Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Lorenzo Sewanan og Jorge Nunez for deres arbejde med at udvikle vævskulturkassettedesignet, der anvendes i denne protokol, Kaminski-laboratoriet til brug af deres vibratom, Maurizio Chioccioli og Jessica Nouws for hjælp med lungeskæring, Allie LaRocco for hjælp med indledende pilotforsøg og Hong Qian for omhyggelig læsning af protokollen. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) og U01HL145567 (L.E.N.); og ved en ubegrænset forskningsgave fra Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. er grundlægger og aktionær i Humacyte, Inc, som er en regenerativ medicinvirksomhed. Humacyte producerer konstruerede blodkar fra allogene glatte muskelceller til vaskulær kirurgi. L.E.N.'s ægtefælle har egenkapital i Humacyte, og L.E.N. sidder i Humacytes bestyrelse. L.E.N. er opfinder af patenter, der er licenseret til Humacyte, og som producerer royalties for L.E.N. L.E.N. har modtaget en ubegrænset forskningsgave til støtte for forskning i sit laboratorium på Yale. Humacyte påvirkede ikke adfærden, beskrivelsen eller fortolkningen af resultaterne i denne rapport.

Dette papir beskriver brugen af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver som en platform til at generere manipulerede lungevæv in vitro, som indeholder multi-lineage alveolære strukturer. Ved at kombinere strategier, som vi tidligere har udviklet til at genbefolke acellulære ECM-lungestilladser med høj nøjagtighed til hele lungeteknik22,31, med vores robuste system til dyrkning af småskala manipulerede hjertevæv30, muliggør denne protokol brugen af fysiologisk relevant lunge-ECM som et vævskultursubstrat på en repeterbar og moderat gennemstrømningsmåde.
De metoder, der præsenteres her, beskriver ELT-stilladsforberedelse fra rottelunger, som er let opnåelige, kan ekstraheres en bloc med direkte adgang til intakte luftveje for agaroseinflation og er af større størrelse end muselunge. Imidlertid kan lungevæv, der kan oppustes med agarose og udbytteskiver på mindst 9 mm i længden, anvendes inden for dette system. Uanset vævskilde er ensartet inflation af lungevævet med agarose det mest kritiske trin for at sikre succes med nedstrøms vævsskæring, klipning og vævshåndtering. Underinflateret lungevæv har tendens til ikke at skære rent, mens overinflateret væv kan rive under klipning. Efter agarosegelering er passende oppustede vævsområder faste, men giver lidt give, når de forsigtigt presses med tang. For intakte rottelunger fandt vi, at præ-oppustning af de ekstraherede lunger med luft flere gange efterfulgt af agaroseinflation så hurtigt som muligt efter ekstraktion resulterer i de bedste udskæringsresultater og den bedste kvalitet af resulterende vævsstilladser. Det passende volumen agarose skal optimeres empirisk; for en rottelunge er det volumen, der kræves for at puste lungen op til den samlede lungekapacitet, ca. 30 ml/kg dyremasse (f.eks. 10,5 ml agarose til lunger fra en 350 g rotte). For større resekteret lungevæv med mindre ligetil luftvejsadgang (såsom dem fra humane donorer) kan det være nødvendigt med yderligere fejlfinding for at puste vævet op via en bronchus32. Under efterfølgende lungeskæring er udvælgelsen og orienteringen af vævet på stemplet et andet vigtigt skridt til 1) sikre, at skiverne er store nok til at generere vævsstrimler, der kan klippes i vævskulturkassetter og 2) maksimere parenkymalt (alveolær) vævsområde, undtagen store luftveje eller kar.
Klipning af PCLS i vævskulturkassetter kan være et udfordrende trin i starten, men kassetterne forenkler i høj grad vævshåndtering under decellularisering og såning. To potentielle problemer, der kan opstå, er vævsrivning (enten under klipningsprocessen eller under decellularisering) eller vævspositionering i klippene, der resulterer i dårlig nedstrøms såning (f.eks. Ingen såning eller såning lige i enderne). Rivning kan være resultatet af overinflation af agarose, overstrækning af vævet under indsættelse af faner eller efterlader for lidt udhæng til at give tilstrækkeligt vævsgreb, når tapperne indsættes. Bemærk, at skiver, der rives i den ene klipende, kan podes med succes, men de er vanskelige at visualisere under mikroskopet under kultur, da vævet ikke er fladt. Dårlig vævssåning (som den i figur 6C) er sandsynligvis resultatet af, at skiven ikke ligger fladt mellem de to klip og dermed får dårlig kontakt med bunden af såbadet godt, når den vendes på hovedet. En anden mulig årsag er forkert placering af kassetten i bunden af såbadbrønden. Med hensyn til klipning skal du anvende lidt mere spænding i vævet, når du placerer det andet klip for at hjælpe det med at ligge fladt. Nogle skiver har en lille konkavitet; i disse tilfælde klips skiven med den konvekse side opad. Med øvelse oplever vi typisk mislykket såning med færre end 2% skiver.
En begrænsning af denne protokol er kravet om noget specialudstyr - en laserskærer og en 3D-printer - for at generere de indledende materialer til ELT-forberedelse. Men når vævskulturkassetterne og frøbadene er oprettet, kræves der ingen yderligere specielle materialer. Lungeskærings- og decellulariseringstrinnene i ELT-stilladsforberedelse er moderat tidskrævende; Disse trin kan dog udføres på forhånd eller i et antal, der er tilstrækkeligt til at forberede flere forsøg på samme tid. Mange PCLS (>100 hvis optimering til parenkymale regioner) kan skæres fra en enkelt lunge og snap-frosne til senere brug. Mens en enkelt fryse-optøningscyklus kan forårsage mindre ultrastrukturel skade på ECM46, har selv flere fryse-optøningscyklusser vist sig ikke at forårsage et betydeligt tab i ECM23,47. PCLS kan også klippes og decellulariseres forud for et forsøg, der skal bruges inden for en måned. (Især kan den beskrevne decellulariseringsprotokol opnås på cirka 6 timer, hvilket repræsenterer en betydelig fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder, der kræver en dag eller mere27,28.) Når stilladserne er forberedt, er cellesåningsprocessen enkel og hurtig, og kulturen af ELT'er kræver ikke specialiserede teknikker.
En advarsel ved den beskrevne ELT-metode er manglen på regionsspecifik såning, dvs. levering af AEC2'er specifikt til det alveolære rum eller endotelceller specifikt til det vaskulære rum. Ikke desto mindre, selvom celler simpelthen er podet oven på vævsstilladserne, er recellulariseringsmønsteret ikke tilfældigt, med en vis form for alveolær organisation, herunder epitelringe. Vi formoder, at celle-celle-interaktioner samt lokale forskelle i ECM-sammensætning og geometri 20,21 sandsynligvis bidrager til de observerede recellulariseringsmønstre. Til støtte for denne hypotese viste en tidligere offentliggjort undersøgelse, hvor fibroblaster blev podet ikke-specifikt på decellulariserede lungeskiver, at mønsteret af vævsrepopulation og tilknyttede cellulære fænotyper varierede signifikant efter mikroskopisk vævsregion og ECM-stilladskilde (f.eks. Sund versus syg)27. Fibroblaster blev også observeret at invadere ind i interstitium - det sted, hvor de bor i naturligt lungevæv 1,27. Den primære alternative metode, som vi kan forestille os at dyrke celler på lungeskiver på en virkelig regionsspecifik måde, ville indebære såning af intakte decellulariserede lunger via luftvejene 31,48 og vaskulære rum49,50 og derefter udskæring af det recellulariserede væv. Dette alternativ 1) er imidlertid betydeligt mere omkostnings-, tids- og ressourcekrævende; 2) er lavere gennemstrømning; 3) kræver et øget antal dyr og 4) er forbundet med en øget risiko for kontaminering på grund af udfordringerne ved hele lungekulturen og efterfølgende udskæring af den podede lunge. Selvom elt-platformen ikke rekapitulerer alle aspekter af native cellulær organisation, muliggør den lungecellekultur på et fysiologisk relevant ECM-substrat på en måde, der er tilgængelig for mange flere laboratorier.
Fleksibiliteten i ELT-systemet er en stor fordel ved denne platform og bør tillade mindre lungevævskultur med et hvilket som helst antal vævsstilladser, celler eller kulturmedier af interesse. Anvendelse af stilladser afledt af sygt væv eller fra skademodeller kan gøre det muligt at undersøge celle-celle- eller cellematrixinteraktioner i forbindelse med sygdomsændret ECM 27,29,51. Bemærk dog, at decellulariseringsprotokollen muligvis skal tilpasses for at tage højde for matrixforskelle mellem art52. Den beskrevne såningsstrategi kan bruges til enhver celletype, og kulturtidslinjen tilpasses forskerens behov. Som udgangspunkt skulle 1 x 106 celler pr. stillads give et stærkt cellulært væv inden for 7 dages dyrkning, mens 1 x 105 celler i alt resulterer i dårlig cellularitet. Ved enhver tilpasning af tidslinjen skal vævskulturkassetterne fjernes fra såbadet 24 timer efter den sidste vævssåning. Her, med det formål at modellere noget af den cellulære kompleksitet af lungealveolus, beskriver vi en tri-kultur recellulariseringsstrategi, der understøtter vedligeholdelsen af veldifferentierede neonatale AEC2'er i alveolære strukturer i mindst 7 dage. Vores resultater viser også den vellykkede indpodning af både fibroblaster og endotelceller inden for ELT'er, hvilket understreger den brede anvendelighed af kultursubstratet og dets egnethed til co-kulturstudier. Såning af voksne celler i ELT'er kan lette modelleringen af mere hvilende alveolære strukturer, mens såning af humane PSC-afledte AEC2'er, herunder dem med genetiske modifikationer, kan lette translationelle undersøgelser af human sygdom13,53. Generelt giver bottom-up-tilgangen, der muliggøres af ELT-platformen, mulighed for at undersøge bestemte celletypers bidrag til aflæsninger af interesse - såsom AEC2-spredning eller differentieringstilstand.
Sammenfattende skitserer denne protokol et robust system til generering af konstrueret lungevæv til samkulturstudier af AEC2'er, fibroblaster og endotelceller i acellulære ECM-lungeskivestilladser. ELT'er repræsenterer en ny 3D-kulturstrategi for primære AEC2'er, som til dato typisk har været afhængige af mindre fysiologiske gel-type matricer for at opretholde en veldifferentieret fænotype 6,11,12. Den nuværende platform bygger på tidligere arbejde i genpopulationen af decellulariserede lungeskiver 24,25,26,27,28,29, men tilbyder flere fordele: 1) et vævskulturkassettesystem for at lette ELT-håndtering under decellularisering, såning og kultur; 2) et tilpasset såbad til præcist at så et kendt antal celler på hvert skivestillads; og 3) en tri-kultur reseeding strategi, der muliggør alveolær væv repopulation med epitel-, mesenkymale og endotelceller. ELT'er repræsenterer således et vigtigt skridt fremad i retning af at skabe reproducerbare in vitro-modeller, der fanger den cellulære og substratkompleksitet af den oprindelige alveolus og AEC2-stamcelleniche.

Alveoler er de funktionelle enheder i den distale lunge, der omfatter et net af gasudvekslingsluftrum foret med alveolære epitelceller af type 1 (AEC1'er) og type 2-celler (AEC2'er). Bag epitelet er et tæt netværk af kapillærer samt understøttende mesenchym, alt understøttet af et ekstracellulært matrix (ECM) stillads, der giver både styrke og fleksibilitet til disse sarte luftsække1. Alveolerne er også skadestedet i adskillige lungepatologier, herunder idiopatisk lungefibrose2, akut respiratorisk nødsyndrom3 og alvorlig coronavirus sygdom-19 (COVID-19)4. Selvom arbejdet i løbet af det sidste årti har afdækket en bemærkelsesværdig plasticitet inden for lungeepitelet, forbliver de mekanismer, der muliggør distal lungereparation i nogle indstillinger - og som udelukker reparation i andre - et område med intens undersøgelse5. Udviklingen af forbedrede in vitro-platforme til modellering af alveolus ville lette studier af alveolær biologi, regenerering og terapi.
AEC2'er fornyer og differentierer sig til AEC1'er og betragtes således som den primære stamcelle i den distale lunge 6,7,8. Disse celler udgør imidlertid en særlig udfordring for in vitro-studier i betragtning af de vanskeligheder, der er forbundet med dyrkning af primære AEC2'er uden tab af fænotype9. I konventionel 2-dimensionel (2D) kultur flader AEC2'er ud og vedtager nogle funktioner i AEC1-lignende celler10. I modsætning hertil understøtter 3D-kulturstrategier, oftest organoider, opretholdelsen af differentierede træk i primære AEC2s 6,11,12 og tillader langvarig dyrkning af pluripotente stamceller (PSC)-afledtE AEC2s13,14. Organoider er blevet brugt til at modellere distal lungeudvikling15, virusinfektion11,15 og AEC2-relateret genetisk sygdom 13,16,17, hvilket muliggør vigtig indsigt i AEC2-biologi og regenerering. Imidlertid omfatter disse kulturmodeller typisk kun en eller to cellulære afstamninger og indlejrer cellerne i gel-type matricer, der ikke rekapitulerer enten arkitekturen eller ECM-substratet for den indfødte lungealveolus.
ECM er en kritisk regulator af cellefænotype og adfærd via molekylære, topologiske og mekaniske signaler; omfatter en nøglekomponent i vævsspecifikke nicher, der regulerer stamcelleskæbne og fungerer som et reservoir, der modulerer tilgængeligheden af lokalt udskilte vækstfaktorer 18,19,20,21. Dyrkning af celler på native ECM kan således øge in vitro-systemers prædiktive kapacitet til at modellere in vivo-vævenes biologi. Decellularisering, en proces, der fjerner cellulært materiale fra væv via vaskemidler, enzymer eller fysiske eller andre metoder, kan i vid udstrækning bevare ECM-stilladset af et indfødt organ, når det udføres omhyggeligt 22,23. Sådanne stilladser kan genbefolkes med celler til 3D biomimetisk kultur. Men mens decellulariserede stilladser i vid udstrækning anvendes til vævstekniske applikationer, har deres anvendelse til rutinemæssig cellekultur været begrænset. Flere tidligere undersøgelser har rapporteret decellularisering og recellularisering af lungeskiver eller små lungevævssegmenter. Ud over proof-of-concept-undersøgelser er 24,25,26, genbefolkede lungeskiver blevet brugt til at studere fibroblast-matrixadhæsion 27,28 og til at undersøge effekten af syge lungematricer på fibroblastfænotype27,29. Med forbedrede teknologier til rådighed til generering af præcisionsskårne vævsskiver kunne decellulariserede lungeskiver tilbyde en bekvem og lille platform til dyrkning af celler, samtidig med at alveolære, luftvejs- og vaskulære understrukturer bevares. Inkorporering af flere celletyper ville muliggøre undersøgelser af celle-celle-interaktioner inden for et fysiologisk relevant 3D-miljø. Der er imidlertid behov for forbedrede strategier for at lette håndteringen af væv gennem hele dyrkningsprocessen og for at sikre kontrolleret og reproducerbar såning af væv med et kendt antal celler.
Her præsenterer vi en protokol til at generere manipuleret lungevæv (ELT'er) ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS) med primære endotelceller, AEC2'er og fibroblaster. I en tilpasning af vores tidligere beskrevne konstruerede hjertevævssystem30 og hele lungedecellulariseringsstrategier 22,31 beskriver vi procedurer til at skære PCLS fra rottelunger og klippe skiverne i genanvendelige vævskulturkassetter, der forenkler og standardiserer nedstrøms manipulationer. Klippede skiver decellulariseres til dannelse af acellulære ECM-stilladser, som genbefolkes i tilpassede frøbade. Lungeskivestilladser bevarer kritiske ECM-komponenter og arkitektur og understøtter væksten af AEC2'er inden for multi-lineage alveolære strukturer i mindst 7 dage. ELT'er repræsenterer et nyt alveolært cokultursystem inden for en fysiologisk relevant 3D-matrix, som skal understøtte udviklingen af lungevævstekniske strategier, samtidig med at de letter grundlæggende biologiske undersøgelser af AEC2'er og alveolus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Der er behov for forbedrede 3-dimensionelle (3D) lungemodeller, der rekapitulerer den arkitektoniske og cellulære kompleksitet af den indfødte lungealveolus ex vivo. Nyligt udviklede organoidmodeller har lettet udvidelsen og undersøgelsen af lungeepitel-forfædre in vitro, men disse platforme er typisk afhængige af musetumorafledt matrix og / eller serum og inkorporerer kun en eller to cellulære slægter. Her beskriver vi en protokol til generering af manipulerede lungevæv (ELT'er) baseret på multi-lineage recellularisering af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS). ELT'er indeholder alveolære strukturer bestående af alveolær epitel, mesenchym og endotel inden for et ekstracellulært matrix (ECM) substrat, der ligner meget for den indfødte lunge. For at generere vævene oppustes rottelunger med agarose, skæres i 450 μm tykke skiver, skæres i strimler og decellulariseres. De resulterende acellulære ECM-stilladser gensås derefter med primære endotelceller, fibroblaster og alveolære epitelceller type 2-celler (AEC2'er). AEC2'er kan opretholdes i ELT-kultur i mindst 7 dage med et serumfrit, kemisk defineret vækstmedium. Gennem vævsforberedelses- og dyrkningsprocessen klippes skiverne i et kassettesystem, der letter håndtering og standardiseret cellesåning af flere ELT'er parallelt. Disse ELT'er repræsenterer en organotypisk kulturplatform, der skal lette undersøgelser af celle-celle- og cellematrixinteraktioner inden for alveolus såvel som biokemiske signaler, der regulerer AEC2'er og deres niche.

En oversigt over processen til at generere ELT'er - bestående af lungeskæring, skiveklipning og decellularisering og stilladsrepopulation - er vist i figur 3. De ELT'er, der præsenteres her, blev dyrket ved hjælp af primære rottelungemikrovaskulære endotelceller (se materialetabel), neonatale rotte-AEC2'er og lipofibroblast-berigede neonatale rottelungefibroblaster36. AEC2'er blev frisk isoleret via magnetisk perlebaseret sortering som tidligere beskrevet37; alternative isolationsprotokoller er blevet detaljeret og diskuteret andetsteds 38,39,40. Renheden af isolerede rotte-AEC2'er kan vurderes via flowcytometri til rottespecifik AEC2-overflademarkør RTII-7041 eller via farvning af en cytocentrifuged celleprøve til RTII-70 eller pro-overfladeaktivt protein C (pSPC). Rottelungefibroblaster blev isoleret fra postnatal dag 7-9 rotteunger i henhold til en tilpasning af en offentliggjort protokol42 og anvendt ved passage 1-2; Alternative isolationsprotokoller er beskrevet andetsteds43,44. Renheden af isolerede fibroblaster kan vurderes via farvning af dyrkede eller cytocentrifuged celler til mesenkymal markør vimentin, og lipofibroblast berigelse kan vurderes via farvning for Oil Red O45.
Når lungevævet er ensartet oppustet med agarose, og vævsstykker strategisk udvalgt og orienteret til udskæring for at maksimere det samlede og parenkymale vævsområde, kan en rottelunge give væv til >100 alveolære ELT'er. Strimler af PCLS udviser tilstrækkelig mekanisk integritet til at blive klippet i vævskassetter med få (<5%) tilfælde af rivning (figur 3B).
Protokollen til decellularisering af lungeskiver er tæt baseret på vores tidligere offentliggjorte hele lungedecellulariseringsprotokol, som ved kvantitativ proteomics blev påvist at bevare mange ECM-komponenter på niveauer, der ikke adskiller sig væsentligt fra dem i native lung22. Decellulariserede skivestilladser bevarer alveolernes oprindelige arkitektur, set ved hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning (figur 4A,B) og ved fasekontrastmikroskopi (figur 4C). Vi udelukker typisk stilladser, der indeholder store luftveje eller skibe (figur 4D) eller tårer, selvom førstnævnte kan medtages, hvis de er af interesse for forskeren. Decellularisering fører til en reduktion på 96% i vævs-DNA-indhold målt ved et assay for dobbeltstrenget DNA (se Materialetabel; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg i henholdsvis native vs decellulariseret væv, middel ± SEM) (figur 5A), uden dna synligt ved hæmatoxylinfarvning (figur 4B). Histologisk og immunfluorescerende farvning af decellulariserede stilladser afslører vedligeholdelse af ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV og laminin med arkitektur og mængde svarende til den i indfødte lungeskiver (figur 5B-E). Bemærk, at kernerne i indfødte væv pletter blå / sort med trichome (til kollagen) og EVG (til elastin) pletter. Immunofluorescerende farvning blev udført som beskrevet tidligere ved anvendelse af standardmetoder til farvning af væv37. De anvendte antistoffer og deres respektive koncentrationer er anført i tabel 4.
Vellykket stilladsrepopulation fører til stærkt cellulære ELT'er efter 7 dage med et alveolært genpopulationsmønster synligt ved lysmikroskopi (figur 6A-C). I nogle tilfælde, med meget høj cellularitet, kan strukturer af organoid-typen være synlige (figur 6A, B). Mislykket vævssåning kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi under dyrkning (figur 6C). Efter dyrkning af vævsstilladser med AEC2'er, fibroblaster og endotelceller genbefolkes ELT'er tæt med alveolære strukturer, der omfatter alle tre cellelinjer (figur 6D, E). På dag 7 eller 8 opretholder AEC2'er kuboid morfologi og udtrykker overfladeaktivt protein-B (SPB) og lamellært kropsprotein ABCA3 uden tegn på signifikant differentiering til AEC1'er (figur 6E, F). AEC2'er er meget proliferative i ELT'er, som det fremgår af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering efter en 2 timers puls ved 10 μM (figur 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk perfusionssystem til lungeekstraktion og rydning. (A) Perfusionssystemet omfatter et tyngdekraftsdrevet lem, der anvendes til indledende kannulering af lungearterien under flow; og et pumpedrevet lem, der bruges til at rydde lungerne effektivt efter indledende kannulation. Pumpeledningen indeholder en "pulsdæmper", der dæmper trykspidserne forårsaget af pumpen. Designet af trakeal- og lungearteriekanyler er detaljeret til venstre. SNP = natrium nitroprussid. (B) Oplysninger om samling af pulsdæmpere. BPT og silikone henviser til typer slanger. (C) Positioner af trakeale og lungearterielle kanyler placeret under lungeekstraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figur 2: Kulturtidslinje for recellularisering af tri-afstamning. Foreslået tidsplan for elt-såning og dyrkning af tre-slægter, herunder tidspunkt for tofaset såning. Cellenumre for såning og dyrkningsmedium for hver fase er angivet. Se oplysninger om kulturmedier i tabel 3. AEC2 = alveolær epitel type 2 celle. EC = endotelcelle. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figur 3: Skematisk af manipuleret lungevævsforberedelse. (A) Indfødt lungevæv skæres i skiver ved hjælp af en vibratom. (B) Præcisionsskårne lungeskiver skæres i standardiserede 3 mm brede strimler, klippes i polytetrafluorethylen (PTFE) vævskulturkassetter og vaskemiddeldecellulariseres for at give acellulære ekstracellulære matrixstilladser. (C) Stilladser gensås i specialiserede såbade, der begrænser såområdet til vævets område og dyrkes derefter i en standard brøndplade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figur 4: Struktur af decellulariserede lungestilladser. H&E farvning af indfødte (A) og decellulariserede (B) lungeskiver, der viser bevarelse af alveolær arkitektur efter decellularisering. (C,D) Eksempler på decellulariserede ECM-stilladser set ved 5x forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi, der overvejende omfatter alveolær væv (C) eller indeholder store forgrenede luftveje og kar (D, sorte og røde pilespidser). Skalastænger, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figur 5: DNA-fjernelse og matrixbevarelse i decellulariserede lungestilladser. (A) Kvantificering af DNA i indfødte og decellulariserede lungeskiver (gennemsnitlig ± SEM, n = 5). Welch's t test, **P < 0,01. Decell = decellulariseret. (B,C) Histologisk farvning af indfødte og decellulariserede lungeskiver til kollagen (B) og elastin (C). Pilespidser, elastin bevaret i alveolære indgangsringe af decellulariseret væv. (D,E) Immunofluorescerende farvning af indfødte og decellulariserede lungeskiver til kollagen IV (D) og laminin (E). Vægtstænger, 50 μm. I alle paneler skitserer stiplede felter det billedområde, der forstørres til højre i hvert respektive panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figur 6: Cellulær repopulation af manipuleret lungevæv. (A-C) Eksempler på recellulariserede ELT'er på kulturdag 7, som visualiseret under dyrkning ved fasekontrastmikroskopi. Recellulariseringsmønsteret afspejler vævets alveolære struktur. I nogle områder med høj cellularitet kan der dannes organoidlignende strukturer (pilespidser). (A) og (B) repræsenterer vellykket cellerepopulation, mens (C) repræsenterer et dårligt niveau af recellularisering efter 7 dages kultur. (D-G) Farvning af recellulariserede ELT'er på dag 7 eller 8 af kulturen. (D) H&E-farvning, der viser cellulær repopulation af den alveolære septa. (E) Immunofluorescerende farvningsetiketter indpodet proCollagenIα1+ fibroblaster, ABCA3+ AEC2'er og CD31+ endotelceller. (F) Væv indeholder rigelige SPB + AEC2'er, men få RTI-40 (podoplanin)+ AEC1'er under disse betingelser. (G) Mange AEC2'er breder sig i ELT'er, målt ved EdU-inkorporering. Vægtstænger, 500 μm (AC); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Decellulariseringsløsninger. Forberedelse detaljer for decellularisering løsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Decellulariseringsprotokol. Detaljer om protokol til decellularisering af lungeskiver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Kulturmedier. Forberedelse detaljer for endotel og AEC2 vækstmedier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 4: Antistoffer anvendt til immunstaining. Detaljer om antistoffer og deres koncentrationer anvendt til immunostaining. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende fil 1: Design til laserskæring af vævskulturkassetterammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende sag 2: Design til laserskæring af vævskulturkassetteclips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende sag 3: Design til laserskæring af vævskulturkassettefaner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende sag 4: CAD-fil til såning af badformbase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende sag 5: CAD-fil til såning af badformring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Denne protokol beskriver en metode til at generere reproducerbare, småskala konstruerede lungevæv ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver med alveolære epiteltype 2-celler, fibroblaster og endotelceller.

Konstrueret lungevæv fremstillet af decellulariserede lungeskiver

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Denne protokol muliggør repeterbar brug af intakt lunge ekstracellulær matrix som et tredimensionelt vævskultursubstrat og moderat gennemstrømning. Den største fordel ved det konstruerede lungevævssystem er platformens fleksibilitet. ELT'er kan tilpasses til at bruge forskellige vævsstilladser, celler eller kulturmedier af interesse.Når lungerne er ekstraheret, skal du fylde en 10-milliliter sprøjte med agarose og HBSS uden phenolrød. Oppust lungerne med ca. 10 ml luft via luftrørskanylen, og injicer derefter straks den tilberedte agarose via luftrørskanylen, indtil de mest distale spidser af lungeloberne er oppustet. Cap luftrøret ved at fastgøre den hvide hætte fra en firevejs stophane til den kvindelige luerlås i trakealkanylen.Læg lungen i en 150 millimeter petriskål på is for at lade agarosen størkne. Forbered lungeskiverne i henhold til protokollen i manuskriptet, og fyld derefter en 100 millimeter petriskål med 1/3 volumen PBS. Overfør kassetter og faner til skålen ved hjælp af tang.Hvis skiverne er frosne, optø en skål ad gangen ved at hælde PBS ved stuetemperatur. Overfør derefter en optøet skive til en 150 millimeter petriskål. Fold forsigtigt skiven ud ved hjælp af fine pincet eller en hæmostat, og opsuge forsigtigt overskydende PBS fra omkring vævet.Skær derefter en tre millimeter bred, mindst ni millimeter lang strimmel fra skiven ved at trykke den fulde længde af et barberblad fast mod fadet og vippe det let fra side til side. For at klemme vævsstrimlen ind i kassetten skal du flyde den over kassetten og centrere den forsigtigt for at strække sig forbi hullerne i klemmerne i hver ende. Placer en fane delvist i hullet i den ene ende med fine tang, ret forsigtigt vævet og sæt den anden fane.Til sidst skal du bruge pincet til at trykke hver fane helt ind for at sikre vævet. Efter klipning af alle siderne skal du overføre 100 millimeter skålen indeholdende kassetterne til en laminær flowhætte. Overfør kassetter til seks-brøndplader indeholdende den første decellulariseringsopløsning ved hjælp af en buet hæmostat til at gribe fat i de hakkede sider.Placer derefter seks-brøndpladen på en orbitalryster ved 30 o / min i 10 minutter. Aspirer væsken fra hver brønd, og udskift den derefter med tre milliliter af den anden decellulariseringsopløsning pr. Brønd. Placer pladen på en orbitalryster ved 30 o / min og inkuber i fem minutter.Gentag denne proces med hver opløsning som beskrevet i decellulariseringsprotokollen i manuskriptet. Efter den sidste skylning med PBS overføres væv til sterile seks-brøndsplader indeholdende frisk PBS med antibiotika og antimykotika og inkuberes ved 37 grader Celsius i 48 timer. Efter sterilisering med antibiotika og antimykotika kan lungevævsstilladser straks sås eller opbevares ved fire grader Celsius i op til 30 dage.Før brug til dyrkning skal du inkubere stilladser, der er opbevaret ved fire grader Celsius, med frisk PBS og antibiotika og antimykotika natten over ved 37 grader Celsius som et ekstra steriliseringstrin. Skyl derefter stilladser med steril PBS, fem milliliter pr. Brønd, tre gange, i fem minutter hver. Undersøg stilladser under et fasekontrastmikroskop ved 5X forstørrelse for at vælge væv til såning.Forbered endotelcellesuspensionen i endotelmedium ved 5 millioner celler pr. Milliliter med tilstrækkelige celler til at frø 500.000 endotelceller pr. Skive. Placer autoklaverede frøbade i 100 millimeter petriskåle og overfør forsigtigt skyllestilladserne på hovedet i såbadene. Hvirvl forsigtigt den forberedte cellesuspension for at blande.Derefter pipetteres 100 mikroliter celler forsigtigt direkte oven på hvert væv i bunden af brøndene, og pas på ikke at beskadige vævet med pipettespidsen. Overfør de podede væv til cellekulturinkubatoren. 24 timer efter endotelcellesåning tilsættes 900 mikroliter forvarmet kulturmedium til hver brønd ved hjælp af en manuel pipette, og pladen returneres derefter til inkubatoren.Efter 24 timers cellesåning skal du fjerne mediet og udskifte det ene milliliter frisk endotelmedium pr. Brønd. 72 timer efter såning af endotelcellerne skal du tælle AEC2'er eller alveolære epiteltype II-celler og fibroblaster ved hjælp af et hæmocytometer og forberede en 1: 1 cellesuspension i AEC2-vækstmedium ved 5 millioner celler pr. Milliliter. Pipetter mediet fra hvert såbad godt og hvirvl forsigtigt den forberedte cellesuspension.Pipetter 100 mikroliter celler direkte oven på hvert væv i bunden af brønden. Overfør de podede væv til cellekulturinkubatoren. Efter to timer tilsættes 900 mikroliter af forvarmet AEC2 vækstmedium til hver brønd, og sæt derefter pladen tilbage til inkubatoren.Efter 24 timers dyrkning med AEC2'er og fibroblaster skal du forberede en 12-brøndplade med en milliliter forvarmet AEC2-vækstmedium pr. Brønd pr. Kassette. Pipetter 800 mikroliter medium fra hver brønd i frøbadet, fjern derefter kassetterne fra såbadet og overfør dem højre side op til den forberedte 12-brøndplade, en kassette pr. Brønd. Skift kulturmedium omhyggeligt ved hjælp af en glasPasteur-pipette hver anden dag i den ønskede kulturvarighed.Overvåg graden af vævsgenpopulation via fasekontrastmikroskopi ved 5X forstørrelse i hele dyrkningsvarigheden. H- og E-farvning af vævsstilladser viste bevaret alveolær arkitektur efter decellularisering uden synlige cellekerner. Alveolær væv blev observeret, når decellulariserede ekstracellulære matrixstilladser blev set ved 5X forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi.Store forgrenede luftveje og skibe var også synlige i nogle skiver. På kulturdag syv viste fasekontrastmikroskopi, at mønsteret af recellularisering i manipuleret lungevæv emulerede vævets alveolære struktur i tilfælde af vellykket repopulation. Dårlig recellularisering var også synlig.H- og E-farvning på dag syv eller otte viste genbefolkning af den alveolære septa. Immunofluorescens stående afslørede pro-kollagen type I alfa 1-positive fibroblaster, ABCA3-positive AEC2'er, CD31-positive endotelceller, og rigelige SPB-positive AEC2'er. Desuden viste thymidinassayet mange prolifererende AEC2'er.Denne teknik har lettet udviklingen af strategier for lungevævsteknik og har muliggjort undersøgelser af køer, der understøtter type II-celleproliferation og differentiering inden for alveolus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system til Studieinformationen Mechanotransduction i føtale lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombineret 3D manipuleret væv<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation af ESC-afledt Mouse Airway epitelceller Brug decellulariserede Lung Stilladser

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afledte humane manipuleret bindevæv til screeningsapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Præklinisk lægemiddeltest i skalerbart 3D-konstrueret muskelvæv

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissektion og isolering af regionsspecifikt decellulariseret lungevæv

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...