Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Agradecemos a Bettina Semsch e Jia Sun (Infinigene) pelo cuidado especializado com ratos; Florian Salomons e Göran Månsson do Biomedicum Imaging Core (BIC) para assistência com aquisição e consulta de imagens. Financiamento: Agradecemos aos seguintes financiadores pelo apoio deste projeto: O Conselho sueco de Pesquisa, o Instituto Karolinska (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID funding, and SFO StratNeuro funding, the Center of Innovative Medicine), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, a Tornspiran Foundation, a Jeansssons Foundation, Sven e Ebba-Christina Hagbergs Prize e research Grant, Knut e Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik e Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation, e as Fundações Suecas Starting Grant to ERA. A Figura 4D,E foi criada com BioRender.com.

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	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. 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J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Existem vários passos neste protocolo que influenciam a sobrevivência embrionária, a qualidade das injeções e a leitura. A idade gestacional dos embriões é definida como E0.5 ao meio-dia do plugue vaginal após o acasalamento durante a noite. A realização da verificação de ultrassom para gravidez no E6.5 no final da tarde/noite garante que os embriões sejam desenvolvidos o suficiente para serem identificados pelo ultrassom. A verificação (1) permite a pré-triagem de quantos camundongos plug-positivos estão realmente grávidas, (2) garante que nenhum vírus seja descongelado desnecessariamente e desperdiçado no caso de camundongos plug-positivos não estarem grávidas, e (3) reduz intervenções desnecessárias em camundongos (evita cirurgia em fêmeas não grávidas).
Na E7.5, os embriões são sensíveis às forças externas e devem ser tratados com cuidado. Por exemplo, puxar os chifres uterinos ou apertar as deciduas pode levar à resorção de embriões. O tecido uterino deve ser sempre mantido úmido quando fora do abdômen feminino para evitar que o tecido seque. A maioria das deciduas deve permanecer dentro do abdômen feminino, com apenas 3-4 expostos para injeções. A nitidez da agulha é outro determinante crucial para injeções bem sucedidas. Pontas de agulhas cegas ou quebradas resultam em cutucamento repetido de deciduas ou compressão contra a argila de modelagem antes de entrar no AC, o que pode aumentar a taxa de resorção. Portanto, agulhas bem moídas e afiadas devem ser sempre armazenadas com segurança e substituídas após um máximo de 2 fêmeas.
Este protocolo descreve como atingir a placa neural com uma única injeção de lentivírus. Além disso, mostra como a eficácia da transdução pode ser adaptada de clones unicelulares para todo o cérebro. No entanto, outros tecidos não neurais, incluindo a pele e o epitélio oral, também são alvos. Além disso, todos os tipos de células (progenitores e células diferenciadas) são transduzidos, tornando essa abordagem eficiente, mas não específica. O uso de MiniPromoters na construção viral leva à expressão específica do transgene em neurônios ou astrócitos15. Isso tem a vantagem de evitar o uso de animais cre transgênicos dedicados e, portanto, reduz a quantidade de mão-de-obra (manutenção de tensão e genotipagem) e os custos.
As limitações do NETUNO incluem sua dificuldade técnica, desafios na obtenção de gestantes a uma taxa previsível e consistente e os custos de aquisição de instrumentação especializada. Além disso, o direcionamento não seletivo de células por lentivírus pode ser visto como um benefício e uma limitação da técnica. A injeção de volumes maiores no AC resulta em exencefalia13, embora malformações cerebrais e exencefalia sejam evitadas com os volumes descritos aqui15. Um impacto negativo no desenvolvimento cerebral é, portanto, um risco com injeções nano-injeções uterinas que devem ser cuidadosamente evitadas injetando volumes corretos adaptados ao estágio embrionário e ao tamanho de AC.
Futuras adaptações da técnica podem se concentrar no tropismo viral. Os vírus associados ao Adeno (AAVs) possuem diferentes sorotipos, que têm sido mostrados para atingir robustamente diferentes tipos de células no CNS17,26. No entanto, os AAVs não se integram ao genoma da célula hospedeira e, portanto, podem ser perdidos em células com uma alta taxa de divisão. Embora existam várias maneiras de aumentar a especificidade do NETUNO, os animais transgênicos ainda são o padrão-ouro quando se trata de manipulação genética in vivo. Os camundongos Cas9 e o lentivírus de codificação de sgRNA têm sido usados para triagem genética na epiderme embrionária27 e também podem ser adaptados ao CNS em desenvolvimento.
As injeções no AC em E7.5 visam eficientemente as células do neuroectoderme antes do início da neurulação e visam o cérebro em desenvolvimento de forma mais eficiente do que na eletroporação uterina . Isso permite o estudo de pistas genéticas importantes para o desenvolvimento cerebral a partir de um ponto de tempo anterior. Em contraste com os modelos clássicos de camundongos genéticos, o NETUNO oferece uma abordagem flexível para realizar a análise genética funcional. Fenótipos após superexpressão ou exclusão genética podem ser estudados dentro de dias a semanas em comparação com meses ou anos. As injeções de múltiplas construções virais permitem a manipulação de vários genes dentro de um embrião e evitam a geração de animais duplos ou triplos. Portanto, o NETUNO não só economiza tempo como também pode reduzir o número de animais utilizados na pesquisa.

O cérebro e a medula espinhal estão entre os primeiros órgãos a iniciar a formação durante a embriogênese 1,2. Embora os genes associados a distúrbios neurodesenvolvimentos estejam sendo identificados, o interrogatório funcional de variantes genéticas ficou para trás 3,4. Como a geração de camundongos knockout condicional pode levar meses ou anos, uma técnica alternativa para investigar rapidamente a função genética no cérebro em desenvolvimento é de interesse. Em embriões de camundongos, a neurulação - o processo morfogenético pelo qual a placa neural se transforma no tubo neural para dar origem ao sistema nervoso central (SNC) - ocorre entre os dias 8 e 10 pós-concepção5. Antes do início da neurulação, a placa neural, como parte do ectoderme, consiste em uma única camada de células colunares que se proliferarão e se diferenciarão nos numerosos tipos de células neuronais e gliais dentro do CNS 6,7. Portanto, induzir experimentalmente alterações duradouras à expressão genética no SNC, direcionar a placa neural oferece vantagens óbvias, incluindo a acessibilidade de todas as células progenitoras.
Na neurociência, na eletroporação ovo 8,9 e transdução viral de embriões de camundongos têm sido usados para manipular a expressão genética cns embrionária. O embrião de pintinho em desenvolvimento tem sido um modelo de escolha para estudar a função genética durante o desenvolvimento da medula espinhal devido à acessibilidade do embrião pintinho no ovo e à facilidade resultante de manipular a expressão genética. Em particular, em ovo plasmid a eletroporação gera condições experimentais e de controle em cada medula espinhal do pintinho. A eletroporação causa permeabilização da membrana celular e direciona o DNA carregado negativamente para longe do cátodo (negativo) em direção ao ânodo (positivo) aplicando um pulso elétrico através de dois eletrodos no embrião. Em camundongos, a eletroporação uterônica tem sido geralmente limitada a estágios embrionários nos quais a neurulação foi concluída, e o cérebro ou medula espinhal já consiste em várias camadas celulares, resultando em baixa eficiência de eletroporação10. A eletroporação plasmida resulta em expressão genética transitória e geralmente tem como alvo poucas células.
O ultrassom orientado na microinjeção uteronômada tem sido usado para manipular diferentes estruturas embrionárias, como a pele e o cérebro 11,12,13,14. No entanto, as injeções direcionadas ao cns murino em desenvolvimento mostraram baixa eficácia ou impactaram negativamente a sobrevida embrionária 12,13,14. Assim, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para a entrega de lentivírus de alta titer na cavidade amniótica (AC) em E7.5, que foi apelidado de NEPTUNE para neural p targeting com em uteronano-injection15. As injeções resultaram em uma eficácia de alvo duradoura de >95% de todo o cérebro em E13,5. Além disso, uma etapa de encenação foi introduzida durante a verificação do ultrassom da gravidez para classificar fêmeas e gestações por estágio de desenvolvimento para minimizar procedimentos desnecessários em animais de pesquisa e maximizar o sucesso da injeção. A eficiência da injeção e a sobrevivência estão fortemente ligadas ao aumento do tamanho do CA. Portanto, este artigo descreve como medir o tamanho do CA antes da injeção para fornecer um volume adequado ao AC que não causará resorção do embrião. O NETUNO é uma alternativa robusta à corrente em abordagens uteronômidas e pode ser adaptado para vários usos, incluindo, mas não se limitando a, ganho e perda de estudos de função, rastreamento de linhagem ou triagem15,16.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

Manipular a expressão genética no cérebro do camundongo em desenvolvimento no útero tem grande potencial para estudos genéticos funcionais. No entanto, anteriormente, ela tem sido restrita em grande parte à manipulação de estágios embrionários pós-neurulação. Um protocolo foi desenvolvido para injetar a cavidade amniótica no dia embrionário (E)7.5 e fornecer lentivírus, codificação cDNA ou shRNA, visando >95% das células de placa neural e crista neural, contribuindo para o futuro cérebro, medula espinhal e sistema nervoso periférico. Este protocolo descreve as etapas necessárias para alcançar a transdução bem sucedida, incluindo a moagem das agulhas capilares de vidro, verificação da gravidez, estadiamento do desenvolvimento usando imagens de ultrassom e volumes de injeção ideais combinados com estágios embrionários. 
Seguindo este protocolo, é possível alcançar a transdução de >95% do cérebro em desenvolvimento com lentivírus de alta titer e, assim, realizar manipulação genética de cérebro inteiro. Em contraste, é possível alcançar a transdução de mosaico usando títulos virais mais baixos, permitindo o rastreamento genético ou rastreamento de linhagem. A injeção no E7.5 também tem como alvo o ectoderme e a crista neural contribuindo para compartimentos distintos do olho, língua e sistema nervoso periférico. Esta técnica oferece, assim, a possibilidade de manipular a expressão genética em tecidos derivados de placa neural e ectoderme de camundongos a partir de estágios de pré-loção, com o benefício de reduzir o número de camundongos usados em experimentos.

Embriões injetados no E7.5 com lentivírus hPGK-H2B-GFP 11,12 foram coletados em E13,5 e examinados sob o microscópio de dissecção fluorescente (Figura 5A). A transdução bem sucedida da placa neural resulta em embriões com forte expressão de um repórter fluorescente no cérebro principalmente e em outros tecidos derivados do ectoderme, por exemplo, a pele (Figura 5A,B). A injeção de um volume excessivamente alto (maior do que os volumes recomendados aqui, por exemplo, ≥500 nL) aumenta a pressão no AC e pode resultar em resorção completa (dados não mostrados) ou defeitos do tubo neural, como exencefalia (Figura 5A). As injeções bem sucedidas no E7.5 resultam em transdução uniforme do cérebro para o cérebro traseiro (Figura 5C-J).
Os títulos lentivirais em torno de 2 ×10 10 unidades infecciosas (IFU) atingem mais de 95% de segmentação, enquanto os títulos de ~1 × 109 IFU atingem 15% de eficiência de segmentação15. Além disso, também são alvo estruturas que antes eram difíceis de atingir usando eletroporação, como o plexo coroide17,18, (Figura 5 E,F). A eficácia da transdução pode ser modificada ajustando o título viral entregue no AC. Injeções de baixo título resultam na transdução de clones unicelulares (Figura 5C, Figura 5E e Figura 5G,H) enquanto o uso de vírus de alto título transduge quase 100% de todo o cérebro (Figura 5D, Figura 5F, Figura 5H e Figura 5J ). Portanto, o NETUNO pode ser usado para transdução clonal, rastreamento de linhagem e abordagens de triagem genética ou estudar os efeitos globais da superexpressão genética ou da baixa regulação em todo o cérebro.
O desenvolvimento dos olhos dos mamíferos é o resultado da comunicação bem organizada entre três derivados do ectoderme embrionário: a retina neural (NR) e o epitélio pigmento da retina (RPE) são derivados do neuroepithelium do cérebro ventral, enquanto o ectoderme superficial dá origem à lente futura e ao epitélio da córnea. No entanto, o estroma central e o endotélio posterior, as outras duas camadas da córnea, são derivados de células de crista neural do mesenquime periocular19,20. Seções coronais através de embriões E13.5, injetados no E7.5 com lentivírus de alta titulação mostraram, semelhante ao cérebro, transdução alta e uniforme do tecido neural do olho, bem como a lente, córnea e mesenchyme (Figura 5K). À medida que a neurulação progride, as injeções em E8.5 e E9.5 resultam na continuação da mira da lente e do epítrio córnea (Figura 5L e Figura 5N), enquanto a transdução dos tecidos derivados do neuroectoderm do olho é menos eficiente em E8.5 (Figura 5L,M) ou não visada em E9.5 (Figura 5N).
Enquanto a maioria das partículas virais infectam os tecidos expostos após a injeção, algumas partículas transduem tecidos derivados não ectodérmicos que se desenvolvem mais tarde (Figura 6A). Glândulas salivares e dutos desenvolvem-se em torno de E11,5 a partir do epitélio oral21 e são direcionados com NEPTUNE (Figura 6B). Após injeções no E9.5, o epitélio lingual da língua é bem transduzido; no entanto, o mesenquima subjacente é negativo (Figura 6C; suportes denotam células transduzidas; asteriscos denotam sinal de autofluorescência não células transduzidas). Além disso, há aglomerados positivos dentro do epitélio lingual, separados por seções negativas (Figura 6C, pontas de flechabra), sugerindo transdução da superfície da papila. As células da crista neural foram descritas na mesenquime da língua subjacente e dentro do epitélio lingual, onde estão envolvidas no desenvolvimento de papilas gustativas de sabor e papilasgustativas 22. De fato, as injeções no E7.5 resultam em transdução generalizada da língua mesenquime em E13.5 (Figura 6D), sugerindo que as injeções precoces visam células de crista neural, contribuindo para o mesenquime na língua.
Em vertebrados, os gânglios de raiz dorsal (DRGs) são um componente central do sistema nervoso periférico (PNS), pois toda a entrada somatosensorial da periferia do corpo (temperatura, dor, pressão) é transmitida ao cérebro através da ativação dos neurônios DRG23. Ambos os neurônios e células gliais do DRG são derivados das células da crista neural do tronco24. A injeção lentiviral, na qual o onipresente promotor de hPGK controla a expressão do repórter fluorescente, leva a um alvo generalizado do sistema nervoso central e periférico (Figura 7A), transduzindo neurônios e progenitores na medula espinhal (Figura 7B), bem como o DRG (Figura 7C). O uso de um MiniPromoter para doublecortin25 permite limitar a expressão GFP apenas aos neurônios (15 e Figura 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figura 5: Alta eficiência ou transdução clonal com NEPTUNE. (A) Embriões E13,5 sob um microscópio de dissecção iluminado com iluminação padrão (painel esquerdo) e mesmos embriões iluminados para GFP (painel direito). Embrião não injetado na extrema esquerda, injetou embrião com sucesso na extrema direita, produzindo sinal positivo no cérebro (embrião mais à direita). Embrião exencefálico devido ao excesso de volume injetado (embrião médio). (B) Mirar a pele e o cérebro com injeção de E7.5. Barra de escala = 50 μm. (C, D) Imagens confocal de cérebro com baixa transdução clonal (C) ou transdução de alta eficiência (D). (C, E, G, I) Transdução clonal de diferentes regiões do cérebro. (D, F, H, J) Transdução de alta eficiência de diferentes regiões do cérebro. Barras de escala = 200 μm. Diferentes eficácias de transdução são representativas de outras áreas do CNS. (E, F) Miramento de Plexus choroide, clonal (E) ou com alta eficiência (F). Barras de escala = 200 μm. (G, H) Segmentação clonal (G) e alta eficiência (H) de cérebro traseiro, ampliada em (I, J). Barras de escala = 200 μm. (K) GFP expressão repórter em olho em E13.5 depois na injeção de útero em E7.5 (L, M) GFP expressão repórter no olho em E15.5 depois na injeção de útero em E8.5 (L), região encaixotado ampliada em (M), ou em E9.5 (N). Vasos sanguíneos autofluorescentes são marcados com estrelas brancas. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: NEPTUNE = neural plate targeting com in utero nano-injection; C = Córnea; LE = Lente Epitélio; LF = Fibras da lente; M = Mesenchyme; NR = Retina Neural; ON = Nervo Óptico; RPE = Epitélio pigmento de retina; GFP = proteína fluorescente verde; CNS = sistema nervoso central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figura 6: Na transdução utero de tecidos não neurais. (A) Imagem confocal da cavidade oral E15.5. Embrião foi injetado com lentivírus repórter fluorescente na E9.5. Barra de escala = 200 μm. (B, C) (B) Ampliação do painel de entrada; epitélio do ducto salivar transduzido com vírus. (C) Ampliação do painel de entrada; epitélio lingual dorsal transduzido com vírus repórter GFP (suporte branco). O mesenquima subjacente derivado das células da crista neural é negativo. Pontas de flechas brancas indicam papilas com células de crista neural negativas cercadas por células epiteliais transduzidas por vírus (glóbulos/vasos autofluorescentes são marcados com estrelas brancas). Barras de escala = 50 μm. (D) Imagem esquemática e confocal de E13,5 língua mesenchyme após injeções com vírus repórter fluorescente em E7.5. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: D = Dorsal; M = Mesenchyme; N = Nasofaringe; SLD = Duto Sublingual; DSM = Duto Submandibular; T = Língua; V = Ventral; GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figura 7: A transdução de células gânglios de raiz dorsal derivadas da crista neural. (A) O alvo neptune em E7.5 permite o direcionamento tanto do CNS quanto do PNS. (B) Imagem confocal da medula espinhal E13.5 e DRGs injetados com lentivírus repórter hPGK-H2B-GFP na E7.5 mostra a transdução de progenitores neurais SOX2+ e neurônios NeuN+ . Barra de escala = 100 μm. (C) Região encaixotado de B mostrando o DRG com expressão GFP em populações celulares SOX2+ (setas brancas) e NeuN+ (pontas de flechabrabrabra branca). Barra de escala = 20 μm. (D) Imagem confocal da medula espinhal E13,5 e DRG injetada com lentivírus DCX-H2B-GFP em E7.5, visando apenas células DCX+ . Barra de escala = 100 μm. (E) Região encaixotada de D mostrando DRG com expressão GFP restrita aos neurônios DCX+ (pontas de flecha branca). DCX- as células são negativas para GFP (setas brancas). Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: NEPTUNE = neural plate targeting com in utero nano-injection; CNS = sistema nervoso central; PNS = sistema nervoso periférico; DRGs = gânglio raiz dorsal; GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

Neste protocolo, descrevemos como injetar a cavidade amniótica do camundongo no E7.5 com lentivírus, levando à transdução uniforme de toda a placa neural, com efeitos mínimos prejudiciais sobre a sobrevivência ou desenvolvimento embrionário.

Placa neural de Murine Alvo por In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) no Dia Embrionário 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

O NETUNO permite a segmentação e a manipulação genética do sistema nervoso embrionário do camundongo a partir do dia 7.5 e permite a geração de modelos de knockdown ou rastreamento de linhagem em dias. Este protocolo é adaptável, flexível e rápido. Podemos fornecer bibliotecas virais shRNA, cdRNA ou códigos de barras para abordar diferentes questões em dias e não meses ou anos.Esperamos que o NETUNO forneça insights sobre neurociência, mas também possa ser adaptado a outros sistemas de órgãos. Identificar a cavidade amniótica pode ser bastante desafiador, então aproveite para olhar a imagem do ultrassom e talvez tenha um livro didático ou outro recurso de anatomia em mãos. Para começar a carregar a agulha, deslize a agulha de vidro sobre o êmbolo de metal, mantendo o collett preso, mas ligeiramente solto.Em seguida, empurre a agulha capilar junto com o êmbolo metálico através da junta dianteira até atingir o espaçador. Pressione esvaziar para empurrar o êmbolo na agulha e expulsar o óleo da ponta da agulha. Em seguida, pressione Encha para criar uma bolha de ar, dividindo o óleo e a solução.Por fim, abaixe a agulha, mergulhe a ponta na solução e pressione Encha novamente para carregar a agulha. Depois de fixar um camundongo fêmea anestesiado com cavidades amnióticas de tamanho ideal na mesa de aquecimento, aplique gel ocular em ambos os olhos para evitar a profanação da córnea e injete um analgésico subcutânea. Em seguida, esterilize o abdômen inferior limpando com um pano encharcado com 0,5 miligramas por solução de clorexidina mililitro e seque a pele.Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão vertical de pele média de 1,5 a 2 centímetros no abdômen inferior. Em seguida, levante a pele suavemente e liberte-a da camada muscular subjacente aproximadamente um centímetro ao redor do ponto de incisão para facilitar a sutura após a cirurgia. Em seguida, faça uma incisão vertical de um centímetro na camada muscular.Usando um par de fórceps, levante um lado da pele e camada muscular, e com outro par, procure os chifres uterinos. Em seguida, usando fórceps, segure o tecido entre os embriões e puxe cuidadosamente os dois chifres uterinos do abdômen. Conte e numerar os embriões, seja do ovário ao colo do útero ou do colo uterino para o ovário, em ambos os lados.Em seguida, com um cotonete úmido, empurre suavemente todos os embriões de volta para a cavidade abdominal, exceto os três primeiros a serem injetados. Em seguida, coloque uma gota de PBS sobre uma membrana elástica colada à abertura central redonda de uma placa de Petri modificada comercialmente disponível e segure-a imediatamente acima dos embriões. Insira fórceps fechados na incisão do elástico e solte os fórceps para abrir a incisão elástica, deixando cair o líquido nos embriões.Usando fórceps, puxe a seção do útero correspondente aos três embriões através do elástico e gentilmente empoleirar a placa de Petri no abdômen do rato. Usando quatro pés de argila, fixe e fixe a placa de Petri acima do abdômen para reduzir a pressão sobre o mouse, e também reduzir a sensibilidade da imagem à respiração e batimentos cardíacos do rato. Em seguida, usando fórceps e um cotonete úmido, ajuste o útero e o elástico para garantir que o elástico seja selado ao redor da pele do rato, evitando o vazamento de PBS.Em seguida, para fixar o útero, pressione o cilindro de argila modelando para baixo à direita dos embriões ou útero e adicione PBS à placa de Petri até que os embriões e útero estejam inteiramente cobertos com o PBS. Para facilitar o registro das injeções, mergulhe a sonda de ultrassom no PBS e ajuste o mouse ou a mesa cirúrgica para que o primeiro embrião esteja alinhado com a sonda de ultrassom. Escaneie os três embriões e inspecione as cavidades amnióticas.Em seguida, utilizando a máquina de ultrassom, meça o diâmetro da cavidade amniótica para determinar o volume de injeção adequado. Usando o controlador de injeção, defina os volumes de injeção determinados e a velocidade de injeção para diminuir, com uma taxa de injeção de 23 nanoliters por segundo. Depois de baixar a agulha para dentro do PBS, usando as rodas principais do sistema ferroviário, pressione Esvaziar no controlador de nanoinjetor até que o líquido atinja a ponta da agulha.Em seguida, levante a agulha para fora do PBS e pressione Injete para verificar se uma gota de volume aproximado desejado é descarregada. Abaixe a agulha para dentro do PBS novamente e mova o nanoinjetor com a roda do plano Y no micromanipulador para alinhar a agulha com a sonda de ultrassom e o embrião. Ajuste o ângulo da agulha com a roda de ângulo de injeção para garantir um ângulo de injeção quase perpendicular em relação à parede uterina.Em seguida, usando a roda de injeção no micromanipulador, insira a agulha na cavidade amniótica em um movimento. Se a ponta da agulha desaparecer da imagem do ultrassom, mova a sonda para frente ou para trás para trazer a agulha de volta ao foco. Em seguida, injete o volume desejado pressionando Inject para o número apropriado de vezes.Após o volume necessário ter sido injetado, espere de 5 a 10 segundos antes de retirar a agulha em um movimento suave. Mova o palco para o próximo embrião e repita a injeção para os outros dois embriões como demonstrado. Em seguida, levante a sonda de ultrassom e a agulha do PBS usando o micromanipulador, afastando a agulha do operador para evitar danos e ferimentos.Usando fórceps, coloque o primeiro e o segundo embriões de volta ao abdômen empurrando-os suavemente através do elástico. Em seguida, segure suavemente o tecido adjacente ao terceiro embrião e puxe o útero para a extremidade superior da incisão elástica. Puxe suavemente o quarto para o sexto embriões com fórceps e permita que o terceiro embrião reentre no abdômen.Depois de todos os embriões com cavidades amnióticas ideais terem sido injetados, empurre suavemente os embriões e o útero de volta para o abdômen do camundongo. A transdução bem sucedida da placa neural resulta em embriões com forte expressão de um repórter fluorescente no cérebro e outros tecidos derivados do ectoderme, como a pele. Injetar volumes excessivamente altos pode resultar em defeitos no tubo neural, como exencefalia.As injeções bem sucedidas no dia embrionário 7.5 resultam em transdução uniforme do cérebro para o cérebro traseiro, incluindo o plexo coroide. Injeções de baixa tíclica resultam na transdução de clones unicelulares, enquanto o vírus de alta tíces transduze quase 100% de todo o cérebro. As seções coronais durante o dia embrionário 13,5 embriões mostraram transdução alta e uniforme do tecido neural do olho, lente, córnea e mesenquime.Após a injeção no dia embrionário 9.5, glândulas salivares e dutos se desenvolvem em torno do dia embrionário 11,5 do epitélio oral. O epitélio lingual da língua é bem transduzido, enquanto o mesenquime subjacente é negativo. Além disso, os clusters positivos dentro do epitélio lingual são separados por seções negativas, sugerindo a transdução da superfície papilar.As injeções no dia 7.5 embrionário resultam em transdução generalizada da língua mesenquime no dia embrionário 13.5, sugerindo que as injeções precoces visam células de crista neural, contribuindo para o mesenquime na língua. As injeções lentivirais também levam a um direcionamento generalizado do sistema nervoso central e periférico, transduzindo neurônios e progenitores na medula espinhal, bem como o gânglio raiz dorsal. Uma boa preparação é essencial.Certifique-se de que não há vazamento e que os embriões estão bem fixos, para que você possa se concentrar inteiramente nas injeções na cavidade do rato. Após o NETUNO, a análise pode ser feita por vários métodos, como análise imunofluorescente do cérebro, sequenciamento de RNA unicelular, ou permitir que os embriões injetados nasçam para análise comportamental.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Biologia do Desenvolvimento

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...