Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا لورينزو سيوانان وخورخي نونيز على عملهما في تطوير تصميم كاسيت زراعة الأنسجة المستخدم في هذا البروتوكول ، ومختبر كامينسكي لاستخدام الاهتزاز الخاص بهما ، وماوريتسيو تشيوتشيولي وجيسيكا نوس للمساعدة في تقطيع الرئة ، وآلي لاروكو للمساعدة في التجارب التجريبية الأولية ، وهونغ تشيان على القراءة المتأنية للبروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F30HL143880 (K.L.L.) ، ومنحة تدريب برنامج تدريب العلماء الطبيين T32GM136651 (K.L.L.) ، و U01HL145567 (L.E.N.) ؛ ومن خلال هدية بحثية غير مقيدة من شركة Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. هو مؤسس ومساهم في Humacyte، Inc، وهي شركة للطب التجديدي. تنتج Humacyte أوعية دموية هندسية من خلايا العضلات الملساء الخيفية لجراحة الأوعية الدموية. زوج L.E.N. لديه أسهم في Humacyte ، ويعمل L.E.N. في مجلس إدارة Humacyte. L.E.N. هي مخترعة على براءات الاختراع المرخصة لشركة Humacyte والتي تنتج إتاوات ل L.E.N. L.E.N. تلقت هدية بحثية غير مقيدة لدعم البحث في مختبرها في جامعة ييل. لم يؤثر Humacyte على سلوك أو وصف أو تفسير النتائج الواردة في هذا التقرير.

تصف هذه الورقة استخدام شرائح الرئة المقطعة بدقة كمنصة لتوليد أنسجة رئوية هندسية في المختبر ، والتي تحتوي على هياكل تشبه السنخية متعددة السلالات. من خلال الجمع بين الاستراتيجيات التي طورناها سابقا لإعادة ملء سقالات الرئة ECM اللاخلوية عالية الدقة لهندسة الرئة الكاملة 22,31 ، مع نظامنا القوي لزراعة أنسجة القلب الهندسية على نطاق صغير 30 ، يتيح هذا البروتوكول استخدام ECM الرئوي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية كركيزة لزراعة الأنسجة ، بطريقة قابلة للتكرار ومعتدلة الإنتاجية.
الطرق المعروضة هنا تفصل إعداد سقالة ELT من رئتي الفئران ، والتي يمكن تحقيقها بسهولة ، ويمكن استخراجها بشكل جماعي مع إمكانية الوصول المباشر إلى الشعب الهوائية السليمة لتضخم الأغاروز ، وهي ذات حجم أكبر من رئة الفأر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي أنسجة رئوية يمكن نفخها باستخدام الأغاروز وشرائح إنتاجية لا يقل طولها عن 9 مم داخل هذا النظام. بغض النظر عن مصدر الأنسجة ، فإن التضخم الموحد لأنسجة الرئة مع الأغاروز هو الخطوة الأكثر أهمية لضمان نجاح تقطيع الأنسجة وقصها ومعالجتها. تميل أنسجة الرئة غير المنتفخة إلى التقطيع بشكل نظيف ، في حين أن الأنسجة المنتفخة بشكل مفرط قد تتمزق أثناء القطع. بعد هلام الأغاروز ، تكون مناطق الأنسجة المتضخمة بشكل مناسب ثابتة ولكنها توفر القليل من العطاء عند الضغط عليها بلطف باستخدام الملقط. بالنسبة لرئتي الفئران السليمين ، وجدنا أن النفخ المسبق للرئتين المستخرجتين بالهواء عدة مرات ، يليه تضخم الأغاروز في أقرب وقت ممكن بعد الاستخراج ، يؤدي إلى أفضل نتائج التقطيع وأفضل جودة لسقالات الأنسجة الناتجة. يجب تحسين الحجم المناسب من الأغاروز تجريبيا ؛ بالنسبة لرئة الفئران ، يبلغ الحجم المطلوب لتضخيم الرئة إلى إجمالي سعة الرئة حوالي 30 مل / كجم من الكتلة الحيوانية (على سبيل المثال ، 10.5 مل من الأغاروز للرئتين من فأر 350 جم). بالنسبة لأنسجة الرئة الأكبر حجما مع وصول أقل مباشرة إلى مجرى الهواء (مثل تلك الموجودة من متبرعين بشريين) ، قد يكون من الضروري إجراء بعض عمليات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الإضافية لتضخيم الأنسجة عبر الشعب الهوائية32. أثناء تقطيع الرئة اللاحق ، يعد اختيار وتوجيه الأنسجة على المكبس خطوة مهمة أخرى ل 1) التأكد من أن الشرائح كبيرة بما يكفي لتوليد شرائط الأنسجة التي يمكن قصها في أشرطة زراعة الأنسجة و 2) زيادة مساحة الأنسجة المتنية (السنخية) ، باستثناء الشعب الهوائية الكبيرة أو الأوعية.
يمكن أن يكون قص PCLS في أشرطة زراعة الأنسجة خطوة صعبة في البداية ، ولكن الكاسيت يبسط إلى حد كبير التعامل مع الأنسجة أثناء إزالة الخلايا والبذر. هناك مشكلتان محتملتان قد تنشآن هما تمزق الأنسجة (إما أثناء عملية القطع ، أو أثناء إزالة الخلايا) ، أو وضع الأنسجة في المقاطع التي تؤدي إلى ضعف البذر في المصب (على سبيل المثال ، عدم البذر ، أو البذر فقط في النهايات). قد يكون التمزق نتيجة للتضخم المفرط في الأغاروز ، أو الإفراط في تمدد الأنسجة أثناء إدخال علامة التبويب ، أو ترك القليل جدا من التراكم لتوفير قبضة كافية على الأنسجة عند إدخال علامات التبويب. لاحظ أن الشرائح التي تمزق في نهاية مقطع واحد قد يتم زرعها بنجاح ، ومع ذلك ، يصعب تصورها تحت المجهر أثناء الزراعة لأن الأنسجة ليست مسطحة. من المحتمل أن يكون ضعف بذر الأنسجة (مثل ذلك الوارد في الشكل 6C) نتيجة لعدم وجود شريحة مسطحة بين المقطعين ، وبالتالي ضعف الاتصال بقاعدة حمام البذر جيدا عند قلبها رأسا على عقب. سبب آخر محتمل هو الجلوس غير السليم للكاسيت في الجزء السفلي من حمام البذر جيدا. من حيث القطع ، ضع المزيد من التوتر قليلا في الأنسجة عند وضع المقطع الثاني لمساعدته على الاستلقاء. بعض الشرائح لها تقعر طفيف. في هذه الحالات ، قم بقص الشريحة مع الجانب المحدب لأعلى. مع الممارسة ، عادة ما نواجه البذر الفاشل مع أقل من 2٪ من الشرائح.
أحد قيود هذا البروتوكول هو متطلبات بعض المعدات المتخصصة - قاطع ليزر وطابعة 3D - لتوليد المواد الأولية لإعداد ELT. ومع ذلك ، بمجرد إنشاء أشرطة زراعة الأنسجة وحمامات البذر ، لا يلزم وجود مواد خاصة إضافية. تستغرق خطوات تقطيع الرئة وإزالة الخلايا من إعداد سقالة ELT وقتا معتدلا. ومع ذلك ، يمكن تنفيذ هذه الخطوات مقدما ، أو بأعداد كافية للتحضير لتجارب متعددة في نفس الوقت. يمكن قطع العديد من PCLS (>100 إذا تم تحسينها للمناطق المتني) من رئة واحدة وتجميدها المفاجئة لاستخدامها لاحقا. في حين أن دورة تجميد ذوبان واحدة قد تسبب أضرارا طفيفة فوق الهيكلية ل ECM46 ، فقد ثبت أنه حتى دورات التجميد والذوبان المتعددة لا تسبب خسارة كبيرة في ECM23,47. يمكن أيضا قص PCLS وإزالة خلاياه قبل التجربة ، لاستخدامها في غضون شهر واحد. (والجدير بالذكر أن بروتوكول إزالة الخلايا الموصوف يمكن إنجازه في حوالي 6 ساعات ، مما يمثل ميزة كبيرة على الطرق الموصوفة سابقا والتي تتطلب يوما أو أكثر27,28.) بمجرد إعداد السقالات ، تكون عملية بذر الخلايا بسيطة وسريعة ، ولا تتطلب ثقافة ELTs تقنيات متخصصة.
أحد التحذيرات من طريقة ELT الموصوفة هو عدم وجود بذر خاص بالمنطقة ، أي توصيل AEC2s على وجه التحديد إلى الفضاء السنخي ، أو الخلايا البطانية على وجه التحديد إلى الفضاء الوعائي. ومع ذلك ، على الرغم من أن الخلايا تزرع ببساطة فوق سقالات الأنسجة ، إلا أن نمط إعادة التكاثر غير عشوائي ، مع بعض مظاهر التنظيم الشبيه بالسنخية ، بما في ذلك الحلقات الظهارية. نحن نشك في أن التفاعلات بين الخلايا الخلوية ، وكذلك الاختلافات المحلية في تكوين ECM والهندسة20,21 ، من المحتمل أن تسهم في أنماط إعادة الخلية الملحوظة. ودعما لهذه الفرضية، أظهرت دراسة نشرت سابقا، حيث تم زرع الخلايا الليفية بشكل غير محدد على شرائح الرئة منزوعة الخلايا، أن نمط إعادة توطين الأنسجة والأنماط الظاهرية الخلوية المرتبطة بها يختلف اختلافا كبيرا حسب منطقة الأنسجة المجهرية ومصدر سقالة ECM (على سبيل المثال، صحي مقابل مريض)27. كما لوحظ أن الخلايا الليفية تغزو الخلالي - الموقع الذي تقيم فيه في أنسجة الرئة الأصلية 1,27. الطريقة البديلة الأساسية التي يمكننا تخيلها لزراعة الخلايا على شرائح الرئة بطريقة خاصة بالمنطقة حقا ستستلزم بذر رئتين منزوعة الخلايا سليمة عبر مجرى الهواء31,48 ومقصورات الأوعية الدموية 49,50 ، ثم تقطيع الأنسجة المعاد خلاياها. ومع ذلك، فإن هذا البديل 1) أكثر استهلاكا للتكلفة والوقت والموارد؛ 2) هو انخفاض الإنتاجية؛ 3) يتطلب زيادة أعداد الحيوانات ؛ و 4) يرتبط بزيادة خطر التلوث بسبب تحديات زراعة الرئة بأكملها والتقطيع اللاحق للرئة البذورية. على الرغم من أنها لا تلخص جميع جوانب التنظيم الخلوي الأصلي ، إلا أن منصة ELT تمكن من زراعة خلايا الرئة على ركيزة ECM ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، بطريقة يمكن الوصول إليها من قبل العديد من المختبرات.
تعد مرونة نظام ELT ميزة رئيسية لهذه المنصة ، ويجب أن تسمح بزراعة أنسجة الرئة على نطاق صغير مع أي عدد من سقالات الأنسجة أو الخلايا أو وسائط الثقافة ذات الاهتمام. قد يسمح استخدام السقالات المشتقة من الأنسجة المريضة أو من نماذج الإصابة بدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية أو مصفوفة الخلايا في إعداد ECM27,29,51 المعدل بالمرض. ومع ذلك، لاحظ أن بروتوكول إزالة الخلايا قد يحتاج إلى تكييف لمراعاة الاختلافات في المصفوفة بين الأنواع52. يمكن استخدام استراتيجية البذر الموصوفة لأي نوع من الخلايا ، ويتم تكييف الجدول الزمني للزراعة ليناسب احتياجات الباحث. كنقطة انطلاق ، يجب أن تنتج 1 × 106 خلايا لكل سقالة نسيجا عالي الخلايا في غضون 7 أيام من الزرع ، في حين أن 1 × 105 خلايا إجمالية تؤدي إلى ضعف الخلوية. في أي تكييف للجدول الزمني ، يجب إزالة أشرطة زراعة الأنسجة من حمام البذر 24 ساعة بعد آخر بذر للأنسجة. هنا ، بهدف نمذجة بعض التعقيد الخلوي لأسناخ الرئة ، نصف استراتيجية إعادة توطين ثلاثية الثقافات تدعم الحفاظ على AEC2s حديثي الولادة المتمايزة جيدا في هياكل تشبه السنخية لمدة 7 أيام على الأقل. تظهر نتائجنا أيضا نجاح تطعيم كل من الخلايا الليفية والخلايا البطانية داخل ELTs ، مع التأكيد على التطبيق الواسع للركيزة المستزرعة وملاءمتها لدراسات الزراعة المشتركة. قد يسهل بذر الخلايا البالغة في ELTs نمذجة الهياكل السنخية الأكثر هدوءا ، في حين أن بذر AEC2s البشري المشتق من PSC ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على تعديلات وراثية ، يمكن أن يسهل الدراسات الانتقالية للأمراض البشرية13,53. بشكل عام ، يوفر النهج التصاعدي الذي تتيحه منصة ELT الفرصة للتحقيق في مساهمات أنواع معينة من الخلايا في القراءات ذات الأهمية - مثل انتشار AEC2 أو حالة التمايز.
باختصار ، يحدد هذا البروتوكول نظاما قويا لتوليد أنسجة رئوية هندسية لدراسات الزراعة المشتركة ل AEC2s والخلايا الليفية والخلايا البطانية داخل سقالات شرائح الرئة ECM اللاخلوية. تمثل ELTs استراتيجية جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد ل AEC2s الأولية ، والتي اعتمدت حتى الآن عادة على مصفوفات من نوع هلام أقل فسيولوجية للحفاظ على نمط ظاهري متمايز جيدا 6,11,12. تعتمد المنصة الحالية على العمل السابق في إعادة توطين شرائح الرئة الخالية من الخلايا 24،25،26،27،28،29 ، ولكنها توفر العديد من المزايا: 1) نظام كاسيت زراعة الأنسجة لتسهيل التعامل مع ELT أثناء إزالة الخلايا ، والبذر ، والثقافة. 2) حمام بذر مخصص لزرع عدد معروف من الخلايا بدقة على كل سقالة شريحة ؛ و 3) استراتيجية إعادة البذر الثلاثي التي تمكن من إعادة توطين الأنسجة السنخية مع الخلايا الظهارية والوسيطة والبطانية. وبالتالي ، تمثل ELTs خطوة مهمة إلى الأمام نحو إنشاء نماذج قابلة للتكرار في المختبر تلتقط التعقيد الخلوي والركيزة للحويصلات الهوائية الأصلية ومكانة الخلايا الجذعية AEC2.

الحويصلات الهوائية هي الوحدات الوظيفية للرئة البعيدة ، التي تضم شبكة من المساحات الهوائية المتبادلة للغاز التي تصطف على جانبيها الخلايا الظهارية السنخية من النوع 1 (AEC1s) وخلايا النوع 2 (AEC2s). يوجد وراء الظهارة شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية بالإضافة إلى اللحمة المتوسطة الداعمة ، وكلها مدعومة بسقالة مصفوفة خارج الخلية (ECM) توفر القوة والمرونة لهذه الأكياس الهوائية الحساسة1. الحويصلات الهوائية هي أيضا موقع الإصابة في العديد من أمراض الرئة ، بما في ذلك التليف الرئوي مجهول السبب2 ، ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة3 ، ومرض فيروس كورونا الوخيم-19 (COVID-19)4. على الرغم من أن العمل على مدى العقد الماضي قد كشف عن مرونة ملحوظة داخل ظهارة الرئة ، إلا أن الآليات التي تمكن من إصلاح الرئة البعيدة في بعض البيئات - والتي تمنع الإصلاح في أماكن أخرى - لا تزال مجالا للتحقيق المكثف5. إن تطوير منصات محسنة في المختبر لنمذجة الحويصلات الهوائية من شأنه أن يسهل دراسات البيولوجيا السنخية والتجديد والعلاجات.
AEC2s تجديد ذاتي وتمييز في AEC1s ، وبالتالي تعتبر الخلية الجذعية الأولية للرئة البعيدة6،7،8. ومع ذلك ، تشكل هذه الخلايا تحديا خاصا للدراسة في المختبر نظرا للصعوبات المرتبطة بزراعة AEC2s الأولية دون فقدان النمط الظاهري9. في الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) ، تقوم AEC2s بتسطيح واعتماد بعض ميزات الخلايا الشبيهة ب AEC110. في المقابل ، تدعم استراتيجيات الاستزراع ثلاثي الأبعاد ، وهي الأكثر شيوعا من المواد العضوية ، الحفاظ على الميزات المتباينة في AEC2s الأولية 6,11,12 وتسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) المشتقة من AEC2s13,14. تم استخدام المواد العضوية لنمذجة تطور الرئة البعيدة 15 ، والعدوى الفيروسية11،15 ، والأمراض الوراثية المرتبطة ب AEC213،16،17 ، مما يتيح رؤى مهمة في بيولوجيا AEC2 والتجديد. ومع ذلك ، فإن نماذج الثقافة هذه تتكون عادة من سلالة خلوية واحدة أو اثنتين فقط ، وتقوم بتضمين الخلايا في مصفوفات من نوع الهلام تفشل في تلخيص إما البنية أو الركيزة ECM للحويصلات الهوائية الرئوية الأصلية.
ECM هو منظم حاسم للنمط الظاهري للخلية والسلوك عبر الإشارات الجزيئية والطبولوجية والميكانيكية. يضم مكونا رئيسيا من المنافذ الخاصة بالأنسجة التي تنظم مصير الخلايا الجذعية ؛ ويعمل كخزان يعدل توافر عوامل النمو المفرزة محليا18،19،20،21. وبالتالي ، فإن زراعة الخلايا على ECM الأصلي قد تزيد من القدرة التنبؤية للأنظمة المختبرية لنمذجة بيولوجيا الأنسجة في الجسم الحي. يمكن أن تحافظ إزالة الخلايا ، وهي عملية تزيل المواد الخلوية من الأنسجة عبر المنظفات أو الإنزيمات أو الطرق الفيزيائية أو غيرها ، على سقالات ECM للعضو الأصلي ، عند تنفيذها بعناية22,23. يمكن إعادة توطين هذه السقالات بخلايا لثقافة المحاكاة الحيوية 3D. ومع ذلك ، في حين أن السقالات المنزوعة الخلايا تستخدم على نطاق واسع لتطبيقات هندسة الأنسجة ، إلا أن استخدامها لزراعة الخلايا الروتينية كان محدودا. وقد أبلغت العديد من الدراسات السابقة عن إزالة الخلايا وإعادة التوطين لشرائح الرئة أو أجزاء أنسجة الرئة الصغيرة. بالإضافة إلى دراسات إثبات المفهوم24،25،26 ، تم استخدام شرائح الرئة المعاد تجميعها لدراسة التصاق مصفوفة الخلايا الليفية 27،28 والتحقيق في تأثير مصفوفات الرئة المريضة على النمط الظاهري للخلايا الليفية27،29. مع التقنيات المحسنة المتاحة لتوليد شرائح الأنسجة المقطوعة بدقة ، يمكن أن توفر شرائح الرئة المنزوعة الخلايا منصة مريحة وصغيرة النطاق لزراعة الخلايا ، مع الحفاظ على الهياكل الفرعية السنخية ومجرى الهواء والأوعية الدموية. دمج أنواع متعددة من الخلايا من شأنه أن يمكن من دراسات التفاعلات بين الخلايا والخلايا داخل بيئة 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجيات محسنة لتسهيل التعامل مع الأنسجة طوال عملية الزراعة ، وضمان البذر المتحكم فيه والقابل للتكرار للأنسجة ذات الأعداد المعروفة من الخلايا.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد أنسجة الرئة الهندسية (ELTs) عن طريق إعادة ملء شرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) مع الخلايا البطانية الأولية ، AEC2s ، والخلايا الليفية. في تكييف لنظام أنسجة القلب الهندسيالموصوف سابقا 30 واستراتيجيات إزالة الخلايا وإعادة الخلية الكاملة للرئة 22,31 ، نصف إجراءات لقطع PCLS من رئتي الفئران وقص الشرائح إلى أشرطة زراعة الأنسجة القابلة لإعادة الاستخدام التي تبسط وتوحد التلاعب في المصب. يتم إزالة الشرائح المقطوعة لتشكيل سقالات ECM غير الخلوية ، والتي يتم إعادة تعبئتها في حمامات البذر المخصصة. تحافظ سقالات شرائح الرئة على مكونات وبنية ECM المهمة ، وتدعم نمو AEC2s داخل هياكل تشبه السنخية متعددة السلالات لمدة 7 أيام على الأقل. تمثل ELTs نظاما جديدا للزراعة المشتركة السنخية ضمن مصفوفة ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، والتي يجب أن تدعم تطوير استراتيجيات هندسة أنسجة الرئة ، مع تسهيل الدراسات البيولوجية الأساسية ل AEC2s والأسناخ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

هناك حاجة إلى تحسين نماذج الرئة ثلاثية الأبعاد (3D) التي تلخص التعقيد المعماري والخلوي للحويصلات الهوائية الرئوية الأصلية خارج الجسم الحي. سهلت النماذج العضوية التي تم تطويرها مؤخرا توسيع ودراسة السلف الظهاري الرئوي في المختبر ، ولكن هذه المنصات تعتمد عادة على مصفوفة و / أو مصل مشتق من ورم الفئران ، وتتضمن سلالة خلوية واحدة أو اثنتين فقط. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد أنسجة الرئة الهندسية (ELTs) استنادا إلى إعادة التجميع متعدد السلالات لشرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS). تحتوي ELTs على هياكل تشبه السنخية تضم ظهارة سنخية ، ولحمة متوسطة ، وبطانة ، داخل ركيزة مصفوفة خارج الخلية (ECM) تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الرئة الأصلية. لتوليد الأنسجة ، يتم تضخيم رئتي الفئران باستخدام الأغاروز ، وتقطيعها إلى شرائح بسماكة 450 ميكرومتر ، وتقطيعها إلى شرائح ، وإزالة خلاياها. ثم يتم إعادة زرع سقالات ECM اللاخلوية الناتجة بالخلايا البطانية الأولية والخلايا الليفية والخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AEC2s). يمكن الحفاظ على AEC2s في ثقافة ELT لمدة 7 أيام على الأقل باستخدام وسط نمو خال من المصل ومحدد كيميائيا. طوال عملية تحضير الأنسجة وزراعتها ، يتم قص الشرائح في نظام كاسيت يسهل التعامل مع العديد من ELTs وبذرها بشكل موحد بالتوازي. تمثل ELTs هذه منصة استزراع عضوي من شأنها تسهيل التحقيقات في تفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا داخل الأسناخ بالإضافة إلى الإشارات الكيميائية الحيوية التي تنظم AEC2s ومكانتها.

ويرد في الشكل 3 لمحة عامة عن عملية توليد ELTs - التي تشمل تقطيع الرئة، وقطع الشرائح وإزالة الخلايا، وإعادة توطين السقالات. تم استزراع ELTs المعروضة هنا باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية لرئة الفئران (انظر جدول المواد) ، والفئران الوليدية AEC2s ، والخلايا الليفية الرئوية للفئران حديثي الولادة الغنية بالخلايا الليفية للفئران الوليدية36. تم عزل AEC2s حديثا عن طريق الفرز المغناطيسي القائم على الخرز كما هو موضح سابقا37 ؛ تم تفصيل بروتوكولات العزل البديلة ومناقشتها في أماكن أخرى38،39،40. يمكن تقييم نقاء الفئران المعزولة AEC2s عن طريق قياس التدفق الخلوي لعلامة سطح AEC2 الخاصة بالفئران RTII-7041 ، أو عن طريق تلطيخ عينة خلية الطرد المركزي الخلوي ل RTII-70 أو البروتين المؤيد للفاعل بالسطح C (pSPC). تم عزل الخلايا الليفية لرئة الفئران من جراء الفئران بعد يوم ما بعد الولادة 7-9 وفقا لتكييف بروتوكولمنشور 42 واستخدامها في الممر 1-2 ؛ تم وصف بروتوكولات العزل البديلة في مكان آخر43,44. يمكن تقييم نقاء الخلايا الليفية المعزولة عن طريق تلطيخ الخلايا المستزرعة أو الطرد المركزي الخلوي لفيمنتين علامة اللحمة المتوسطة ، ويمكن تقييم إثراء lipofibroblast عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر O45.
عندما يتم تضخيم أنسجة الرئة بشكل موحد باستخدام الأغاروز ، ويتم اختيار قطع الأنسجة بشكل استراتيجي وتوجيهها للتقطيع إلى شرائح لزيادة مساحة الأنسجة الكلية والمتنية إلى أقصى حد ، قد تنتج رئة فئران واحدة أنسجة ل >100 ELTs السنخية. تظهر شرائط PCLS سلامة ميكانيكية كافية ليتم قصها في أشرطة الأنسجة مع عدد قليل (<5٪) من حالات التمزق (الشكل 3B).
يعتمد بروتوكول إزالة الخلايا من شرائح الرئة بشكل وثيق على بروتوكول إزالة الخلايا الرئوية الكامل المنشور سابقا ، والذي ثبت من خلال البروتينات الكمية أنه يحافظ على العديد من مكونات ECM بمستويات لا تختلف اختلافا كبيرا عن تلك الموجودة في الرئة الأصلية22. تحافظ سقالات الشرائح منزوعة الخلايا على البنية الأصلية للحويصلات الهوائية ، كما هو موضح في تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) (الشكل 4A ، B) والمجهر المتباين المرحلي (الشكل 4C). عادة ما نستبعد السقالات التي تحتوي على ممرات هوائية أو أوعية كبيرة (الشكل 4D) أو الدموع ، على الرغم من أنه يمكن تضمين الأولى إذا كانت ذات أهمية للباحث. تؤدي إزالة الخلايا إلى انخفاض بنسبة 96٪ في محتوى الحمض النووي للأنسجة كما تم قياسه من خلال فحص الحمض النووي المزدوج (انظر جدول المواد ؛ 0.50 ميكروغرام / ملغ ± 0.073 ميكروغرام / ملغ مقابل 0.018 ميكروغرام / ملغ ± 0.0035 ميكروغرام / ملغ في الأنسجة الأصلية مقابل الأنسجة الخلوية ، على التوالي ، يعني ± SEM) (الشكل 5A) ، مع عدم وجود حمض نووي مرئي بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين (الشكل 4B). يكشف التلطيخ النسيجي والفلورسنت المناعي للسقالات منزوعة الخلايا عن الحفاظ على بروتينات ECM الكولاجين والإيلاستين والكولاجين الرابع واللامينين مع بنية وكمية مماثلة لتلك الموجودة في شرائح الرئة الأصلية (الشكل 5B-E). لاحظ أن نوى الأنسجة الأصلية تلطخ باللون الأزرق / الأسود مع بقع trichome (للكولاجين) و EVG (للإيلاستين). تم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي كما هو موضح سابقا ، باستخدام الطرق القياسية لتلطيخ الأنسجة37. وترد في الجدول 4 الأجسام المضادة المستخدمة وتركيزات كل منها.
تؤدي إعادة توطين السقالة الناجحة إلى ELTs عالية الخلوية بعد 7 أيام ، مع نمط إعادة توطين يشبه السنخية مرئي بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 6A-C). في بعض الحالات ، مع خلوية عالية جدا ، قد تكون الهياكل العضوية مرئية (الشكل 6A ، B). يمكن تصور بذر الأنسجة غير الناجح بواسطة الفحص المجهري لتباين الطور أثناء الزراعة (الشكل 6C). بعد زراعة سقالات الأنسجة باستخدام AEC2s والخلايا الليفية والخلايا البطانية ، يتم إعادة توطين ELTs بكثافة بهياكل تشبه السنخية تضم جميع سلالات الخلايا الثلاثة (الشكل 6D ، E). في اليوم 7 أو 8 ، تحافظ AEC2s على التشكل التكعيبي وتعبر عن بروتين الفاعل بالسطح B (SPB) وبروتين الجسم الرقائقي ABCA3 ، دون دليل على وجود تمايز كبير مع AEC1s (الشكل 6E ، F). AEC2s هي عالية الانتشار في ELTs ، كما هو موضح في دمج 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) بعد نبضة 2 ساعة عند 10 ميكرومتر (الشكل 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط نظام التروية لاستخراج الرئة وتطهيرها. (أ) يتألف نظام التروية من طرف يحركه الجاذبية، يستخدم للتقنين الأولي للشريان الرئوي تحت التدفق؛ (ب) يتألف نظام التروية من طرف يحركه الجاذبية، يستخدم للتقنين الأولي للشريان الرئوي تحت التدفق؛ (ب) يتألف نظام التروية من طرف يحركه الجاذبية، يستخدم للتعليب الأولي للشريان الرئوي تحت التدفق؛ (ب) يتألف نظام التروية من طرف يحركه الجاذبية، يستخدم للتعليب الأولي للشريان الرئوي تحت التدفق؛ (ب) يتألف نظام التروية من طرف يحركه الجاذبية، يستخدم للتعليب الأولي للشر وطرف يحركه المضخة، يستخدم لتنظيف الرئتين بكفاءة بعد القنية الأولية. يتضمن خط المضخة "مثبط النبض" الذي يخفف من ارتفاع الضغط الناجم عن المضخة. تصميم القنية الشريانية القصبية والرئوية مفصل على اليسار. SNP = نيتروبروسيد الصوديوم. (ب) تفاصيل تجميع مثبط النبض. يشير BPT والسيليكون إلى أنواع الأنابيب. (ج) مواضع القنية الشريانية القصبية والرئوية الموضوعة أثناء استخراج الرئة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> الشكل 2: الجدول الزمني للثقافة لإعادة النسب الثلاثي. الجدول الزمني المقترح لبذر ELT ثلاثي السلالات واستزراعه ، بما في ذلك توقيت البذر على مرحلتين. يشار إلى أعداد الخلايا للبذر ووسط الاستزراع لكل مرحلة. انظر تفاصيل وسائط الثقافة في الجدول 3. AEC2 = خلية ظهارية من النوع 2 السنخية. EC = الخلية البطانية. FB = الخلايا الليفية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> الشكل 3: مخطط لإعداد أنسجة الرئة الهندسية. (أ) يتم قطع أنسجة الرئة الأصلية إلى شرائح باستخدام اهتزاز. (ب) تقطع شرائح الرئة المقطوعة بدقة إلى شرائح موحدة بعرض 3 مم، وتقطع إلى أشرطة استزراع الأنسجة المتعددة تترافلوريثلين (PTFE)، وتزيل الخلايا بالمنظفات لإنتاج سقالات مصفوفة خارج الخلية اللاخلوية. (ج) يتم إعادة زرع السقالات في حمامات البذر المتخصصة التي تحصر منطقة البذر في منطقة الأنسجة ، ثم يتم استزراعها في صفيحة بئر قياسية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> الشكل 4: هيكل سقالات الرئة المنزوعة الخلايا. تلطيخ H & E لشرائح الرئة الأصلية (A) و decellularized (B) التي تظهر الحفاظ على العمارة السنخية بعد إزالة الخلايا. (ج، د) أمثلة على سقالات ECM منزوعة الخلايا ينظر إليها عند التكبير 5x بواسطة المجهر المتباين الطوري ، الذي يتكون في الغالب من الأنسجة السنخية (C) أو يحتوي على ممرات هوائية وأوعية متفرعة كبيرة (D ورؤوس أسهم سوداء وحمراء). أشرطة المقياس ، 50 ميكرومتر (A ، B) ؛ 500 ميكرومتر (C ، D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> الشكل 5: إزالة الحمض النووي وحفظ المصفوفة في سقالات الرئة منزوعة الخلايا. (أ) تحديد كمية الحمض النووي في شرائح الرئة الأصلية وغير الخلوية (متوسط ± SEM ، n = 5). اختبار ويلش t ، ** P < 0.01. Decell = decellularized. (ب، ج) تلطيخ نسيجي لشرائح الرئة الأصلية والخلوية للكولاجين (B) والإيلاستين (C). رؤوس السهام ، الإيلاستين المحفوظ في حلقات المدخل السنخي للأنسجة غير الخلوية. (دال، هاء) تلطيخ الفلورسنت المناعي لشرائح الرئة الأصلية والخلوية للكولاجين IV (D) و laminin (E). أشرطة المقياس ، 50 ميكرومتر. في كل اللوحات، تحدد المربعات المنقطة منطقة الصورة التي يتم تكبيرها إلى اليمين في كل لوحة على حدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> الشكل 6: إعادة التوطين الخلوي لأنسجة الرئة الهندسية. (أ-ج) أمثلة على ELTs المعاد خلاياها في اليوم 7 من الثقافة ، كما تم تصورها أثناء الزراعة بواسطة الفحص المجهري المتباين المرحلي. يعكس نمط إعادة الخلية البنية السنخية للأنسجة. في بعض المناطق ذات الخلوية العالية ، قد تتشكل هياكل تشبه العضوية (رؤوس أسهم). (أ) و (ب) يمثلان إعادة توطين الخلايا بنجاح ، في حين أن (ج) يمثل مستوى ضعيفا من إعادة التجميع بعد 7 أيام من الزرع. (D-G) تلطيخ ELTs المعاد خلاياها في اليوم 7 أو 8 من الثقافة. (د) تلطيخ H&E يظهر إعادة التوطين الخلوي للحاجز السنخي. (ه) ملصقات تلطيخ الفلورسنت المناعي المغطاة بالخلايا الليفية proCollagenIα1+ و ABCA3 + AEC2s و CD31+ الخلايا البطانية. (و) تحتوي الأنسجة على SPB + AEC2s وفيرة ولكن عدد قليل من RTI-40 (podoplanin) + AEC1s في ظل هذه الظروف. (ز) العديد من AEC2s تنتشر في ELTs ، كما تم قياسها من خلال دمج EdU. أشرطة المقياس ، 500 ميكرومتر (A-C) ؛ 25 ميكرومتر (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: حلول إزالة الخلايا. تفاصيل التحضير لحلول إزالة الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: بروتوكول إزالة الخلايا. تفاصيل بروتوكول إزالة شرائح الرئة من الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: الإعلام الثقافي. تفاصيل التحضير لوسائط النمو البطانية و AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 4: الأجسام المضادة المستخدمة للتلطيخ المناعي. تفاصيل الأجسام المضادة وتركيزاتها المستخدمة للتلطيخ المناعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الملف التكميلي 1: تصميم لقطع الأنسجة بالليزر زرع إطارات كاسيت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: تصميم لقطع الأنسجة بالليزر زرع مقاطع كاسيت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: تصميم لقطع الأنسجة بالليزر زراعة أشرطة التبويب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 4: ملف CAD لبذر قاعدة قالب الحمام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 5: ملف CAD لحلقة قالب حمام البذر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد أنسجة رئوية هندسية قابلة للتكرار على نطاق صغير، عن طريق إعادة ملء شرائح الرئة الدقيقة المقطوعة بدقة مع الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية.

أنسجة رئوية هندسية محضرة من شرائح رئوية منزوعة الخلايا

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

يتيح هذا البروتوكول الاستخدام المتكرر لمصفوفة الرئة السليمة خارج الخلية كركيزة ثلاثية الأبعاد لزراعة الأنسجة وإنتاجية معتدلة. الميزة الرئيسية لنظام أنسجة الرئة الهندسي هي مرونة المنصة. يمكن تكييف ELTs لاستخدام مختلف سقالات الأنسجة أو الخلايا أو وسائط الثقافة ذات الاهتمام.بمجرد استخراج الرئتين ، املأ حقنة 10 ملليلتر بالأغاروز و HBSS بدون أحمر الفينول. قم بتضخيم الرئتين بحوالي 10 ملليلتر من الهواء عبر قنية القصبة الهوائية ، ثم حقن الأغاروز المحضر على الفور عبر قنية القصبة الهوائية حتى يتم تضخيم الأطراف البعيدة لفصوص الرئة. قم بتغطية القصبة الهوائية عن طريق إرفاق الغطاء الأبيض من ستوبكوك رباعي الاتجاهات إلى قفل اللوير الأنثوي لقنية القصبة الهوائية.ضع الرئة في طبق بتري بقطر 150 ملم على الجليد للسماح للأغاروز بالتصلب. قم بإعداد شرائح الرئة وفقا للبروتوكول الموجود في المخطوطة ، ثم املأ طبق بتري 100 ملم بحجم 1/3 من PBS. انقل الكاسيت وعلامات التبويب إلى الطبق باستخدام الملقط.إذا تم تجميد الشرائح ، فقم بإذابة طبق واحد في كل مرة عن طريق سكبها على PBS في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل شريحة مذابة إلى طبق بتري بسعة 150 ملم. افتح الشريحة بلطف باستخدام ملقط ناعم أو مرقئ واستنشق PBS الزائد بعناية من جميع أنحاء الأنسجة.ثم ، قم بقطع شريط بعرض ثلاثة ملليمترات ، بطول تسعة ملليمترات على الأقل من الشريحة عن طريق الضغط على الطول الكامل لشفرة الحلاقة بقوة على الطبق وهزه قليلا من جانب إلى آخر. لقص شريط الأنسجة في الكاسيت ، قم بتعويمه فوق الكاسيت ، مع توسيطه بعناية ليمتد إلى ما وراء الثقوب الموجودة في المشابك في كلا الطرفين. ضع علامة تبويب جزئيا في الحفرة في أحد طرفيها باستخدام ملقط ناعم ، وقم بتصويب الأنسجة بلطف ، واضبط علامة التبويب الثانية.أخيرا ، استخدم الملقط للضغط على كل علامة تبويب بالكامل لتأمين الأنسجة. بعد قص جميع الجوانب ، انقل الطبق الذي يبلغ طوله 100 ملم والذي يحتوي على أشرطة الكاسيت إلى غطاء تدفق صفائحي. انقل الكاسيت إلى ألواح من ستة آبار تحتوي على أول حل لإزالة الخلايا باستخدام مرقئ منحني للإمساك بالجوانب المحززة.ثم ضع الصفيحة المكونة من ستة آبار على شاكر مداري عند 30 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. استنشق السائل من كل بئر ، ثم استبدله بثلاثة ملليلترات من محلول إزالة الخلايا الثاني لكل بئر. ضع الصفيحة على شاكر مداري عند 30 دورة في الدقيقة واحتضنها لمدة خمس دقائق.كرر هذه العملية مع كل حل كما هو موضح في بروتوكول إزالة الخلايا في المخطوطة. بعد الشطف النهائي باستخدام PBS ، قم بنقل الأنسجة إلى ألواح معقمة من ستة آبار تحتوي على PBS طازج مع المضادات الحيوية ومضادات الفطريات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد التعقيم بالمضادات الحيوية ومضادات الفطريات ، يمكن زرع سقالات أنسجة الرئة على الفور أو تخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما.قبل استخدامها للزراعة ، احتضن السقالات المخزنة عند أربع درجات مئوية مع PBS الطازجة والمضادات الحيوية ومضادات الفطريات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية كخطوة تعقيم إضافية. ثم ، شطف السقالات مع PBS معقمة ، خمسة ملليلتر لكل بئر ، ثلاث مرات ، لمدة خمس دقائق لكل منهما. افحص السقالات تحت مجهر تباين الطور عند تكبير 5X لاختيار الأنسجة للبذر.تحضير تعليق الخلايا البطانية في الوسط البطاني عند 5 ملايين خلية لكل ملليلتر مع خلايا كافية لزرع 500،000 خلية بطانية لكل شريحة. ضع حمامات البذر المعقمة في أطباق بتري 100 ملم وانقل سقالات الشطف بعناية رأسا على عقب إلى حمامات البذر. قم بتدوير تعليق الخلية المحضر بلطف للخلط.ثم ، ماصة بعناية 100 ميكرولتر من الخلايا مباشرة فوق كل نسيج في قاعدة الآبار ، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة بطرف الماصة. نقل الأنسجة البذرية إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا البطانية ، أضف 900 ميكرولتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى كل بئر باستخدام ماصة يدوية ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة.بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، قم بإزالة الوسط واستبدل ملليلتر واحد من الوسط البطاني الطازج لكل بئر. بعد 72 ساعة من بذر الخلايا البطانية ، عد AEC2s ، أو الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني ، والخلايا الليفية باستخدام مقياس الدم وإعداد تعليق خلية 1: 1 في وسط نمو AEC2 عند 5 ملايين خلية لكل ملليلتر. ماصة الوسط من كل حمام البذر جيدا وتدور بلطف تعليق الخلية المعدة.ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا مباشرة فوق كل نسيج في قاعدة البئر. نقل الأنسجة البذرية إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد ساعتين ، أضف 900 ميكرولتر من وسط نمو AEC2 المسخن مسبقا إلى كل بئر ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة.بعد 24 ساعة من الزراعة باستخدام AEC2s والخلايا الليفية ، قم بإعداد صفيحة من 12 بئرا مع ملليلتر واحد من متوسط نمو AEC2 المسخن مسبقا لكل بئر ، لكل كاسيت. ماصة 800 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من حمام البذر ، ثم قم بإزالة الكاسيت من حمام البذر ونقلها إلى الجانب الأيمن إلى اللوحة المعدة المكونة من 12 بئرا ، كاسيت واحد لكل بئر. قم بتغيير وسط الثقافة بعناية باستخدام ماصة باستور الزجاجية كل يومين لمدة الثقافة المطلوبة.راقب درجة إعادة توطين الأنسجة عبر الفحص المجهري لتباين الطور عند تكبير 5X طوال مدة الزرع. أظهر تلطيخ H و E لسقالات الأنسجة بنية سنخية محفوظة بعد إزالة الخلايا مع عدم وجود نوى خلية مرئية. لوحظت الأنسجة السنخية عندما شوهدت سقالات المصفوفة خارج الخلية المنزوعة الخلايا عند تكبير 5X بواسطة الفحص المجهري لتباين الطور.كانت الممرات الهوائية والسفن المتفرعة الكبيرة مرئية أيضا في بعض الشرائح. في اليوم السابع من الثقافة، أظهر الفحص المجهري لتباين المرحلة أن نمط إعادة التوطين في أنسجة الرئة المهندسة يحاكي البنية السنخية للأنسجة في حالات إعادة التوطين الناجحة. وكان ضعف إعادة التجميع واضحا أيضا.أظهر تلطيخ H و E في اليوم السابع أو الثامن إعادة توطين الحاجز السنخي. كشفت مكانة التألق المناعي عن الخلايا الليفية الإيجابية من النوع الأول من الكولاجين ألفا 1 ، و AEC2s الإيجابية ABCA3 ، والخلايا البطانية الإيجابية CD31 ، و AEC2s الإيجابية SPB الوفيرة. علاوة على ذلك ، أظهر فحص الثيميدين العديد من AEC2s المنتشرة.وقد سهلت هذه التقنية تطوير استراتيجيات لهندسة أنسجة الرئة ومكنت من إجراء تحقيقات في قوائم الانتظار التي تدعم تكاثر الخلايا من النوع الثاني والتمايز داخل الأسناخ.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

والأنسجة المشتركة 3D هندسيا<em&gt; في المختبر</em&gt; /<em&gt; في السيليكو</em&gt; الرئة نموذج الورم للتنبؤ فعالية الدواء في خلفيات الطفرات محددة

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

جيل من خلايا الفأر مجرى الهواء طلائي المشتقة ESC عن طريق Decellularized الرئة السقالات

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

إعداد الأنسجة القلبية المهندسة على شكل شبكة مشتقة من خلايا iPS البشرية لإصلاح عضلة القلب في فيفو

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

اختبار الأدوية قبل السريرية في أنسجة العضلات المهندسة 3D القابلة للتطوير

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

تشريح وعزل أنسجة الرئة المنزوعة الخلايا الخاصة بالمنطقة

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...