Name: murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Vi tackar Bettina Semsch och Jia Sun (Infinigene) för expertvård av möss; Florian Salomons och Göran Månsson från Biomedicum Imaging Core (BIC) för hjälp med bildförvärv och konsultation. Finansiering: Vi tackar följande finansiärer för deras stöd till detta projekt: Vetenskapsrådet, Karolinska Institutet (KI-stiftelser, Karriärutvecklingsbidrag, doktorand KID-finansiering och SFO StratNeuro-finansiering, Centrum för innovativ medicin), Ollie och Elof Ericssons stiftelse, Tornspirans stiftelse, Jeansssons stiftelse, Sven och Ebba-Christina Hagbergs pris och forskningsanslag, Knut och Alice Wallenbergs projektbidrag, Fredrik och Ingrid Thurings Stiftelse, Lars Hiertas Minne, Barncancerfonden, Åhlenstiftelsen, Åke Wibergs Stiftelse, Tore Nilssons Stiftelse och Stiftelsernas startbidrag till ERA. Figur 4D,E skapades med BioRender.com.

<ol>
	<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The House mouse. Atlas of embryonic development. , (1989).</li><li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental biology. , (2016).</li><li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders.">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li><li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants.">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li><li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+mouse:+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure.">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium:+Morphometric+analyses.">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate.">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos.">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li><li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice.">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).</li><li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE.">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).</li><li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin.">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li><li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus.">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li><li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid,+robust,+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia.">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).</li><li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development+and+retinogenesis.">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391 (2012).</li><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+development+and+gene+expression.">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands:+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme,+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds.">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li><li>Marmig&#232;re, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage.">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li><li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate.">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li><li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain.">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li><li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons.">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li><li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling.">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Det finns flera steg i detta protokoll som påverkar embryonal överlevnad, kvaliteten på injektionerna och avläsningen. Embryonas graviditetsålder definieras som E0.5 vid middagstid dagen för vaginalpluggen efter parning över natten. Genom att utföra ultraljudskontrollen för graviditet vid E6.5 sent på eftermiddagen/kvällen säkerställs att embryona utvecklas tillräckligt för att identifieras med ultraljud. Kontrollen (1) möjliggör förscreening av hur många pluggpositiva möss som faktiskt är gravida, (2) säkerställer att inget virus tinas upp i onödan och slösas bort i händelse av att pluggpositiva möss inte är gravida, och (3) minskar onödiga ingrepp på möss (undviker kirurgi på icke-gravida kvinnor).
Vid E7.5 är embryon känsliga för yttre krafter och bör hanteras varsamt. Att dra i livmoderhornen eller klämma på deciduas kan till exempel leda till embryoresorption. Livmodervävnaden ska alltid hållas fuktig när den är utanför honans buk för att förhindra att vävnaden torkar. Majoriteten av deciduas bör förbli inuti den kvinnliga buken, med endast 3-4 utsatta för injektioner. Nålskärpa är en annan avgörande faktor för framgångsrika injektioner. Trubbiga eller trasiga nålspetsar resulterar i upprepad petning av deciduas eller kompression mot modelleringsleran innan den kommer in i AC, vilket kan öka resorptionshastigheten. Därför bör välmalda och skarpa nålar alltid förvaras säkert och bytas ut efter högst 2 honor.
Detta protokoll beskriver hur man riktar in sig på neuralplattan med en enda injektion av lentivirus. Dessutom visar den hur transduktionseffekt kan anpassas från encelliga kloner till hela hjärnan. Men andra icke-neurala vävnader, inklusive hud och oralt epitel, är också riktade. Dessutom transduceras alla celltyper (förfäder och differentierade celler), vilket gör detta tillvägagångssätt effektivt men ospecifikt. Användningen av MiniPromoters i den virala konstruktionen leder till det specifika uttrycket av transgenen i neuroner eller astrocyter15. Detta har fördelen att man undviker användning av dedikerade transgena Cre-djur och minskar därför mängden arbete (stamunderhåll och genotypning) och kostnader.
Neptuns begränsningar inkluderar dess tekniska svårigheter, utmaningar med att få gravida kvinnor i en förutsägbar och konsekvent takt och kostnaderna för att förvärva specialiserad instrumentering. Dessutom kan icke-selektiv inriktning av celler med lentivirus ses som både en fördel och en begränsning av tekniken. Injektion av större volymer i AC resulterar i exencefali13, även om hjärnmissbildningar och exencefali undviks med de volymer som beskrivs här15. En negativ inverkan på hjärnans utveckling är således en risk med in utero nano-injektioner som noggrant måste undvikas genom att injicera korrekta volymer anpassade till embryonalstadiet och AC-storlek.
Framtida anpassningar av tekniken kan fokusera på viral tropism. Adenoassocierade virus (AAV) har olika serotyper, som har visat sig vara robusta mot olika celltyper i CNS17,26. AAV integreras dock inte i värdcellsgenomet och kan därför gå förlorade i celler med hög delningshastighet. Även om det finns flera sätt att öka specificiteten hos NEPTUNUS, är transgena djur fortfarande guldstandarden när det gäller genmanipulation in vivo. Cas9-möss och sgRNA-kodande lentivirus har använts för genetisk screening i embryonal epidermis27 och kan också anpassas till det utvecklande CNS.
Injektioner i AC vid E7.5 riktar sig effektivt mot celler i neuroektodermen innan neurulering initieras och riktar sig mot den utvecklande hjärnan mer effektivt än vid utero-elektroporering . Detta gör det möjligt att studera genetiska ledtrådar som är viktiga för hjärnans utveckling från en tidigare tidpunkt. Till skillnad från klassiska genetiska musmodeller erbjuder NEPTUNUS ett flexibelt tillvägagångssätt för att utföra funktionell genanalys. Fenotyper efter överuttryck eller genradering kan studeras inom dagar till veckor jämfört med månader eller år. Injektioner av flera virala konstruktioner möjliggör manipulering av flera gener inom ett embryo och undviker generering av dubbla eller tredubbla knockoutdjur. Därför sparar NEPTUNUS inte bara tid utan kan också minska antalet djur som används i forskning.

Hjärnan och ryggmärgen är bland de första organen som initierar bildning under embryogenesen 1,2. Även om generna som är associerade med neurodevelopmental störningar identifieras, har den funktionella förhöret av genetiska varianter släpat efter 3,4. Eftersom genereringen av villkorliga knockoutmöss kan ta månader eller år är en alternativ teknik för att snabbt undersöka genfunktionen i den utvecklande hjärnan av intresse. I musembryon sker neurulering - den morfogenetiska processen genom vilken neuralplattan omvandlas till neuralröret för att ge upphov till centrala nervsystemet (CNS) - mellan dag 8 och 10 efter befruktningen5. Före neuruleringens början består neuralplattan, som en del av ektodermen, av ett enda lager av kolumnarceller som kommer att sprida sig och differentieras till de många neuronala och glialcelltyperna inom CNS 6,7. Därför, för att experimentellt inducera långvariga förändringar av genuttryck i CNS, erbjuder inriktning på neuralplattan uppenbara fördelar, inklusive tillgängligheten för alla stamceller.
Inom neurovetenskapen har i ovoelektroporation 8,9 och viral transduktion av musembryon använts för att manipulera embryonala CNS-genuttryck. Det utvecklande kycklingembryot har varit en modell för att studera genfunktion under ryggmärgsutveckling på grund av tillgängligheten av kycklingembryot i ägget och den resulterande lättheten att manipulera genuttryck. I synnerhet genererar elektroporering i ovo plasmider experimentella och kontrollförhållanden i varje ryggmärgsrygg. Elektroporering orsakar cellmembranpermeabilisering och leder negativt laddat DNA bort från den (negativa) katoden mot den (positiva) anoden genom att applicera en elektrisk puls via två elektroder på embryot. Hos möss har elektroporering i livmodern i allmänhet begränsats till embryonala stadier där neurulering har slutförts, och hjärnan eller ryggmärgen består redan av flera cellskikt, vilket resulterar i låg elektroporationseffektivitet10. Plasmidelektroporation resulterar i övergående genuttryck och riktar sig i allmänhet till få celler.
Ultraljudsstyrd i utero mikroinjektion har använts för att manipulera olika embryonala strukturer såsom hud och hjärna11,12,13,14. Injektioner riktade mot det framväxande murina CNS har dock visat låg effekt eller har negativt påverkat embryonal överlevnad12,13,14. Därför utvecklades ett förbättrat protokoll för leverans av högtiter lentivirus in i fosterhålan (AC) vid E7.5, som kallades NEPTUNUS för neural plate targeting med in uteronano-injection15. Injektioner resulterade i en långvarig måleffekt på >95% av hela hjärnan vid E13.5. Dessutom infördes ett iscensättningssteg under ultraljudsverifiering av graviditet för att sortera kvinnor och graviditeter efter utvecklingsstadium för att minimera onödiga procedurer på försöksdjur och maximera injektionsframgången. Injektionseffektivitet och överlevnad är tätt kopplade till ökningen av AC-storleken. Därför beskriver detta dokument hur man mäter AC-storlek före injektion för att leverera en lämplig volym till AC som inte kommer att orsaka resorption av embryot. NEPTUNUS är ett robust alternativ till nuvarande in utero-metoder och kan anpassas för flera användningsområden, inklusive, men inte begränsat till, vinst och förlust av funktionsstudier, härstamningsspårning eller screening15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 inches capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3000203G/X</td>
			<td>Were used to pull in house needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 MHz MS Series transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>MS700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic clear ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>Mar-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip Applier 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>12020-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Charles River, Germany</td>
			<td>Crl:CD1(ICR)</td>
			<td>Females: from age of 8 weeks old 
			Males: from the age of 12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>OneMed Sverige AB</td>
			<td>120788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps delicate straight 13 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>08-032-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ clips 9 mm</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>59027</td>
			<td>clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>307-336-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>Baxter Medical AB</td>
			<td>EAN: 50085412586613</td>
			<td>Purchased from Swedish Pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clarke</td>
			<td>7557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Tape</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay</td>
			<td>Sense AB</td>
			<td>10209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Handling Table</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>50249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto Injector Kit</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish with central opening (low wall)</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, (&#216;xH): 92 x 16 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>130000132037</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone membrane</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>SA-11054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steri 250, hot bead sterilizer</td>
			<td>Angthos</td>
			<td>31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>67034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual (Med. Air &#38; O2) Anesthesia System</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station 2</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-11983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo2100</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>VS-20047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>J384H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine neural plate targeting by in utero nano-injection (neptune) at embryonic day 7.5

Att manipulera genuttryck i den utvecklande mushjärnan i livmodern har stor potential för funktionella genetikstudier. Det har dock tidigare i stor utsträckning varit begränsat till manipulering av embryonala stadier efter neurulering. Ett protokoll utvecklades för att injicera fosterhålan vid embryonal dag (E) 7.5 och leverera lentivirus, kodande cDNA eller shRNA, riktat mot >95% av neuralplattan och neurala vapenceller, vilket bidrar till den framtida hjärnan, ryggmärgen och perifera nervsystemet. Detta protokoll beskriver de steg som är nödvändiga för att uppnå framgångsrik transduktion, inklusive slipning av glaskapillärnålarna, graviditetsverifiering, utvecklingsuppsättning med ultraljudsavbildning och optimala injektionsvolymer matchade med embryonala stadier. 
Efter detta protokoll är det möjligt att uppnå transduktion av >95% av den utvecklande hjärnan med högtiter lentivirus och därmed utföra genetisk manipulation av hela hjärnan. Däremot är det möjligt att uppnå mosaiktransduktion med hjälp av lägre virala titrar, vilket möjliggör genetisk screening eller härstamningsspårning. Injektion vid E7.5 riktar sig också mot ektoderm och neural crest som bidrar till distinkta fack i ögat, tungan och perifera nervsystemet. Denna teknik erbjuder således möjligheten att manipulera genuttryck i musneurala platt- och ektoderm-härledda vävnader från prenöruleringsstadier, med fördelen att minska antalet möss som används i experiment.

Embryon injicerade vid E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 samlades in vid E13.5 och undersöktes under det fluorescerande dissektionsmikroskopet (figur 5A). Framgångsrik transduktion av nervplattan resulterar i embryon med starkt uttryck av en fluorescerande reporter i hjärnan huvudsakligen och i andra ektoderm-härledda vävnader, t.ex. huden (figur 5A,B). Injektion av en alltför hög volym (större än de volymer som rekommenderas här, t.ex. ≥500 nL) ökar trycket i AC och kan resultera i antingen fullständig resorption (data visas inte) eller neuralrörsdefekter som exencefali (figur 5A). Framgångsrika injektioner vid E7.5 resulterar i enhetlig transduktion från framhjärnan till bakhjärnan (figur 5C-J).
Lentivirala titrar runt 2 × 10 10 infektiösa enheter (IFU) uppnår över 95% inriktning, medan titrar på ~ 1 ×10 9 IFU uppnår 15% måleffektivitet15. Dessutom riktas också strukturer som tidigare har varit svåra att rikta in sig på med hjälp av elektroporation, såsom choroid plexus17,18, (figur 5 E,F). Transduktionseffekten kan modifieras genom att justera virustitern som levereras till AC. Injektioner av lågtiter resulterar i transduktion av encelliga kloner (figur 5C, figur 5E och figur 5G,H) medan användning av högtitervirus transducerar nästan 100% av hela hjärnan (figur 5D, figur 5F, figur 5H och figur 5J ). Därför kan NEPTUNUS användas för antingen klonal transduktion, spårning av härstamning och genetisk screening eller för att studera de globala effekterna av genöveruttryck eller nedreglering i hela hjärnan.
Däggdjursögonutveckling är resultatet av välorganiserad kommunikation mellan tre derivat av den embryonala ektodermen: neural näthinna (NR) och retinal pigmentepitel (RPE) härrör från neuroepitelet i den ventrala framhjärnan, medan ytektodermen ger upphov till framtida lins och hornhinneepitel. Den centrala stroma och det bakre endotelet, de andra två skikten i hornhinnan, härrör emellertid från neurala vapenceller i det periokulära mesenkymet19,20. Koronala sektioner genom E13.5-embryon, injicerade vid E7.5 med högtiter lentivirus visade, liknande hjärnan, hög och enhetlig transduktion av ögats nervvävnad, liksom linsen, hornhinnan och mesenkymet (figur 5K). När neuruleringen fortskrider resulterar injektioner vid E8.5 och E9.5 i fortsatt inriktning av linsen och hornhinnans epitel (figur 5L och figur 5N), medan transduktion av ögonvävnaderna som härrör från neuroektodermer är mindre effektiv vid E8.5 (figur 5L,M) eller inte riktad mot E9.5 (figur 5N).
Medan de flesta viruspartiklar infekterar de exponerade vävnaderna vid injektion, transducerar vissa partiklar icke-ektodermala härledda vävnader som utvecklas senare (figur 6A). Spottkörtlar och kanaler utvecklas runt E11.5 från det orala epitelet21 och är riktade mot NEPTUNUS (figur 6B). Efter injektioner vid E9.5 är tungans linguala epitel väl transducerat; Det underliggande mesenkymet är dock negativt (figur 6C; parenteser betecknar transducerade celler; asterisker betecknar autofluorescenssignal som inte är transducerade celler). Dessutom finns det positiva kluster inom det linguala epitelet, åtskilda av negativa sektioner (figur 6C, vita pilspetsar), vilket tyder på transduktion av papillytan. Neurala vapenceller har beskrivits i det underliggande tungmesenkymet och inom det linguala epitelet, där de är involverade i utvecklingen av smakpapiller och smaklökar22. Faktum är att injektioner vid E7.5 resulterar i utbredd transduktion av tungans mesenkym vid E13.5 (figur 6D), vilket tyder på att tidiga injektioner riktar sig mot neurala vapenceller, vilket bidrar till mesenkym i tungan.
Hos ryggradsdjur är dorsalrotganglierna (DRG) en central komponent i det perifera nervsystemet (PNS), eftersom all somatosensorisk input från kroppens periferi (temperatur, smärta, tryck) överförs till hjärnan via aktivering av DRG-neuronerna23. Både neuroner och gliaceller i DRG härrör från stammens neurala vapenceller24. Lentiviral injektion, där den allestädes närvarande hPGK-promotorn kontrollerar uttrycket av den fluorescerande reportern, leder till utbredd inriktning av centrala och perifera nervsystemet (figur 7A), vilket transducerar både neuroner och förfäder i ryggmärgen (figur 7B), liksom DRG (figur 7C). Att använda en MiniPromoter för doublecortin25 gör det möjligt att begränsa GFP-uttryck till endast neuroner (15 och figur 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figur 5: Hög effektivitet eller klontransduktion med NEPTUNUS. A) E13.5-embryon under ett dissektionsmikroskop belysta med standardbelysning (vänster panel) och samma embryon som belyses för GFP (höger panel). Oinjicerat embryo längst till vänster, framgångsrikt injicerat embryo längst till höger, vilket ger positiv signal i hjärnan (höger embryo). Exencefaliskt embryo på grund av överskott av injicerad volym (mellanembryo). (B) Hud- och hjärninriktning med E7.5-injektion. Skalstreck = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokala bilder av framhjärnan med låg klonal transduktion (C) eller högeffektiv transduktion (D). (C, E, G, I) Klonal transduktion av olika regioner i hjärnan. (D, F, H, J) Högeffektiv transduktion av olika regioner i hjärnan. Skalstänger = 200 μm. Olika transduktionseffektiviteter är representativa för andra områden i CNS. (E, F) Choroid Plexus-inriktning, klonalt (E) eller med hög effektivitet (F). Skalstänger = 200 μm. (G, H) Klonal inriktning (G) och högeffektiv (H) inriktning av bakhjärnan, förstorad i (I, J). Skalstänger = 200 μm. (K) GFP-reporteruttryck i ögat vid E13.5 efter i uteroinjektion vid E7.5 (L, M) GFP-reporteruttryck i ögat vid E15.5 efter i uteroinjektion vid E8.5 (L), boxad region förstorad i (M) eller vid E9.5 (N). Autofluorescerande blodkärl är markerade med vita stjärnor. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: NEPTUNUS = neural plate targeting med in uteronano-injection; C = Hornhinna; LE = Linsepitel; LF = Linsfibrer; M = mesenkym; NR = Neural näthinna; ON = Optisk nerv; RPE = retinal pigmentepitel; GFP = grönt fluorescerande protein; CNS = centrala nervsystemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figur 6: In utero transduktion av icke-neurala vävnader. (A) Konfokal bild av E15.5 munhålan. Embryot injicerades med fluorescerande reporter lentivirus vid E9.5. Skalstreck = 200 μm. (B, C) (B) Förstoring av infälld panel; salivkanalepitel transducerat med virus. C) Förstoring av infälld panel. dorsalt språkligt epitel transducerat med GFP-reportervirus (vit konsol). Det underliggande mesenkymet som härrör från neurala vapenceller är negativt. Vita pilspetsar indikerar papiller med negativa neurala vapenceller omgivna av virustransducerade epitelceller (autofluorescerande blodkroppar / kärl är markerade med vita stjärnor). Skalstänger = 50 μm. (D) Schematisk och konfokal bild av E13.5 tungmesenkym efter injektioner med fluorescerande reportervirus vid E7.5. Skalstreck = 50 μm. Förkortningar: D = Dorsal; M = mesenkym; N = Nasofarynx; SLD = Sublingual kanal; SMD = submandibulär kanal; T = Tunga; V = Ventral; GFP = grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figur 7: Transduktion av neurala crest-härledda dorsalrot ganglionceller. (A) NEPTUN-inriktning vid E7.5 möjliggör inriktning av både CNS och PNS. (B) Konfokal bild av E13.5 ryggmärg och DRG injicerade med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus vid E7.5 visar transduktion av både SOX2 + neurala stamfäder och NeuN + neuroner. Skalstreck = 100 μm. (C) Boxat område av B som visar DRG med GFP-uttryck i SOX2+ (vita pilar) och NeuN+ (vita pilspetsar) cellpopulationer. Skalstreck = 20 μm. (D) Konfokal bild av E13.5 ryggmärg och DRG injicerad med DCX-H2B-GFP lentivirus vid E7.5, endast inriktad på DCX + -celler. Skalstreck = 100 μm. (E) Boxat område av D som visar DRG med GFP-uttryck begränsat till DCX + -neuroner (vita pilspetsar). DCX-celler är negativa för GFP (vita pilar). Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: NEPTUNUS = neural plate targeting med in utero nano-injection; CNS = centrala nervsystemet; PNS = perifert nervsystem; DRG = dorsalrotganglier; GFP = grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5 at JoVE.com

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

I detta protokoll beskriver vi hur man injicerar musens fosterhålighet vid E7.5 med lentivirus, vilket leder till enhetlig transduktion av hela neuralplattan, med minimala skadliga effekter på överlevnad eller embryonal utveckling.

Murin neural platta inriktning av In Utero Nano-Injection (NEPTUNUS) vid embryonal dag 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNUS möjliggör inriktning och genetisk manipulation av musens embryonala nervsystem från embryonal dag 7.5 och möjliggör generering av knockdown- eller härstamningsspårningsmodeller i dagar. Detta protokoll är anpassningsbart, flexibelt och snabbt. Vi kan leverera shRNA, cdRNA eller streckkodade virala bibliotek för att ta itu med olika frågor på dagar snarare än månader eller år.Vi förväntar oss att NEPTUNUS kommer att ge insikter inom neurovetenskap men det kan också anpassas till andra organsystem. Att identifiera fosterhålan kan vara ganska utmanande, så ta dig tid att titta på ultraljudsbilden och kanske ha en lärobok eller annan anatomiresurs till hands. För att börja ladda nålen, skjut glasnålen på metallkolven och håll kolletten fastsatt men något lossad.Tryck sedan kapillärnålen tillsammans med metallkolven genom den främre packningen tills den når distansen. Tryck på Tom för att trycka in kolven i nålen och släpp ut oljan från nålspetsen. Tryck sedan på Fyll för att skapa en luftbubbla, dela oljan och lösningen.Slutligen sänker du nålen, sänker ner spetsen i lösningen och trycker på Fyll igen för att ladda nålen. Efter att ha fixerat en bedövad kvinnlig mus med fosterhåligheter i idealisk storlek på värmebordet, applicera ögongel på båda ögonen för att förhindra uttorkning av hornhinnan och injicera ett smärtstillande medel subkutant. Sterilisera sedan underlivet genom att torka av med en trasa som blötläggs med 0,5 milligram per milliliter klorhexidinlösning och torka huden.Använd sedan kirurgisk sax och gör ett 1,5 till 2 centimeter vertikalt snitt i mitten av huden i underlivet. Lyft sedan huden försiktigt och frigör den från det underliggande muskellagret ungefär en centimeter runt snittpunkten för att underlätta suturering efter operationen. Gör sedan ett en centimeter vertikalt mittlinjesnitt i muskelskiktet.Använd ett par pincett, lyft ena sidan av huden och muskelskiktet, och med ett annat par, leta efter livmoderhornen. Håll sedan vävnaden mellan embryona med pincett och dra försiktigt ut båda livmoderhornen från buken. Räkna och numrera embryona, antingen från äggstocken till livmoderhalsen eller från livmoderhalsen till äggstocken, på båda sidor.Därefter, med en fuktig bomullspinne, tryck försiktigt alla embryon tillbaka i bukhålan, förutom de tre första som ska injiceras. Placera sedan en droppe PBS på ett elastiskt membran limmat på den runda centrala öppningen av en kommersiellt tillgänglig modifierad petriskål och håll den omedelbart ovanför embryona. Sätt in stängda pincett i elastikens snitt, släpp sedan pincetten för att öppna det elastiska snittet och släpp vätskan på embryona.Använd pincett och dra den del av livmodern som motsvarar de tre embryona genom elastiken och sätt försiktigt petriskålen på musens buk. Använd fyra lerfötter, säkra och fäst petriskålen ovanför buken för att minska trycket på musen och också minska känsligheten för avbildning för musens andning och hjärtslag. Använd sedan pincett och en fuktig bomullspinne och justera livmodern och elastiken för att säkerställa att elastiken är förseglad runt musens hud, vilket förhindrar PBS-läckage.Därefter, för att fixera livmodern, tryck modelleringslercylindern ner till höger om embryona eller livmodern och tillsätt PBS till petriskålen tills embryon och livmoder är helt täckta med PBS. För att underlätta inspelningen av injektionerna, doppa ultraljudssonden i PBS och justera musen eller operationsbordet så att det första embryot är i linje med ultraljudssonden. Skanna igenom alla tre embryona och inspektera fosterhålorna.Mät sedan fosterhålans diameter med hjälp av ultraljudsmaskinen för att bestämma lämplig injektionsvolym. Använd injektionsregulatorn och ställ in de bestämda injektionsvolymerna och injektionshastigheten på långsam, med en injektionshastighet på 23 nanoliter per sekund. När du har sänkt nålen i PBS, med hjälp av huvudhjulen på skensystemet, tryck på Töm på nanoinjektorregulatorn tills vätskan når nålspetsen.Lyft sedan nålen ur PBS och tryck på Injicera för att verifiera att en droppe med ungefärlig önskad volym släpps ut. Sänk nålen i PBS igen och flytta nanoinjektorn med Y-planhjulet på mikromanipulatorn för att justera nålen med ultraljudssonden och embryot. Justera nålvinkeln med insprutningsvinkelhjulet för att säkerställa en nästan vinkelrät injektionsvinkel i förhållande till livmoderväggen.Använd sedan injektionshjulet på mikromanipulatorn och sätt in nålen i fosterhålan i en rörelse. Om nålspetsen försvinner från ultraljudsbilden, flytta sonden framåt eller bakåt för att få nålen tillbaka i fokus. Injicera sedan önskad volym genom att trycka på Injicera för lämpligt antal gånger.När den önskade volymen har injicerats, vänta i 5 till 10 sekunder innan du drar tillbaka nålen i en mild rörelse. Flytta scenen till nästa embryo och upprepa injektionen för de andra två embryona enligt vad som visats. Lyft sedan ultraljudssonden och nålen ur PBS med hjälp av mikromanipulatorn och vrid nålen bort från operatören för att undvika skador och skador.Använd pincett och placera de första och andra embryona tillbaka i buken genom att försiktigt trycka dem genom elastiken. Ta sedan försiktigt tag i vävnaden intill det tredje embryot och dra livmodern mot den övre änden av det elastiska snittet. Dra försiktigt upp det fjärde till det sjätte embryot med pincett och låt det tredje embryot återinträda i buken.När alla embryon med optimala fosterhålor har injicerats, tryck försiktigt embryon och livmoder tillbaka i musens buk. Framgångsrik transduktion av nervplattan resulterar i embryon med starkt uttryck av en fluorescerande reporter i hjärnan och andra ektoderm-härledda vävnader, som hud. Injicering av alltför höga volymer kan leda till neuralrörsdefekter, såsom exencefali.Framgångsrika injektioner vid embryonal dag 7,5 resulterar i enhetlig transduktion från framhjärnan till bakhjärnan, inklusive choroid plexus. Injektioner av låg titer resulterar i transduktion av encelliga kloner, medan högtitervirus transducerar nästan 100% av hela hjärnan. Koronala sektioner genom embryonala dag 13,5 embryon visade hög och enhetlig transduktion av nervvävnad i ögat, linsen, hornhinnan och mesenkymen.Efter injektion vid embryonal dag 9.5 utvecklas spottkörtlar och kanaler runt embryonal dag 11,5 från det orala epitelet. Tungans linguala epitel är väl transducerad, medan det underliggande mesenkymet är negativt. Dessutom separeras de positiva klustren i det linguala epitelet av negativa sektioner, vilket tyder på transduktion av papillärytan.Injektioner vid embryonal dag 7.5 resulterar i utbredd transduktion av tungans mesenkym vid embryonal dag 13.5, vilket tyder på att tidiga injektioner riktar sig mot neurala crestceller, vilket bidrar till mesenkymet i tungan. Lentivirala injektioner leder också till utbredd inriktning av centrala och perifera nervsystemet, vilket transducerar både neuroner och förfäder i ryggmärgen, liksom dorsalrotganglierna. Bra förberedelser är viktigt.Se till att det inte finns något läckage och att embryona är väl fixerade, så att du kan fokusera helt på injektionerna i råtthålan. Efter NEPTUNUS kan analys göras med olika metoder, såsom immunofluorescerande analys av hjärnan, encells RNA-sekvensering eller att låta de injicerade embryona födas för beteendeanalys.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i Serumfri enskiktskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Noggrann och fenol Fri DNA könsbestämning av Dag 30 svinembryon genom PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared embryonala och postnatal Hearts vid encelliga Upplösning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medierad förlust av funktion analys i lillhjärnan Granule celler med hjälp av In Utero elektroporation-baserade genöverföring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenös och Intra-fostervatten In Utero Transplantation i murina modellen

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

In Situ Detektion av Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline med hjälp av Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...