningsvedlikehold og genotyping) og kostnader.
Begrensningene til NEPTUNE inkluderer tekniske vanskeligheter, utfordringer med å skaffe gravide kvinner til en forutsigbar og konsistent hastighet, og kostnadene ved å anskaffe spesialisert instrumentering. Videre kan ikke-selektiv målretting av celler av lentivirus ses som både en fordel og en begrensning av teknikken. Injeksjon av større volumer i AC resulterer i exencephaly13, selv om hjernemisdannelser og exencephaly unngås med volumene beskrevet her15. En negativ innvirkning på hjernens utvikling er dermed en risiko med in utero nano-injeksjoner som må unngås nøye ved å injisere riktige volumer tilpasset embryonale stadium og AC-størrelse.
Fremtidige tilpasninger av teknikken kan fokusere på viral tropisme. Adeno-assosierte virus (AAV) har forskjellige serotyper, som har vist seg å robust målrette mot forskjellige celletyper i CNS17,26. AAV-er integreres imidlertid ikke i vertscellegenomet og kan derfor gå tapt i celler med høy delingshastighet. Selv om det er flere måter å øke spesifisiteten til NEPTUN, er transgene dyr fortsatt gullstandarden når det gjelder genmanipulering in vivo. Cas9-mus og sgRNA-kodende lentivirus har blitt brukt til genetisk screening i embryonalepidermis 27 og kan også tilpasses utviklingen av CNS.
Injeksjoner i AC ved E7.5 retter seg effektivt mot celler i nevroektodermen før initiering av neurulasjon og retter seg mot den utviklende hjernen mer effektivt enn i utero elektroporering. Dette gjør det mulig å studere genetiske signaler som er viktige for hjernens utvikling fra et tidligere tidspunkt. I motsetning til klassiske genetiske musemodeller tilbyr NEPTUNE en fleksibel tilnærming til å utføre funksjonell genanalyse. Fenotyper etter overekspresjon eller gensletting kan studeres i løpet av dager til uker sammenlignet med måneder eller år. Injiseringer av flere virale konstruksjoner tillater manipulering av flere gener i ett embryo og unngår generering av doble eller trippel knockout dyr. Derfor sparer NEPTUNE ikke bare tid, men kan også redusere antall dyr som brukes i forskning.

Hjernen og ryggmargen er blant de første organene som initierer dannelse under embryogenese 1,2. Selv om genene assosiert med nevroutviklingsforstyrrelser blir identifisert, har den funksjonelle forhøret av genetiske varianter ligget bak 3,4. Siden genereringen av betingede knockoutmus kan ta måneder eller år, er en alternativ teknikk for raskt å undersøke genfunksjonen i den utviklende hjernen av interesse. I museembryoer oppstår neurulasjon - den morfogenetiske prosessen der nevralplaten forvandles til nevrale røret for å gi opphav til sentralnervesystemet (CNS) - mellom dag 8 og 10 etter unnfangelse5. Før begynnelsen av neurulasjonen består nevralplaten, som en del av ektodermen, av et enkelt lag av søyleceller som vil proliferere og differensiere til de mange nevron- og glialcelletypene i CNS 6,7. Derfor, for å eksperimentelt indusere langvarige endringer i genuttrykk i CNS, gir målretting av nevrale platen åpenbare fordeler, inkludert tilgjengeligheten til alle stamceller.
I nevrovitenskap, i ovo elektroporering 8,9 og viral transduksjon av museembryoer har blitt brukt til å manipulere embryonale CNS-genuttrykk. Det utviklende kyllingembryoet har vært en valgfri modell for å studere genfunksjon under ryggmargsutvikling på grunn av tilgjengeligheten til kyllingembryoet i egget og den resulterende enkle manipuleringen av genuttrykk. Spesielt i ovo plasmid genererer elektroporering eksperimentelle og kontrollforhold i hver kylling ryggmargen. Elektroporering forårsaker cellemembranpermeabilisering og leder negativt ladet DNA bort fra den (negative) katoden mot den (positive) anoden ved å påføre en elektrisk puls via to elektroder til embryoet. Hos mus har elektroporering in utero generelt vært begrenset til embryonale stadier der neurulasjonen er fullført, og hjernen eller ryggmargen består allerede av flere cellelag, noe som resulterer i lav elektroporeringseffektivitet10. Plasmidelektroporering resulterer i forbigående genuttrykk og retter seg generelt mot få celler.
Ultralydveiledet in utero mikroinjeksjon har blitt brukt til å manipulere forskjellige embryonale strukturer som hud og hjerne11,12,13,14. Injeksjoner rettet mot det utviklende murine CNS har imidlertid vist lav effekt eller har negativt påvirket embryonal overlevelse12,13,14. Derfor ble det utviklet en forbedret protokoll for levering av høytiter lentivirus i fosterhulen (AC) ved E7.5, som ble kalt NEPTUNE for neural plate targeting with in uteronano-injection15. Injeksjoner resulterte i en langvarig målrettingseffekt på >95 % av hele hjernen ved E13.5. Videre ble det innført et iscenesettelsestrinn under ultralydverifisering av graviditet for å sortere kvinner og graviditeter etter utviklingsstadium for å minimere unødvendige prosedyrer på forsøksdyr og maksimere injeksjonssuksessen. Injeksjonseffektivitet og overlevelse er tett knyttet til økningen i AC-størrelse. Derfor beskriver denne artikkelen hvordan man måler vekselstrømsstørrelse før injeksjon for å levere et passende volum til vekselstrømmen som ikke vil forårsake resorpsjon av embryoet. NEPTUNE er et robust alternativ til nåværende in utero-tilnærminger og kan tilpasses for flere bruksområder, inkludert, men ikke begrenset til, gevinst og tap av funksjonsstudier, avstamningssporing eller screening15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

Manipulering av genuttrykk i den utviklende musehjernen i utero har stort potensial for funksjonelle genetikkstudier. Imidlertid har det tidligere i stor grad vært begrenset til manipulering av embryonale stadier etter neurulasjon. En protokoll ble utviklet for å injisere fosterhulen på embryonal dag (E) 7.5 og levere lentivirus, som koder for cDNA eller shRNA, rettet mot >95% av nevrale plate og nevrale kamceller, noe som bidrar til fremtidens hjerne, ryggmarg og perifert nervesystem. Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for å oppnå vellykket transduksjon, inkludert sliping av glasskapillærnålene, graviditetsverifisering, utviklingsmessig iscenesettelse ved hjelp av ultralydavbildning og optimale injeksjonsvolumer tilpasset embryonale stadier. 
Etter denne protokollen er det mulig å oppnå transduksjon av >95% av den utviklende hjernen med høytiter lentivirus og dermed utføre helhjernegenetisk manipulasjon. I motsetning til dette er det mulig å oppnå mosaikktransduksjon ved bruk av lavere virale titere, noe som muliggjør genetisk screening eller avstamningssporing. Injeksjon ved E7.5 retter seg også mot ektoderm og nevrale kam som bidrar til forskjellige rom i øyet, tungen og det perifere nervesystemet. Denne teknikken gir dermed muligheten til å manipulere genuttrykk i mus nevral-plate- og ektoderm-avledet vev fra preneurulasjonsstadier, med fordelen av å redusere antall mus som brukes i eksperimenter.

Embryoer injisert ved E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 ble samlet inn ved E13.5 og undersøkt under fluorescerende disseksjonsmikroskop (figur 5A). Vellykket transduksjon av nevralplaten resulterer i embryoer med sterkt uttrykk for en fluorescerende reporter i hjernen hovedsakelig og i andre ektodermavledede vev, for eksempel huden (figur 5A, B). Injeksjon av et for høyt volum (større enn volumene som er anbefalt her, f.eks. ≥500 nL) øker trykket i vekselstrømmen og kan resultere i enten fullstendig resorpsjon (data ikke vist) eller nevralrørsdefekter som eksencefali (figur 5A). Vellykkede injeksjoner ved E7.5 gir jevn transduksjon fra forhjernen til bakhjernen (figur 5C-J).
Lentivirale titere rundt 2 × 10 10 infeksjonsenheter (IFU) oppnår over 95 % målretting, mens titere på ~1 ×10 9 IFU oppnår 15 % måleffektivitet15. I tillegg er strukturer som tidligere har vært vanskelig å målrette mot ved hjelp av elektroporering, for eksempel choroid plexus17,18, også målrettet (figur 5 E, F). Transduksjonseffekten kan modifiseres ved å justere viral titer levert inn i AC. Injeksjoner med lav titer resulterer i transduksjon av encellede kloner (figur 5C, figur 5E og figur 5G, H), mens bruk av høytitervirus transduserer nesten 100% av hele hjernen (figur 5D, figur 5F, figur 5H og figur 5J ). Derfor kan NEPTUNE brukes til enten klonal transduksjon, avstamningssporing og genetiske screeningsmetoder eller studere de globale effektene av genoveruttrykk eller nedregulering i hele hjernen.
Pattedyrs øyeutvikling er resultatet av velorganisert kommunikasjon mellom tre derivater av den embryonale ektodermen: nevrale retina (NR) og retinalpigmentepitel (RPE) er avledet fra nevroepitelet i den ventrale forhjernen, mens overflateektodermen gir opphav til det fremtidige linse- og hornhinneepitelet. Imidlertid er det sentrale stroma og det bakre endotelet, de to andre lagene i hornhinnen, avledet fra nevrale kamceller i periokulær mesenkym19,20. Koronale seksjoner gjennom E13.5-embryoer, injisert ved E7.5 med høytiter lentivirus, viste, lik hjernen, høy og jevn transduksjon av øyets nevrale vev, samt linsen, hornhinnen og mesenkymet (figur 5K). Etter hvert som neurulasjonen utvikler seg, resulterer injeksjoner ved E8.5 og E9.5 i fortsatt målretting av linsen og hornhinneepitelet (figur 5L og figur 5N), mens transduksjon av øyets nevroektodermavledede vev er mindre effektiv ved E8.5 (figur 5L, M) eller ikke rettet mot E9.5 (figur 5N).
Mens de fleste viruspartikler infiserer det eksponerte vevet ved injeksjon, transduserer noen partikler ikke-ektodermal avledet vev som utvikler seg senere (figur 6A). Spyttkjertler og -kanaler utvikler seg rundt E11.5 fra det orale epitelet21 og er målrettet mot NEPTUN (figur 6B). Etter injeksjoner på E9.5 er det språklige epitelet i tungen godt gjennomført; Imidlertid er det underliggende mesenkymet negativt (figur 6C; parenteser betegner transduserte celler; stjerner betegner autofluorescenssignal ikke transduserte celler). I tillegg er det positive klynger i det språklige epitelet, adskilt av negative seksjoner (figur 6C, hvite pilspisser), noe som tyder på transduksjon av papillaoverflaten. Nevrale kamceller er beskrevet i det underliggende tungemesenkymet og i det språklige epitelet, hvor de er involvert i utviklingen av smakspapiller og smaksløker22. Faktisk resulterer injeksjoner ved E7.5 i utbredt transduksjon av tungemesenkymet ved E13.5 (figur 6D), noe som tyder på at tidlige injeksjoner retter seg mot nevrale kamceller, noe som bidrar til mesenkym i tungen.
Hos virveldyr er dorsale rotganglier (DRG) en sentral komponent i det perifere nervesystemet (PNS), da all somatosensorisk inngang fra kroppens periferi (temperatur, smerte, trykk) overføres til hjernen via aktivering av DRG-nevronene23. Både nevroner og gliaceller i DRG er avledet fra trunk nevrale kamceller24. Lentiviral injeksjon, der den allestedsnærværende hPGK-promotoren styrer uttrykket til den fluorescerende reporteren, fører til utbredt målretting av det sentrale og perifere nervesystemet (figur 7A), og transduserer både nevroner og forfedre i ryggmargen (figur 7B), samt DRG (figur 7C). Bruk av MiniPromoter for dobbeltkortin25 gjør det mulig å begrense GFP-uttrykket til kun nevroner (15 og figur 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figur 5: Høyeffektiv eller klonal transduksjon med NEPTUN. (A) E13.5 embryoer under et disseksjonsmikroskop opplyst med standard belysning (venstre panel) og samme embryoer opplyst for GFP (høyre panel). Uinjisert embryo helt til venstre, vellykket injisert embryo helt til høyre, noe som gir positivt signal i hjernen (embryo lengst til høyre). Eksencefalisk embryo på grunn av overskytende volum injisert (midtre embryo). (B) Hud- og hjernemålretting med E7.5 injeksjon. Skalalinje = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokale bilder av forhjernen med lav klonal transduksjon (C) eller høyeffektiv transduksjon (D). (C, E, G, I) Klonal transduksjon av forskjellige regioner i hjernen. (D, F, H, J) Høyeffektiv transduksjon av forskjellige regioner i hjernen. Skala barer = 200 μm. Ulike transduksjonseffekter er representative for andre områder av CNS. (E, F) Choroid Plexus målretting, klonalt (E) eller med høy effektivitet (F). Skalastenger = 200 μm. (G, H) Klonal målretting (G) og høyeffektiv (H) målretting av bakhjerne, forstørret i (I, J). Skalastenger = 200 μm. (K) GFP reporteruttrykk i øyet ved E13.5 etter in utero injeksjon ved E7.5 (L, M) GFP reporteruttrykk i øyet ved E15.5 etter in utero injeksjon ved E8.5 (L), bokset region forstørret i (M), eller ved E9.5 (N). Autofluorescerende blodkar er merket med hvite stjerner. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = hornhinnen; LE = linseepitel; LF = Linsefibre; M = Mesenkym; NR = nevrale netthinnen; ON = optisk nerve; RPE = retinal pigmentepitel; GFP = grønt fluorescerende protein; CNS = sentralnervesystemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figur 6: In utero transduksjon av ikke-nevrale vev. (A) Konfokalt bilde av E15.5 munnhule. Embryo ble injisert med fluorescerende reporter lentivirus på E9.5. Skala bar = 200 μm. (B, C) (B) Forstørrelse av innfelt panel; spyttkanalepitel transducert med virus. (C) Forstørrelse av innfelt panel; dorsalt lingual epitel transduced med GFP reporter virus (hvit brakett). Det underliggende mesenkymet avledet fra nevrale kamceller er negativt. Hvite pilspisser indikerer papiller med negative nevrale kamceller omgitt av virustransduserte epitelceller (autofluorescerende blodceller/kar er merket med hvite stjerner). Skalastenger = 50 μm. (D) Skjematisk og konfokalt bilde av E13.5 tungemesenkym etter injeksjoner med fluorescerende reportervirus ved E7.5. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: D = Dorsal; M = Mesenkym; N = Nasopharynx; SLD = Sublingual kanal; SMD = submandibulær kanal; T = Tunge; V = Ventral; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figur 7: Transduksjon av nevrale kamavledede dorsale rotganglionceller. (A) NEPTUN-målretting ved E7.5 tillater målretting av både CNS og PNS. (B) Konfokalt bilde av E13.5 ryggmarg og DRG-er injisert med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus ved E7.5 viser transduksjon av både SOX2+ nevrale forfedre og NeuN+-nevroner. Skalalinje = 100 μm. (C) Bokset region av B som viser DRG med GFP-uttrykk i SOX2+ (hvite piler) og NeuN+ (hvite pilspisser) cellepopulasjoner. Skalalinje = 20 μm. (D) Konfokalt bilde av E13.5 ryggmarg og DRG injisert med DCX-H2B-GFP lentivirus ved E7.5, rettet mot bare DCX + celler. Skalalinje = 100 μm. (E) Bokset region av D som viser DRG med GFP-uttrykk begrenset til DCX + nevroner (hvite pilspisser). DCX-celler er negative for GFP (hvite piler). Skala bar = 20 μm. Forkortelser: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; CNS = sentralnervesystemet; PNS = perifert nervesystem; DRGs = dorsal rot ganglia; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

I denne protokollen beskriver vi hvordan man injiserer musefosterhulen ved E7.5 med lentivirus, noe som fører til jevn transduksjon av hele nevrale platen, med minimale skadelige effekter på overlevelse eller embryonal utvikling.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) på embryonal dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE tillater målretting og genetisk manipulering av musens embryonale nervesystem fra embryonal dag 7.5 og muliggjør generering av knockdown- eller avstamningssporingsmodeller i løpet av dager. Denne protokollen er tilpasningsdyktig, fleksibel og rask. Vi kan levere shRNA, cdRNA eller strekkodede virale biblioteker for å løse forskjellige spørsmål i dager i stedet for måneder eller år.Vi forventer at NEPTUN vil gi innsikt i nevrovitenskap, men det kan også tilpasses andre organsystemer. Å identifisere fosterhulen kan være ganske utfordrende, så ta deg tid til å se på ultralydbildet og kanskje ha en lærebok eller annen anatomiressurs for hånden. For å begynne å legge nålen, skyv glassnålen på metallstempelet, og hold colletten festet, men litt løsnet.Skyv deretter kapillærnålen sammen med metallstemplet gjennom den fremre pakningen til den når avstandsstykket. Trykk på Tøm for å presse stempelet inn i kanylen og fjern oljen fra nålespissen. Trykk deretter på Fyll for å lage en luftboble som deler oljen og løsningen.Til slutt senker du kanylen, senker spissen ned i oppløsningen og trykker på Fyll igjen for å legge inn kanylen. Etter å ha fiksert en bedøvet kvinnelig mus med ideell størrelse fostervann på varmebordet, bruk øyegel på begge øynene for å forhindre uttørking av hornhinnen og injiser smertestillende subkutant. Steriliser deretter underlivet ved å tørke med en klut gjennomvåt med 0,5 milligram per milliliter klorhexidinoppløsning og tørk huden.Deretter, ved hjelp av kirurgisk saks, gjør du et 1,5 til 2 centimeter vertikalt midtlinjehudinnsnitt i underlivet. Løft deretter huden forsiktig og frigjør den fra det underliggende muskellaget omtrent en centimeter rundt snittpunktet for å lette suturering etter operasjonen. Deretter lager du et en-centimeter vertikalt midtlinjesnitt i muskellaget.Bruk ett par tang, løft den ene siden av huden og muskellaget, og med et annet par, se etter livmorhornene. Deretter holder du vevet mellom embryoene ved hjelp av tang og trekker forsiktig ut begge livmorhornene fra magen. Tell og nummer embryoene, enten fra eggstokken til livmorhalsen eller fra livmorhalsen til eggstokken, på begge sider.Deretter, med en fuktig bomullspinne, skyv forsiktig alle embryoer tilbake i bukhulen, bortsett fra de tre første som skal injiseres. Legg deretter en dråpe PBS på en elastisk membran limt til den runde sentrale åpningen av en kommersielt tilgjengelig modifisert petriskål og hold den umiddelbart over embryoene. Sett lukket tang inn i snittet av elastikken, slipp deretter tangen for å åpne det elastiske snittet, slipp væsken på embryoene.Bruk tang, trekk delen av livmoren som tilsvarer de tre embryoene gjennom elastikken og legg forsiktig petriskålen på musens underliv. Bruk fire leireføtter, fest og fest petriskålen over magen for å redusere trykket på musen, og også redusere følsomheten til avbildning for musens pust og hjerterytme. Deretter bruker du tang og en fuktig bomullspinne, justerer livmoren og elastikken for å sikre at elastikken er forseglet rundt musens hud, og forhindrer PBS-lekkasje.Deretter, for å fikse livmoren, trykk modelleringsleiresylinderen ned til høyre for embryoene eller livmoren og legg PBS til petriskålen til embryoene og livmoren er helt dekket med PBS. For å lette opptaket av injeksjonene, dypp ultralydssonden i PBS og juster musen eller operasjonsbordet slik at det første embryoet er justert med ultralydssonden. Skann gjennom alle tre embryoene og inspiser fosterhulene.Deretter måler du diameteren på fosterhulen ved hjelp av ultralydsmaskinen for å bestemme riktig injeksjonsvolum. Bruk injeksjonskontrolleren, sett de bestemte injeksjonsvolumene og injeksjonshastigheten til å bremse, med en injeksjonshastighet på 23 nanoliter per sekund. Etter å ha senket nålen i PBS, ved hjelp av hovedhjulene på skinnesystemet, trykker du på Tøm på nanoinjektorkontrolleren til væsken når nålespissen.Løft deretter nålen ut av PBS og trykk på Inject for å kontrollere at en dråpe med omtrentlig ønsket volum er utladet. Senk nålen inn i PBS igjen og flytt nanoinjektoren med Y-planhjulet på mikromanipulatoren for å justere nålen med ultralydssonden og embryoet. Juster nålvinkelen med injeksjonsvinkelhjulet for å sikre en nesten vinkelrett injeksjonsvinkel i forhold til livmorveggen.Bruk deretter injeksjonshjulet på mikromanipulatoren, og sett nålen inn i fosterhulen i en bevegelse. Hvis nålespissen forsvinner fra ultralydbildet, flytt sonden fremover eller bakover for å bringe nålen tilbake i fokus. Injiser deretter ønsket volum ved å trykke på Injiser for riktig antall ganger.Etter at ønsket volum er injisert, vent i 5 til 10 sekunder før nålen trekkes inn i en forsiktig bevegelse. Flytt scenen til neste embryo og gjenta injeksjonen for de to andre embryoene som vist. Deretter løfter du ultralydssonden og nålen ut av PBS ved hjelp av mikromanipulatoren, og vri nålen bort fra operatøren for å unngå skade og skade.Bruk tang, plasser det første og andre embryoet tilbake i magen ved å skyve dem forsiktig gjennom elastikken. Ta deretter forsiktig tak i vevet ved siden av det tredje embryoet og trekk livmoren mot den øvre enden av det elastiske snittet. Trekk forsiktig opp det fjerde til det sjette embryoet med tang og la det tredje embryoet komme inn i magen igjen.Etter at alle embryoer med optimale fosterhulrom er injisert, skyv forsiktig embryoene og livmoren tilbake i musens underliv. Vellykket transduksjon av nevrale platen resulterer i embryoer med sterkt uttrykk for en fluorescerende reporter i hjernen og andre ektoderm-avledede vev, som hud. Injisering av for høye volumer kan føre til nevralrørsdefekter, for eksempel exencephaly.Vellykkede injeksjoner på embryonale dag 7.5 resulterer i jevn transduksjon fra forhjernen til bakhjernen, inkludert choroid plexus. Injeksjoner med lavt titer resulterer i transduksjon av encellede kloner, mens høytitervirus transduserer nesten 100% av hele hjernen. Koronale seksjoner gjennom embryonale dag 13,5 embryoer viste høy og jevn transduksjon av nevralvev i øyet, linsen, hornhinnen og mesenkymet.Etter injeksjon på embryonale dag 9.5 utvikler spyttkjertler og kanaler seg rundt embryonale dag 11.5 fra det orale epitelet. Det språklige epitelet i tungen er godt transdusert, mens det underliggende mesenkymet er negativt. I tillegg er de positive klyngene i det språklige epitelet skilt av negative seksjoner, noe som tyder på transduksjon av papillaroverflaten.Injeksjoner på embryonale dag 7.5 resulterer i utbredt transduksjon av tungemesenkymet på embryonale dag 13.5, noe som tyder på at tidlige injeksjoner retter seg mot nevrale kamceller, noe som bidrar til mesenkymet i tungen. Lentivirale injeksjoner fører også til utbredt målretting av det sentrale og perifere nervesystemet, og transduserer både nevroner og forfedre i ryggmargen, samt dorsale rotganglia. God forberedelse er viktig.Sørg for at det ikke er lekkasje og at embryoene er godt festet, slik at du kan fokusere helt på injeksjonene i rottehulen. Etter Neptun kan analyse gjøres ved hjelp av ulike metoder, for eksempel immunfluorescerende analyse av hjernen, encellet RNA-sekvensering, eller slik at de injiserte embryoene kan bli født for atferdsanalyse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Nøyaktig og Fenol Gratis DNA sexing av Dag 30 svinekjøtt embryoer ved PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Diagnostikk klarert Embryonic og barsel hjerter på Single-celle Oppløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-basert System for i Vivo implantering av embryonale Cardiomyocytes i Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

I Situ Påvisning av Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline ved hjelp av nærhetligation analyse

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...