Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

De auteurs willen Lorenzo Sewanan en Jorge Nunez bedanken voor hun werk bij het ontwikkelen van het weefselkweekcassetteontwerp dat in dit protocol wordt gebruikt, het Kaminski-lab voor het gebruik van hun vibratome, Maurizio Chioccioli en Jessica Nouws voor hulp bij het snijden van longen, Allie LaRocco voor hulp bij de eerste pilootexperimenten en Hong Qian voor het zorgvuldig lezen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies F30HL143880 (K.L.L.), de Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) en U01HL145567 (L.E.N.); en door een onbeperkte onderzoeksgift van Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. is een oprichter en aandeelhouder van Humacyte, Inc, een bedrijf in regeneratieve geneeskunde. Humacyte produceert gemanipuleerde bloedvaten uit allogene gladde spiercellen voor vasculaire chirurgie. De echtgenoot van L.E.N. heeft aandelen in Humacyte en L.E.N. is lid van de Raad van Bestuur van Humacyte. L.E.N. is uitvinder van patenten die in licentie zijn gegeven aan Humacyte en die royalty's opleveren voor L.E.N. L.E.N. heeft een onbeperkte onderzoeksgift ontvangen om onderzoek in haar laboratorium aan Yale te ondersteunen. Humacyte heeft geen invloed gehad op het gedrag, de beschrijving of de interpretatie van de bevindingen in dit rapport.

Dit artikel beschrijft het gebruik van gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken als een platform om in vitro gemanipuleerde longweefsels te genereren, die alveolaire structuren met meerdere afstammingslijnen bevatten. Door strategieën te combineren die we eerder hebben ontwikkeld om high-fidelity acellulaire ECM-longsteigers voor hele longtechnologie22,31 opnieuw te bevolken met ons robuuste systeem voor het kweken van kleinschalige gemanipuleerde hartweefsels30, maakt dit protocol het gebruik van fysiologisch relevante long-ECM als weefselkweeksubstraat mogelijk, op een herhaalbare en matige doorvoer.
De hier gepresenteerde methoden beschrijven ELT-steigerpreparaat uit rattenlongen, die gemakkelijk haalbaar zijn, kunnen worden geëxtraheerd met directe toegang tot intacte luchtwegen voor agarose-inflatie en zijn van grotere omvang dan muizenlong. Elk longweefsel dat kan worden opgeblazen met agarose en plakjes van ten minste 9 mm lang, mag echter binnen dit systeem worden gebruikt. Ongeacht de weefselbron is uniforme inflatie van het longweefsel met agarose de meest kritieke stap om het succes van downstream weefselsnijden, knippen en weefselbehandeling te garanderen. Ondergepompt longweefsel heeft de neiging om niet schoon te snijden, terwijl overgepompt weefsel kan scheuren tijdens het knippen. Na agarose-gelatatie zijn op de juiste opgeblazen weefselgebieden stevig, maar geven ze een beetje wanneer ze zachtjes met een tang worden ingedrukt. Voor intacte rattenlongen ontdekten we dat het meerdere keren opblazen van de geëxtraheerde longen met lucht, gevolgd door agarose-inflatie zo snel mogelijk na extractie, resulteert in de beste snijresultaten en de beste kwaliteit van de resulterende weefselsteigers. Het juiste volume agarose moet empirisch worden geoptimaliseerd; voor een rattenlong is het volume dat nodig is om de long op te blazen tot de totale longcapaciteit ongeveer 30 ml/kg dierlijke massa (bijv. 10,5 ml agarose voor longen van een rat van 350 g). Voor grotere gereseceerde longweefsels met minder eenvoudige toegang tot de luchtwegen (zoals die van menselijke donoren), kan enige aanvullende probleemoplossing nodig zijn om het weefsel op te blazen via een bronchus32. Tijdens het daaropvolgende longsnijden is de selectie en oriëntatie van het weefsel op de zuiger een andere belangrijke stap om 1) ervoor te zorgen dat de plakjes groot genoeg zijn om weefselstroken te genereren die in weefselkweekcassettes kunnen worden geknipt en 2) parenchymaal (alveolair) weefselgebied te maximaliseren, met uitzondering van grote luchtwegen of bloedvaten.
Het knippen van de PCLS in weefselkweekcassettes kan in eerste instantie een uitdagende stap zijn, maar de cassettes vereenvoudigen de weefselverwerking tijdens decellularisatie en zaaien aanzienlijk. Twee mogelijke problemen die zich kunnen voordoen zijn weefselscheuren (tijdens het proces van knippen of tijdens decellularisatie), of weefselpositionering in de clips die resulteert in slecht stroomafwaarts zaaien (bijvoorbeeld geen zaaien of zaaien alleen aan de uiteinden). Scheuren kan het gevolg zijn van agarose overinflatie, overbelasting van het weefsel tijdens het inbrengen van tabs of het achterlaten van te weinig overhang om voldoende weefselgreep te bieden bij het inbrengen van de lipjes. Merk op dat plakjes die aan één clipuiteinde scheuren met succes kunnen worden gezaaid, maar ze zijn moeilijk te visualiseren onder de microscoop tijdens het kweken omdat het weefsel niet plat is. Slechte weefselzaaiing (zoals die in figuur 6C) is waarschijnlijk het gevolg van het feit dat het plakje niet plat tussen de twee clips ligt en dus slecht contact maakt met de basis van het zaaibad wanneer het ondersteboven wordt gekeerd. Een andere mogelijke oorzaak is het onjuist plaatsen van de cassette in de bodem van het zaaibadput. In termen van knippen, breng iets meer spanning in het weefsel aan bij het plaatsen van de tweede clip om het plat te laten liggen. Sommige plakjes hebben een lichte concaviteit; knip in deze gevallen het plakje met de bolle kant naar boven. Met oefening ervaren we meestal mislukt zaaien met minder dan 2% van de plakjes.
Een beperking van dit protocol is de vereiste voor sommige gespecialiseerde apparatuur - een lasersnijder en een 3D-printer - om de eerste materialen voor ELT-voorbereiding te genereren. Zodra de weefselkweekcassettes en zaaibaden zijn gemaakt, zijn er echter geen extra speciale materialen nodig. De longsnij- en decellularisatiestappen van ELT-steigervoorbereiding zijn matig tijdrovend; deze stappen kunnen echter van tevoren worden uitgevoerd, of in aantallen die voldoende zijn om zich voor te bereiden op meerdere experimenten tegelijkertijd. Veel PCLS (>100 als optimaliseren voor parenchymale regio's) kunnen uit een enkele long worden gesneden en worden ingevroren voor later gebruik. Hoewel een enkele vries-dooicyclus kleine ultrastructurele schade aan de ECU46 kan veroorzaken, is aangetoond dat zelfs meerdere vries-dooicycli geen significant verlies in ECU23,47 veroorzaken. PCLS kan ook worden geknipt en gedecellulariseerd voorafgaand aan een experiment, om binnen een maand te worden gebruikt. (Met name kan het beschreven decellularisatieprotocol in ongeveer 6 uur worden bereikt, wat een aanzienlijk voordeel vertegenwoordigt ten opzichte van eerder beschreven methoden die een dag of meervereisen 27,28.) Zodra de steigers zijn voorbereid, is het celzaaiproces eenvoudig en snel en vereist de cultuur van ELTs geen gespecialiseerde technieken.
Een voorbehoud bij de beschreven ELT-methode is het ontbreken van regiospecifieke zaaiing, d.w.z. de levering van AEC2's specifiek aan de alveolaire ruimte, of endotheelcellen specifiek aan de vasculaire ruimte. Niettemin, hoewel cellen eenvoudig bovenop de weefselsteigers worden gezaaid, is het patroon van recellularisatie niet-willekeurig, met enige schijn van alveolaire organisatie, inclusief epitheliale ringen. We vermoeden dat cel-celinteracties, evenals lokale verschillen in ECM-samenstelling en geometrie20,21, waarschijnlijk bijdragen aan de waargenomen recellularisatiepatronen. Ter ondersteuning van deze hypothese toonde een eerder gepubliceerde studie, waarin fibroblasten niet-specifiek op gedecellulariseerde longplakken werden gezaaid, aan dat het patroon van weefselherbevolking en geassocieerde cellulaire fenotypen significant varieerde per microscopisch weefselgebied en ECM-steigerbron (bijv. Gezond versus ziek)27. Fibroblasten werden ook waargenomen om binnen te dringen in het interstitium - de locatie waar ze zich in het inheemse longweefsel bevinden 1,27. De primaire alternatieve methode die we ons kunnen voorstellen om cellen op longplakken op een echt regiospecifieke manier te kweken, zou inhouden dat intacte gedecellulariseerde longen via de luchtwegen31,48 en vasculaire compartimenten 49,50 wordengezaaid en vervolgens het gerecellulariseerde weefsel wordt gesneden. Dit alternatief 1) is echter aanzienlijk kosten-, tijd- en middelenintensiever; 2) is lagere doorvoer; 3) vereist een groter aantal dieren; en 4) wordt geassocieerd met een verhoogd risico op besmetting als gevolg van de uitdagingen van de hele longkweek en het daaropvolgende snijden van de gezaaide long. Hoewel het ELT-platform niet alle aspecten van native cellulaire organisatie samenvat, maakt het longcelkweek mogelijk op een fysiologisch relevant ECM-substraat, op een manier die toegankelijk is voor veel meer laboratoria.
De flexibiliteit van het ELT-systeem is een groot voordeel van dit platform en zou kleinschalige longweefselkweek met een willekeurig aantal weefselsteigers, cellen of kweekmedia van belang moeten maken. Het gebruik van steigers afgeleid van ziek weefsel of van verwondingsmodellen kan de studie van cel-cel- of cel-matrixinteracties in de setting van ziekteveranderde ECM 27,29,51 mogelijk maken. Houd er echter rekening mee dat het decellularisatieprotocol mogelijk moet worden aangepast om rekening te houden met matrixverschillen tussen soorten52. De beschreven zaaistrategie kan voor elk celtype worden gebruikt en de kweektijdlijn kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Als uitgangspunt geldt dat 1 x 106 cellen per steiger binnen 7 dagen na kweek een zeer cellulair weefsel moeten opleveren, terwijl 1 x 105 totale cellen resulteren in een slechte cellulariteit. Bij elke aanpassing van de tijdlijn moeten de weefselkweekcassettes 24 uur na het laatste zaaien uit het zaaibad worden verwijderd. Hier, met het doel om een deel van de cellulaire complexiteit van de longalveolus te modelleren, beschrijven we een tri-cultuur recellularisatiestrategie die het onderhoud van goed gedifferentieerde neonatale AEC2's in alveolaire structuren gedurende ten minste 7 dagen ondersteunt. Onze resultaten tonen ook de succesvolle engraftment van zowel fibroblasten als endotheelcellen binnen ELTs, waarbij de brede toepasbaarheid van het kweeksubstraat en de geschiktheid ervan voor co-kweekstudies wordt benadrukt. Het zaaien van volwassen cellen in ELTs kan de modellering van meer rustige alveolaire structuren vergemakkelijken, terwijl het zaaien van van menselijke PSC afgeleide AEC2's, inclusief die met genetische modificaties, translationele studies van menselijke ziekten zou kunnen vergemakkelijken13,53. Over het algemeen biedt de bottom-upbenadering die mogelijk wordt gemaakt door het ELT-platform de mogelijkheid om de bijdragen van bepaalde celtypen aan uitlezingen van belang te onderzoeken - zoals AEC2-proliferatie of differentiatietoestand.
Samenvattend schetst dit protocol een robuust systeem voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels voor co-kweekstudies van AEC2's, fibroblasten en endotheelcellen in acellulaire ECM-longschijfsteigers. ELTs vertegenwoordigen een nieuwe 3D-cultuurstrategie voor primaire AEC2's, die tot nu toe meestal hebben vertrouwd op minder fysiologische gel-type matrices om een goed gedifferentieerd fenotype 6,11,12 te behouden. Het huidige platform bouwt voort op eerder werk in de herbevolking van gedecellulariseerde longplakken 24,25,26,27,28,29, maar biedt verschillende voordelen: 1) een weefselkweekcassettesysteem om ELT-behandeling tijdens decellularisatie, zaaien en kweken te vergemakkelijken; 2) een aangepast zaaibad om nauwkeurig een bekend aantal cellen op elke plaksteiger te zaaien; en 3) een tri-kweek herzaaistrategie die alveolaire weefselherbevolking met epitheliale, mesenchymale en endotheelcellen mogelijk maakt. ELTs vertegenwoordigen dus een belangrijke stap voorwaarts in de richting van het creëren van reproduceerbare in vitro modellen die de cellulaire en substraatcomplexiteit van de inheemse alveolus en de AEC2-stamcelniche vastleggen.

Longblaasjes zijn de functionele eenheden van de distale long, bestaande uit een maaswerk van gasuitwisselingsruimten omzoomd door alveolaire epitheliale type 1-cellen (AEC1s) en type 2-cellen (AEC2s). Onderliggend aan het epitheel ligt een dicht netwerk van haarvaten en ondersteunend mesenchym, allemaal ondersteund door een extracellulaire matrix (ECM) steiger die zowel sterkte als flexibiliteit biedt aan deze delicate luchtzakken1. De longblaasjes zijn ook de plaats van letsel in tal van longpathologieën, waaronder idiopathische longfibrose2, acute respiratory distress syndrome3 en ernstige coronavirusziekte-19 (COVID-19)4. Hoewel het werk in het afgelopen decennium een opmerkelijke plasticiteit in het longepitheel heeft blootgelegd, blijven de mechanismen die distale longreparatie in sommige omgevingen mogelijk maken - en die reparatie in andere uitsluiten - een gebied van intensief onderzoek5. De ontwikkeling van verbeterde in vitro platforms om de alveolus te modelleren zou studies van alveolaire biologie, regeneratie en therapeutica vergemakkelijken.
AEC2's vernieuwen zichzelf en differentiëren in AEC1's en worden dus beschouwd als de primaire stamcel van de distale long 6,7,8. Deze cellen vormen echter een bijzondere uitdaging voor in vitro studie gezien de moeilijkheden die gepaard gaan met het kweken van primaire AEC2's zonder verlies van fenotype9. In conventionele 2-dimensionale (2D) cultuur vlakken AEC2's af en nemen ze enkele kenmerken van AEC1-achtige cellen10 aan. Daarentegen ondersteunen 3D-kweekstrategieën, meestal organoïden, het behoud van gedifferentieerde kenmerken in primaire AEC2s 6,11,12 en maken langdurige kweek van pluripotente stamcel (PSC) -afgeleide AEC2s13,14 mogelijk. Organoïden zijn gebruikt om distale longontwikkeling15, virale infectie11,15 en AEC2-gerelateerde genetische ziekte 13,16,17 te modelleren, waardoor belangrijke inzichten in AEC2-biologie en regeneratie mogelijk worden. Deze kweekmodellen bestaan echter meestal uit slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen en integreren de cellen in gel-type matrices die de architectuur of het ECM-substraat van de inheemse longalveolus niet kunnen samenvatten.
De ECM is een kritische regulator van celfenotype en gedrag via moleculaire, topologische en mechanische signalen; omvat een belangrijk onderdeel van weefselspecifieke niches die het lot van stamcellen reguleren; en dient als een reservoir dat de beschikbaarheid van lokaal uitgescheiden groeifactorenmoduleert 18,19,20,21. Het kweken van cellen op inheemse ECM kan dus het voorspellend vermogen van in vitro systemen vergroten om de biologie van in vivo weefsels te modelleren. Decellularisatie, een proces dat cellulair materiaal uit weefsels verwijdert via detergentia, enzymen of fysieke of andere methoden, kan de ECM-steigers van een inheems orgaan grotendeels behouden, wanneer zorgvuldig uitgevoerd22,23. Dergelijke steigers kunnen opnieuw worden bevolkt met cellen voor 3D-biomimetische cultuur. Hoewel gedecelluliseerde steigers veel worden gebruikt voor weefselmanipulatietoepassingen, is het gebruik ervan voor routinematige celkweek beperkt. Verschillende eerdere studies hebben de decellularisatie en recellularisatie van longplakken of kleine longweefselsegmenten gemeld. Naast proof-of-concept studies 24,25,26, zijn herbevolkte longplakken gebruikt om fibroblast-matrix adhesie 27,28 te bestuderen en om het effect van zieke longmatrices op fibroblastfenotype27,29 te onderzoeken. Met verbeterde technologieën die beschikbaar zijn voor het genereren van nauwkeurig gesneden weefselplakken, kunnen gedecellulariseerde longplakken een handig en kleinschalig platform bieden om cellen te kweken, met behoud van alveolaire, luchtweg- en vasculaire substructuren. Het opnemen van meerdere celtypen zou studies van cel-celinteracties binnen een fysiologisch relevante 3D-omgeving mogelijk maken. Er zijn echter verbeterde strategieën nodig om de behandeling van weefsels tijdens het kweekproces te vergemakkelijken en om te zorgen voor gecontroleerde en reproduceerbare zaaiing van weefsels met bekende aantallen cellen.
Hier presenteren we een protocol om gemanipuleerde longweefsels (ELTs) te genereren door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken (PCLS) opnieuw te bevolken met primaire endotheelcellen, AEC2's en fibroblasten. In een aanpassing van ons eerder beschreven gemanipuleerde hartweefselsysteem30 en hele longdecellularisatie-recellularisatiestrategieën 22,31, beschrijven we procedures om PCLS uit rattenlongen te snijden en de plakjes in herbruikbare weefselkweekcassettes te knippen die downstream-manipulaties vereenvoudigen en standaardiseren. Geknipte plakjes worden gedecellulariseerd om acellulaire ECM-steigers te vormen, die opnieuw worden bevolkt in aangepaste zaaibaden. Long slice scaffolds behouden kritische ECM-componenten en architectuur en ondersteunen de groei van AEC2's binnen multi-lineage alveolaire-achtige structuren gedurende ten minste 7 dagen. ELTs vertegenwoordigen een nieuw alveolair co-kweeksysteem binnen een fysiologisch relevante 3D-matrix, die de ontwikkeling van longweefseltechnologiestrategieën moet ondersteunen en tegelijkertijd fundamentele biologische studies van AEC2s en de alveolus moet vergemakkelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Er is behoefte aan verbeterde 3-dimensionale (3D) longmodellen die de architecturale en cellulaire complexiteit van de inheemse longalveolus ex vivo samenvatten. Recent ontwikkelde organoïde modellen hebben de uitbreiding en studie van longepitheelvoorlopers in vitro vergemakkelijkt, maar deze platforms vertrouwen meestal op van muizentumor afgeleide matrix en / of serum en bevatten slechts één of twee cellulaire afstammingslijnen. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van gemanipuleerde longweefsels (ELTs) op basis van de multi-lineage recellularisatie van gedecellulariseerde precisie-gesneden longplakken (PCLS). ELTs bevatten alveolaire structuren bestaande uit alveolair epitheel, mesenchym en endotheel, binnen een extracellulair matrix (ECM) substraat dat sterk lijkt op dat van de inheemse long. Om de weefsels te genereren, worden rattenlongen opgeblazen met agarose, gesneden in 450 μm dikke plakken, in stroken gesneden en gedecellulariseerd. De resulterende acellulaire ECM-steigers worden vervolgens opnieuw ingezaaid met primaire endotheelcellen, fibroblasten en alveolaire epitheliale type 2-cellen (AEC2s). AEC2s kunnen gedurende ten minste 7 dagen in ELT-cultuur worden gehouden met een serumvrij, chemisch gedefinieerd groeimedium. Tijdens het weefselvoorbereidings- en kweekproces worden de plakjes in een cassettesysteem geknipt dat de verwerking en gestandaardiseerde celzaaiing van meerdere ELT's parallel vergemakkelijkt. Deze ELTs vertegenwoordigen een organotypisch kweekplatform dat onderzoek naar cel-cel- en cel-matrixinteracties binnen de alveolus moet vergemakkelijken, evenals biochemische signalen die AEC2's en hun niche reguleren.

Een overzicht van het proces om ELT's te genereren - bestaande uit longslicing, slice clipping en decellularization, en scaffold repopulatie - is weergegeven in figuur 3. De HIER GEPRESENTEERDE ELTs werden gekweekt met behulp van primaire microvasculaire endotheelcellen van rattenlongen (zie Materiaaltabel), neonatale ratten-AEC2's en lipofibroblast-verrijkte neonatale rattenlongfibroblasten36. AEC2's werden vers geïsoleerd via magnetische op kralen gebaseerde sortering zoals eerder beschreven37; alternatieve isolatieprotocollen zijn gedetailleerd en elders besproken 38,39,40. De zuiverheid van geïsoleerde AEC2's bij ratten kan worden beoordeeld via flowcytometrie voor ratspecifieke AEC2-oppervlaktemarker RTII-7041, of via kleuring van een cytocentrifugeerd celmonster voor RTII-70 of pro-oppervlakteactieve eiwit C (pSPC). Rattenlongfibroblasten werden geïsoleerd van postnatale dag 7-9 rattenpups volgens een aanpassing van een gepubliceerd protocol42 en gebruikt bij passage 1-2; alternatieve isolatieprotocollen zijn elders beschreven 43,44. De zuiverheid van geïsoleerde fibroblasten kan worden beoordeeld via kleuring van gekweekte of cytocentrifuged cellen voor mesenchymale marker vimentine, en lipofibroblastverrijking kan worden beoordeeld via kleuring voor Oil Red O45.
Wanneer het longweefsel gelijkmatig wordt opgeblazen met agarose en weefselstukken strategisch zijn geselecteerd en georiënteerd voor het snijden om het totale en parenchymale weefseloppervlak te maximaliseren, kan één rattenlong weefsel opleveren voor >100 alveolaire ELTs. Stroken PCLS vertonen voldoende mechanische integriteit om in weefselcassettes te worden geknipt met weinig (<5%) gevallen van scheuren (figuur 3B).
Het protocol voor het decellulariseren van longplakken is nauw gebaseerd op ons eerder gepubliceerde hele longdecellularisatieprotocol, waarvan door kwantitatieve proteomics werd aangetoond dat het veel ECM-componenten behoudt op niveaus die niet significant verschillen van die in de inheemse long22. Gedecellulariseerde plaksteigers behouden de inheemse architectuur van de longblaasjes, zoals gezien door hematoxyline en eosine (H &E) kleuring (figuur 4A, B) en door fasecontrastmicroscopie (figuur 4C). We sluiten meestal steigers uit met grote luchtwegen of bloedvaten (figuur 4D) of scheuren, hoewel de eerste kunnen worden opgenomen als ze van belang zijn voor de onderzoeker. Decellularisatie leidt tot een vermindering van het WEEFSEL-DNA-gehalte met 96%, gemeten door een test voor dubbelstrengs DNA (zie Materiaaltabel; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg in respectievelijk inheems versus gedecellulariseerd weefsel, gemiddelde ± SEM) (Figuur 5A), zonder DNA zichtbaar door hematoxylinekleuring (figuur 4B). Histologische en immunofluorescente kleuring van gedecellulariseerde steigers onthult onderhoud van ECM-eiwitten collageen, elastine, collageen IV en laminine met architectuur en hoeveelheid vergelijkbaar met die in inheemse longplakken (figuur 5B-E). Merk op dat de kernen van inheemse weefsels blauw / zwart kleuren met trichoom (voor collageen) en EVG (voor elastine) vlekken. Immunofluorescente kleuring werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met behulp van standaardmethoden voor het kleuren van weefsels37. De gebruikte antilichamen en hun respectieve concentraties zijn vermeld in tabel 4.
Succesvolle herbevolking van steigers leidt na 7 dagen tot zeer cellulaire ELT's, met een alveolair-achtig herbevolkingspatroon zichtbaar door lichtmicroscopie (figuur 6A-C). In sommige gevallen, met een zeer hoge cellulariteit, kunnen organoïde-type structuren zichtbaar zijn (figuur 6A,B). Mislukte weefselzaaiing kan worden gevisualiseerd door fasecontrastmicroscopie tijdens het kweken (figuur 6C). Na het kweken van weefselsteigers met AEC2's, fibroblasten en endotheelcellen, worden ELTs dicht herbevolkt met alveolaire structuren die alle drie de cellijnlijnen omvatten (figuur 6D, E). Op dag 7 of 8 behouden AEC2's een kubusvormige morfologie en drukken ze oppervlakteactieve eiwitten-B (SPB) en lamellair lichaamseiwit ABCA3 uit, zonder bewijs van significante differentiatie naar AEC1's (figuur 6E, F). AEC2's zijn zeer proliferatief in ELTs, zoals aangetoond door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) incorporatie na een puls van 2 uur bij 10 μM (figuur 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van het perfusiesysteem voor longextractie en -clearing. (A) Het perfusiesysteem bestaat uit een door de zwaartekracht aangedreven ledemaat, gebruikt voor de initiële cannulatie van de longslagader onder stroming; en een pompaangedreven ledemaat, gebruikt om de longen efficiënt te reinigen na de eerste cannulatie. De pompleiding bevat een "pulsdemper" die de pieken in druk veroorzaakt door de pomp dempt. Het ontwerp van de tracheale en pulmonale arteriële canules is links gedetailleerd. SNP = natrium nitroprusside. (B) Details van de assemblage van de pulsdemper. BPT en siliconen verwijzen naar soorten slangen. (C) Posities van tracheale en pulmonale arteriële canules geplaatst tijdens longextractie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figuur 2: Cultuurtijdlijn voor tri-lineage recellularisatie. Voorgestelde tijdlijn voor tri-lineage ELT-zaaien en -cultuur, inclusief timing van tweefasig zaaien. Celnummers voor het zaaien en kweekmedium voor elke fase worden aangegeven. Zie de details van de cultuurmedia in tabel 3. AEC2 = alveolaire epitheliale type 2 cel. EC = endotheelcel. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figuur 3: Schematische samenstelling van de voorbereiding van het longweefsel. (A) Inheems longweefsel wordt in plakjes gesneden met behulp van een vibratoom. (B) Nauwkeurig gesneden longplakken worden gesneden in gestandaardiseerde stroken van 3 mm breed, geknipt in polytetrafluorethyleen (PTFE) weefselkweekcassettes en detergent-gedecellulariseerd om acellulaire extracellulaire matrixsteigers te verkrijgen. (C) Steigers worden opnieuw ingezaaid in gespecialiseerde zaaibaden die het zaaigebied beperken tot het gebied van het weefsel en vervolgens gekweekt in een standaard putplaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figuur 4: Structuur van gedecelluliseerde longsteigers. H&E-kleuring van inheemse (A) en gedecellulariseerde (B) longplakken met behoud van alveolaire architectuur na decellularisatie. (C,D) Voorbeelden van gedecelluliseerde ECM-steigers bekeken bij 5x vergroting door fasecontrastmicroscopie, voornamelijk bestaande uit alveolair weefsel (C) of met grote vertakkende luchtwegen en bloedvaten (D, zwarte en rode pijlpunten). Schaalstaven, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figuur 5: DNA-verwijdering en matrixconservering in gedecellulariseerde longsteigers. (A) Kwantificering van DNA in inheemse en gedecellulariseerde longplakken (gemiddelde ± SEM, n = 5). Welch's t test, **P < 0,01. Decell = gedecellulariseerd. (B,C) Histologische kleuring van inheemse en gedecellulariseerde longplakken voor collageen (B) en elastine (C). Pijlpunten, elastine bewaard in alveolaire ingangsringen van gedecelluliseerd weefsel. (D,E) Immunofluorescente kleuring van inheemse en gedecellulariseerde longplakken voor collageen IV (D) en laminine (E). Schaalbalken, 50 μm. In alle deelvensters schetsen gestippelde vakken het afbeeldingsgebied dat in elk deelvenster rechts wordt vergroot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figuur 6: Cellulaire herbevolking van gemanipuleerde longweefsels. (A-C) Voorbeelden van gerecellulariseerde ELT's op dag 7 van de kweek, zoals gevisualiseerd tijdens kweek door fasecontrastmicroscopie. Het recellularisatiepatroon weerspiegelt de alveolaire structuur van het weefsel. In sommige gebieden met een hoge cellulariteit kunnen organoïde-achtige structuren zich vormen (pijlpunten). (A) en (B) vertegenwoordigen succesvolle celherbevolking, terwijl (C) een slecht niveau van recellularisatie vertegenwoordigt na 7 dagen cultuur. (D-G) Kleuring van gerecelluliseerde ELT's op dag 7 of 8 van de cultuur. (D) H&E-kleuring die cellulaire herbevolking van de alveolaire septa laat zien. (E) Immunofluorescente kleuringsetiketten getransplanteerde proCollagenIα1+ fibroblasten, ABCA3+ AEC2's en CD31+ endotheelcellen. (F) Weefsels bevatten overvloedige SPB+ AEC2's, maar weinig RTI-40 (podoplanine)+ AEC1's onder deze omstandigheden. (G) Veel AEC2's vermenigvuldigen zich in ELTs, zoals gemeten door EdU-integratie. Schaalstaven, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Decellularisatie oplossingen. Voorbereidingsdetails voor decellularisatieoplossingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Decellularisatieprotocol. Details van het protocol voor het decellulariseren van longplakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Cultuurmedia. Voorbereidingsdetails voor endotheel- en AEC2-groeimedia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Antilichamen die worden gebruikt voor immunostaining. Details van antilichamen en hun concentraties die worden gebruikt voor immunostaining. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 1: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassetteframes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 2: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassetteclips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 3: Ontwerp voor het lasersnijden van weefselkweekcassettetabs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 4: CAD-bestand voor het zaaien van badschimmelbasis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 5: CAD-bestand voor het zaaien van badvormring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Dit protocol beschrijft een methode om reproduceerbare, kleinschalige gemanipuleerde longweefsels te genereren, door gedecellulariseerde precisiegesneden longplakken opnieuw te bevolken met alveolaire epitheliale type 2-cellen, fibroblasten en endotheelcellen.

Gemanipuleerde longweefsels bereid uit gedecellulariseerde longplakken

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Dit protocol maakt het herhaalbare gebruik van intacte long extracellulaire matrix mogelijk als een driedimensionaal weefselkweeksubstraat en matige doorvoer. Het belangrijkste voordeel van het gemanipuleerde longweefselsysteem is de flexibiliteit van het platform. ELTs kunnen worden aangepast om verschillende weefselsteigers, cellen of kweekmedia van belang te gebruiken.Zodra de longen zijn geëxtraheerd, vult u een spuit van 10 milliliter met agarose en HBSS zonder fenolrood. Blaas de longen op met ongeveer 10 milliliter lucht via de luchtpijpcanule en injecteer vervolgens onmiddellijk de bereide agarose via de luchtpijpcanule totdat de meest distale uiteinden van de longlobben zijn opgeblazen. Sluit de luchtpijp af door de witte dop van een vierwegstophaan aan het vrouwelijke luerslot van de tracheale canule te bevestigen.Plaats de long in een petrischaaltje van 150 millimeter op ijs om de agarose te laten stollen. Bereid de longplakken volgens het protocol in het manuscript en vul vervolgens een petrischaaltje van 100 millimeter met 1/3 volume PBS. Breng cassettes en lipjes over naar de schotel met behulp van een tang.Als de plakjes bevroren zijn, ontdooi dan één gerecht per keer door PBS op kamertemperatuur te gieten. Breng vervolgens een ontdooide plak over op een petrischaaltje van 150 millimeter. Vouw het plakje voorzichtig open met behulp van een fijne tang of een hemostat en zuig voorzichtig overtollige PBS op van rond het weefsel.Snijd vervolgens een drie millimeter brede, minstens negen millimeter lange strook uit de plak door de volledige lengte van een scheermesje stevig tegen de schaal te drukken en het lichtjes van links naar rechts te wiegen. Als u de tissuestrip in de cassette wilt knippen, zweeft u deze boven de cassette en centreert u deze voorzichtig om langs de gaten in de clips aan beide uiteinden te lopen. Plaats een lipje gedeeltelijk in het gat aan het ene uiteinde met een fijne tang, maak het weefsel voorzichtig recht en zet het tweede lipje.Gebruik ten slotte een tang om elk lipje volledig in te drukken om het weefsel vast te zetten. Breng na het knippen van alle zijkanten de schotel van 100 millimeter met de cassettes over op een laminaire stromingskap. Breng cassettes over op zes-well platen met de eerste decellularisatie-oplossing met behulp van een gebogen hemostat om de gekerfde zijden vast te pakken.Plaats vervolgens de zes-well plaat op een orbitale shaker op 30 RPM gedurende 10 minuten. Zuig de vloeistof uit elke put en vervang deze vervolgens door drie milliliter van de tweede decellularisatieoplossing per put. Plaats de plaat op een orbitale shaker met 30 RPM en incubeer gedurende vijf minuten.Herhaal dit proces met elke oplossing zoals beschreven in het decellularisatieprotocol in het manuscript. Breng na de laatste spoeling met PBS weefsels over naar steriele zesputtenplaten met verse PBS met antibiotica en antimycotica en incubeer gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius. Na sterilisatie met antibiotica en antimycotica kunnen longweefselsteigers onmiddellijk worden gezaaid of tot 30 dagen bij vier graden Celsius worden bewaard.Voordat u het voor cultuur gebruikt, incubeert u steigers die zijn opgeslagen bij vier graden Celsius met verse PBS en antibiotica en antimycotica 's nachts bij 37 graden Celsius als een extra sterilisatiestap. Spoel vervolgens steigers met steriele PBS, vijf milliliter per put, drie keer, gedurende vijf minuten elk. Onderzoek steigers onder een fasecontrastmicroscoop bij 5X-vergroting om weefsels te selecteren voor zaaien.Bereid de endotheelcelsuspensie in endotheelmedium voor met 5 miljoen cellen per milliliter met voldoende cellen om 500.000 endotheelcellen per plak te zaaien. Plaats geautoclaveerde zaaibaden in petrischalen van 100 millimeter en breng de spoelsteigers voorzichtig ondersteboven over in de zaaibaden. Draai voorzichtig de bereide celsuspensie om te mengen.Pipetteer vervolgens voorzichtig 100 microliter cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van de putten, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel niet wordt beschadigd met de pipetpunt. Breng de gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator. Voeg 24 uur na het zaaien van endotheelcellen 900 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put met behulp van een handmatige pipet en breng de plaat vervolgens terug naar de incubator.Verwijder na 24 uur celzaaien het medium en vervang de ene milliliter vers endotheelmedium per put. 72 uur na het zaaien van de endotheelcellen, tel AEC2s, of alveolaire epitheliale type II-cellen, en fibroblasten met behulp van een hemocytometer en bereid een 1: 1-celsuspensie in AEC2-groeimedium met 5 miljoen cellen per milliliter. Pipetteer het medium uit elk zaaibad goed en draai voorzichtig de voorbereide celsuspensie.Pipetteer 100 microliter cellen direct bovenop elk weefsel aan de basis van de put. Breng de gezaaide weefsels over naar de celkweekincubator. Voeg na twee uur 900 microliter voorverwarmd AEC2-groeimedium toe aan elke put en breng de plaat terug naar de incubator.Bereid na 24 uur kweken met AEC2's en fibroblasten een 12-wellsplaat met één milliliter voorverwarmd AEC2-groeimedium per putje, per cassette. Pipetteer 800 microliter medium uit elke put van het zaaibad, verwijder vervolgens de cassettes uit het zaaibad en breng ze aan de rechterkant over op de voorbereide 12-well plaat, één cassette per put. Verander het kweekmedium zorgvuldig met behulp van een glazen Pasteur pipet om de andere dag voor de gewenste kweekduur.Controleer de mate van weefselherbevolking via fasecontrastmicroscopie bij 5X-vergroting gedurende de hele kweekduur. H- en E-kleuring van weefselsteigers toonde een bewaarde alveolaire architectuur na decellularisatie zonder zichtbare celkernen. Alveolair weefsel werd waargenomen wanneer gedecelluliseerde extracellulaire matrixsteigers werden bekeken bij 5X vergroting door fasecontrastmicroscopie.In sommige plakjes waren ook grote vertakkende luchtwegen en vaten zichtbaar. Op dag zeven van de kweek toonde fasecontrastmicroscopie aan dat het patroon van recellularisatie in gemanipuleerde longweefsels de alveolaire structuur van weefsels emuleerde in gevallen van succesvolle herbevolking. Slechte recellularisatie was ook zichtbaar.H- en E-kleuring op dag zeven of acht toonde herbevolking van de alveolaire septa. Immunofluorescentiestand onthulde pro-collageen type I alfa 1-positieve fibroblasten, ABCA3-positieve AEC2's, CD31-positieve endotheelcellen, ans overvloedige SPB-positieve AEC2's. Bovendien toonde de thymidinetest veel prolifererende AEC2's.Deze techniek heeft de ontwikkeling van strategieën voor longweefseltechnologie vergemakkelijkt en heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar wachtrijen die type II-celproliferatie en differentiatie binnen de alveolus ondersteunen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Procedure voor Lung Techniek

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Een experimenteel systeem om Mechanotransductie in foetale long cellen te bestuderen

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-cardiale side-afvuren licht katheter voor het monitoren van cellulaire metabolisme met behulp van Transmural extinctie spectroscopie van Geperfectiongebruikt zoogdieren harten

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Voorbereiding van mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels afgeleid van menselijke iPS cellen voor In Vivo Myocardial Repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...